第三章植物细胞培养
植物细胞培养：指对从植物器官或由愈伤组织上分离的单细胞（或小细胞团）进行培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。Haberlandt（1902）首次尝试分离和培养植物叶片单细胞。
细胞培养的意义
有利于进行细胞生理代谢以及各种不同物质对细胞代谢影响的研究。
进行细胞培养，通过单细胞的克隆化，即称为“细胞株”（cell line），可以把微生物遗传技术用于高等植物以进行农作物的改良。
细胞培养的增殖速度快，适合大规模悬浮培养，生产一些特有的产物，如许多种植物的次生代谢产物，包括各种药材的有效成分等，用于医药业、酶工业及天然色素工业，这是植物产品工业化生产的新途径。
由于植物组织培养中细胞之间在遗传和生理生化上会出现种种变异，这些细胞形成的植株也都表现出一定的差异。这种差异反映在它们的植株的形态、产量、品质、抗病虫和抗逆性等方面。所以由单细胞培养获得的单细胞无性繁殖系，并对不同的细胞进行研究，在理论上和实践上都有很重要的意义。
细胞培养就是从高等植物的某个特定的器官或组织中取得单个细胞进行培养，并诱导其分裂增殖，由细胞分裂形成细胞团，再通过细胞分化形成芽根等器官或胚状体，长成完整植株。
第一节植物细胞培养
一. 单细胞培养
(一)单细胞分离
1.机械法
2.酶解法
3.从愈伤组织中分离
(二)单细胞的培养方法
1、平板培养（细胞的生长周期）
2、看护培养
3、微室培养 4. 条件化培养
二. 细胞悬浮培养
（一）悬浮培养的方法
1、分批培养（细胞的生长周期）
2、半连续培养
3、连续培养——封闭型、开放型（化学、浊度恒定式）
4、固定化培养
（二）培养细胞的同步化
1. 化学方法(饥饿法、抑制法、有丝分裂抑制法）
2. 物理方法（分选、低温）
（三）培养基振荡
一、单细胞培养
（一）单细胞的分离
1.机械法: Ball(1965)首次由花生成熟叶片利用机械的方法使叶肉细胞得到分离的技术。
⑴刀片刮: 取下叶片→叶片消毒(75%酒精或7%次氯酸钠)→撕去下表皮(露出叶肉细胞) →用解剖刀刮下细胞→单细胞悬浮培养
⑵研磨离心法: 取下叶片→叶片消毒(75%酒精或7%次氯酸钠) →研磨匀浆(10g叶片+40ml研磨介质)→匀浆过滤(细纱布) →离心(先低速去碎屑) →游离细胞沉降到底部(净化细胞) →植株培养或悬浮培养
研磨介质: 20μmol蔗糖+ 10μmol MgCl2 + 20μmol Tris-HCl (pH7.8)
机械法的特点：⑴细胞不受酶的伤害；⑵不发生质壁分离。
（缺点）（3）材料要求是薄壁细胞、组织排列松散。（4）产量低
2. 酶解法
利用果胶酶使细胞间的中胶层发生降解，分离出具有代谢活性的细胞的技术。
Takebe等(1968) 以烟草叶片为材料：
过程：叶片消毒→撕去下表皮→切成小方块(约4cm)→加酶液(2g叶片+20ml无菌酶液)→真空抽气→25℃振荡酶解2h (每30min换酶液1次,共4次)→①弃掉、②海绵簿壁细胞、③、④叶肉栅栏细胞
酶液组成：含0.5%果胶酶，0.8%甘露醇和1%硫酸葡聚糖钾（是原生质膜的稳定剂，以降低酶液中核糖核酸酶活力，保持质膜稳定性，提高游离细胞产量）
酶解法的特点：能得到比较均匀一致的海绵组织细胞或栅栏组织细胞。但在使用该法分离细胞时，必须对酶溶液给予渗透压保护，防止细胞的胀裂。
3.由培养的愈伤组织中分离单细胞
首先通过固体培养诱导外植体脱分化,把未分化和疏散的愈伤组织转移到装有液体培养基的三角瓶内，将这些悬浮培养物在摇床上进行振荡培养，并得到游离细胞。
振荡的作用：
（1）对细胞团施加一定的缓和压力，使之破碎成小细胞团或单细胞。
（2）振荡可使细胞或细胞团在培养基中均匀分布。
（3）促进培养基和容器内气体交换，保证细胞正常的呼吸代谢。
(二)单细胞的培养方法
1.平板培养法（plate cultivation method）
是将悬浮培养的细胞接种到薄层培养基上进行培养的过程，是常用的单细胞培养法。
单细胞的获得：先将含有游离细胞和细胞团的悬浮培养物过滤除去较大的细胞团，留下游离的单细胞和小细胞团，从而得到单细胞无性系。
细胞记数：过滤的悬浮培养材料先进行细胞计数，使悬浮培养液达到要求的细胞培养密度。烟草细胞培养的最适密度0.5-1.0×104/ml。
细胞培养：将0.6%～1%琼脂的培养基灭菌后，冷却到35℃，在恒温水浴中，将细胞悬浮液接种进去，充分混合后倒入培养皿中。当培养基凝固后，细胞均匀分布并固定在约1mm厚的培养基中,在25℃暗条件下培养，20d后再计数每只培养皿中出现细胞团的数目，并计算植板率。
每个平板上形成的细胞团数
植板率= x100%
每个平板上接种的细胞总数
过程：
单细胞的获得（过滤悬浮培养物）→细胞计数（血球计数板）
→调节密度（最终植板密度的2倍）
相同成分培养基（0.6～1%琼脂）制备（冷却至35℃）→等量混合→铺平皿（均匀分布在1mm厚，封口膜封口）→标记单细胞（为获得纯的无性系）→25 ℃暗培养20d →计数细胞团，计算植板率
应注意问题：
1）选择合适的培养基，以降低细胞起始密度；
2）选用分裂旺盛时间的细胞（此时分裂能力强，不用久处于静止期的细胞）
3）培养基的温度要严格控制（35 ℃，过低，操作困难，凝固快而使细胞分布不均匀；过高，对细胞产生伤害）
2. 看护培养法（nurse cultivation method）
用同种或异种材料的愈伤组织作为看护组织来培养细胞的一种方法。
Muir等（1954）设计：把单细胞放在一块活跃生长的愈伤组织上进行培养，在愈伤组织和培养的细胞之间有一片滤纸相隔。
特点：看护愈伤组织可给单细胞的生长与分裂提供培养基的营养成分，而且活跃生长的愈伤组织所分泌的代谢产物，为单细胞的分裂提供一些活性物质。
直接接种在培养基上不能分裂的离体单个细胞，在看护愈伤组织的影响下就可能发生分裂。
3.微室培养(Microchamber culture)
将单个细胞放到人工制造的一个小室中进行培养的一种方法。
此方法的优点：在培养过程中可以连续进行显微观察，把一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程记录。
4.条件培养基培养法（conditioned medium culture method）
在培养基中加入高密度的细胞进行培养，经过一定时间后, 这些细胞向培养基中分泌一些促进细胞生长的活性物质，使培养基条件化。使原来在合成培养基上不能分裂的细胞发生分裂。
二、细胞的悬浮培养
悬浮培养(suspension culture): 指将游离的植物单细胞或小细胞团,按一定的细胞密度,在受到不断搅动或摇动的液体培养基中进行培养的一种方式。
是在单细胞培养的基础上，得到优良的、遗传基础稳定的单细胞无性系扩大培养。
20世纪50年代以来,从试管的悬浮培养发展到大容量的发酵罐培养。从不连续培养发展到半连续和连续培养。
80年代以来，植物细胞培养作为生物技术的一个组成部分，正在发展成为一门新兴的科技产业体系。
悬浮培养特点：
1）细胞可不断增殖，且细胞增殖的速度比愈伤组织快，可形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；
2）能提供大量比较均匀一致的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。
悬浮培养一般采用愈伤组织作为起始细胞来源：
用于建立悬浮体系的愈伤组织至少应该具备的条件：
1、要有较好的松散性，使之在悬浮培养的起始阶段容易打散；
2、要具备较强的增殖和再生能力；
3、组成愈伤组织的细胞要有较高的均匀一致性。
为了获得符合条件的良好愈伤组织:
1、必须选择适宜的外植体材料。研究表明，胚、胚轴、子叶是最常用的外植体，特别是幼胚。
2、培养基的附加成分对疏散型愈伤组织的诱导具有较大的影响，其中生长素的浓度最为重要。
