生物化学实验报告
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学号：
专业年级：
组别：
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量
实验日期实验地点
合作者指导老师
评分教师签名批改日期
一、实验目的
1.1.学习醋酸纤维薄膜电泳的基本原理和操作方法；
1.2.了解电泳技术的一般原理；
1.3.掌握电泳分离血清蛋白质及其定性定量的方法。
二、实验原理
2.1.血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。
2.2.血清中不同蛋白质的等电点、分子量及含量
血清蛋白质等电点分子量占总蛋白的％
清蛋白 4.64 69,000 57～72
α1－球蛋白 5.06 200,000 2～5
α2－球蛋白 5.06 300,000 4～9
β－球蛋白 5.12 90,000～150,000 6.5～12
γ－球蛋白 6.85～7.3 156,000～950,000 12～20
缓冲液pH=8.6，pI＜pH。
血清蛋白带负电荷，在电场中向正极移动。
预测血清蛋白电泳区带图
血清蛋白依次分为清蛋白，球蛋白的α1、α2、β、γ五个区带
2.3.①膜条经过氨基黑10B染色后显出清晰色带；②各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比；③可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中；④用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。
三、材料与方法：
3.1.实验材料：
3.1.1.实验试剂：①样品：健康人血清（新鲜、无溶血）；②巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH8.6，离子强度0.06mol/L）；③氨基黑10B染色液；④漂洗液；⑤洗脱液：0.4mol/NaOH溶液。
3.1.2.实验器材：①V-1100分光光度计（×1）；②恒温水浴箱（×1）；③试管（×6）、试管架（×1）；④1000μL加样枪（×1）、加样枪架（×1）；⑤醋酸纤维薄膜（2cm*8cm，厚度120μm）；⑥培养皿（×5）；⑦点样器或载玻片（×1）；⑧平头镊子（×2）；⑨剪刀（×1）；⑩电泳槽（×1）；⑪直流稳压电泳仪（×1）
3.2.实验步骤
1．准备与点样：①取2×8cm的膜条；②亚光面距一端1.5cm处取一点样线；③充分浸透在巴比妥缓冲液中；④取出膜条，用滤纸吸去多余的缓冲液；⑤点样器下端粘上薄层血清；⑥垂直点样。
点样示意图：
注意：点样线尽量点得细窄而均匀。
样品标记
2.电泳：①放置膜条（点样面向下，点样端置于阴极）；②膜条贴紧滤纸，拉直膜条；③平衡五分钟；④通电（调节电压120v/电流，时间：45~60 min）；③关闭电源。
电泳槽解剖图：
3.染色、漂洗：①通电完毕；②取出膜条；③浸于染色液（氨基黑10B）中，5min；
④取出膜条，浸于漂洗液；⑤反复漂洗2次，直至漂净；⑥滤纸吸干薄膜。
4.定量（洗脱比色法）（因实验室等原因，未做）
8cm
m
2cm
点样线
点样区
1.5cm
(粗面）
小组标记
—
+
四、结果与讨论：
图一染色后的膜条
4.1.结果分析
本次实验得到的图谱只能够清晰的看出清蛋白和γ－球蛋白的区带，其余无法区别。原因可能如下：
①醋酸纤维薄膜质量不足
②薄膜过湿，样品扩散迅速，导致样品分离不成区带。
③点样太少，区带显色不明显。
④电泳时间不足。
⑤薄膜在缓冲液中浸泡的时间不足。
⑤取出电泳后的薄膜过程中曾不慎将薄膜掉到地上。
⑥染色时，因为现场混乱，可能导致醋酸纤维薄膜不是一张一张放入染色液的，在染色固定前，薄膜与薄膜之间重叠，造成薄膜上还未固定的血清蛋白彼此粘连。
4.2.课后思考题
1.电泳时，点样端置于电场的正极还是负极？为什么？
答：点样端置于电场的负极。因为人体血清的蛋白质会因电槽中溶质呈碱性而带负电，要成功分离出各类各类蛋白质，理应将点样端置于电场的负极。
2.电泳后各区带应明显分开,如分离不清或不整齐,试分析其可能存在的原因。
答：①醋酸纤维薄膜质量不足；②薄膜过湿，样品扩散迅速，导致样品分离不成区带；
③点样太少，区带显色不明显；④染色时，醋酸纤维薄膜不是一张一张放入染色液的，在染色固定前，薄膜与薄膜之间重叠，造成薄膜上还未固定的血清蛋白彼此粘连。⑤电泳时电压，电流或电泳过小或时间不够，造成区带未分离。
