分子生物学实验

１．ＤＮＡ模板：反应中ＤＮＡ量在５０ng～２００ ng左右。且ＤＮＡ纯度较高， 以增加反应特异性。 ２．dNTP:反应体系中达100μM～200μM。 ３．Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基浓度在2.0mM左右，浓 度太低Taq酶活力降低；太高反应特异性降低。 ４．引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约 20碱基左右；Ｇ＋Ｃ含量在40 ％－70％之间；引物内 部不能有回该序列；引物３’端不能互补。 ５．Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性ＤＮＡ聚 合酶，在９５℃时３０分钟还有５０％活力。
分子生物学实验
中南民族大学生命科学学院 实验教学中心 2006年3月
实验一 实验二
植物基因组DNA的提取 植物基因组DNA的提取 DNA
多聚酶链式反应( 多聚酶链式反应( polymerase chain reaction, PCR) 基因扩增及琼脂糖凝胶 电泳检测 植物总RNA RNA的提取 实验三 植物总RNA的提取 实验四 蛋白质印迹
ＰＣＲ技术实际上是在模板ＤＮＡ， 引物和４ 种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶 的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于引物 和模板ＤＮＡ结合的特异性。 反应分三步： ①变性（denaturation）； ②退火（annealing）； ③延伸（ex tension），反应过程见下图。
二、PCR反应及步骤
实验一 一. 实验目的及背景
植物基因组DNA的提取 植物基因组DNA的提取 DNA
高等动物，高等植物的基因组相当宠大， 如人类细胞基因组由30亿个 碱基对组成，果蝇基因组有１．４×１０８个碱基对，水稻基因组有 １．４×１０９个碱基对。真核细胞基因组中，约１万－１．５万个可 表达的结构基因，其它大量存在的是调控序列和内含子序列。可以说某 特定物种的基因组，包含了该物种生长，发育，繁殖等各项生理活动的 几乎全部信息量，因而对真核细胞基因组的结构，组成，以及表达调控 的研究是至关重要的，而研究的起点就是要获得纯度高－不含蛋白质、 糖类、酚、氯仿等污染；得率好－以便有足够量用于分析；基因组相对 完整－－断裂的基因组以便用于以后ＰＣＲ分析，RFLP分析，基因文库 的构建，基因探测等的研究。
三、仪器、药品与试剂配方 仪器、 (一) 仪器 1． 低温离心机 2． 分光光度计 3． 琼脂糖胶电泳系统，用前先用1% Na OH溶液浸泡过夜， 之 后再用DEPC水浸泡冲洗。 4． 高压灭菌锅 5． 研钵、剪刀、一次性手套等
实验四 蛋白质印迹技术 （Western blotting）
一、目的和内容 目的：掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，掌握蛋白质印迹技 术的基本原理和方法。 内容：本实验采用鸡卵清白蛋白为材料，对此蛋白质进行SDS— PAGE电泳后，用电转移法将蛋白质转移到硝酸纤维素薄 膜上，将预先制备好的鸡蛋清免疫而成的抗血清，作为 初级抗体，用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔为第二抗体， 在底物存在下，通过显色电泳条带，测定蛋白质性质。
１．向无菌的500µl Eppendorf管中依次加入以下溶液： 反应物 体积 10×buffer 2.5µl 4×dNTP(1mM) 2.5µl MgCl2 (25mM) 2.5µl 无菌水 10.5µl Taq酶 (1U/ul) 1µl 引物 2µl 模板ＤＮＡ (20ng) 4µl 总体积 25µl
1. 焦碳酸二乙酯(DEPC) 2. 吗啉代丙烷磺酸(MOPS) 3. 异硫氰酸胍 4. 醋酸钠(NaAc) 5. 氯仿 6. 苯酚 7. 甲醛 8. 乙醇 9. 乙二胺四乙酸(EDTA) 10. 琼脂糖 11. 异丙醇
(三) 试剂配方 1. 0.1% DEPC水 0.1ml DEPC 加入100 ml三蒸水中，振摇过夜， 再湿热灭菌。 2. 2 mol/L NaAc、0.5 mol/L EDTA、4 mol/L异硫 氰酸胍、4mol/L LiCl等均用DEPC水配制。 3. 5ΧMOPS 电泳缓冲液(pH 7.0) MOPS 0.1 mol/L NaAc 40 mmol/L EDTA 5 mmol/L
2. DNA质量检测 琼脂糖电泳检测， 质量检测
1 2 3 4 5 HindIII
总DNA
六、 注意事项 （1）叶片磨得越细越好。 （2）移液器的使用。 （3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶， 因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活 性外，第一步的操作应迅速，以免组织解 冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA 降解。
二、主要仪器、材料和试剂 1、仪器和材料 蛋白质电泳槽，蛋白质电转移槽一套（六一仪器 厂），硝酸纤维素滤膜（黄岩化工厂），直径为 20cm 及10cm 玻璃平皿各一个，剪刀、镊子、刀 片、一次性手套，普通滤纸，鸡卵清白蛋白，鸡 卵清免疫兔的抗血清，辣根过氧化酶-羊抗兔抗体 （1：500 稀释），四氯奈酚或者二氨基联苯胺， 过氧化氢。
真核细胞基因组在提取过程中一般有以 下几步，首先是机械法破细胞抽提；然后 去除蛋白质，糖类等细胞内杂质污染；最 后纯化出ＤＮＡ，由于真核细胞基因组较 大，在操作中应注意动作轻柔，且在低温 下进行，以最大限度地减少机械和化学作 用对ＤＮＡ的剪切，从而获得相对完整的 ＤＮＡ。
十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵 (hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、 十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS) 等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使 核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚 和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分 相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从 抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加 入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得 植物总DNA溶液。
七、问 题
1. 本实验中所用到的各试剂的作用是什么? CTAB, 氯仿, 异丙醇, 75%乙醇, EDTA 2．提取基因组DNA的方法有哪些？各有何优缺点？
实验二 PCR实验技术
一．实验目的及背景
多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称ＰＣＲ技术， 是８０年代中期发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。 此法操作简便， 可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的 ＤＮＡ序列的拷贝，ＰＣＲ技术虽然问世仅数年时间， 但它已迅 速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革 命，目前它在分子克隆， 目的基础检测，遗传病的基因诊断，法 医学，考古学等方面得到了广泛的应用。
（8）10 000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜， 转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动 30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物； （9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿 将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上； （10）60 sec后，直立离心管，加入720 µ µl的75%乙醇及 80 µl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使 沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；
三、实验材料 实验材料
水稻幼叶
四、主要试剂配方 2% CTAB抽提缓冲溶液:CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5MEDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再 定容至200ml灭菌, 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇 （400ul）氯仿-异 戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊 醇，摇匀即可。
2．反应体系混匀，离心
3．在ＰＣＲ仪上按以下方式循环 94℃变性 １分钟 36℃退火 １分钟 72℃延伸 ２分钟 经过40个循环 40 4．72℃延伸反应7分钟。 5．取20µl反应液加4µl Loading buffer在 6. 1.5％琼脂糖凝胶上120伏，电泳2小时。 7. 在凝胶成像系统上观察记录实验结
2、试剂 （1）TBS 要Tris-HCl NaCl 缓冲液：20mml/L Tris-HCl， 500mmol/LNaCl，PH：7.5。 （2）TBS 要Tris-HCl NaCl，Tween-20 缓冲液：20mmol/L TrisHCl，500mmol/L NaCl，0.05% Tween-20，PH：7.5。 （3）抗体溶液：牛血清白蛋白质-TBS 溶液，1%BSA-TBS。 （4）Blocking 溶液（封闭液）：10%牛血清-TBS。 （5）底物溶液（0.5mg/mL）：25mg 四氯奈酚，加5mL 甲醇溶解 后，加10ml 在30℃水浴中温浴的TBS 溶液，混合后再加 50mlTBS，然后再加入10μl 30%过氧化氢立即使用。 （6）转移缓冲液：25mmol/L Tris，192 mmol/L Glycine 20%MethnolL，pH8.3. （7）去离子双蒸水。
（11）放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶 解； （12）10000 rpm离心1 min后，倒掉液体， 再加入800 µl 75%的乙醇，将DNA再 洗 30 min； （13）10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液 体，将离心管倒立于铺开的纸巾上； 数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自 然风干或用风筒吹干）； （14）加入50 µl 0.5 × TE(含RNase)缓冲 液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约 15 h，使RNA消解； （15）置于-20℃保存、备用。
三、PCR电泳检测
１．记录实验结果，并估测ＰＣＲ扩增 产物分子量。 四、问题与讨论： １．简述ＰＣＲ基本原理 ２．进行一次成功的ＰＣＲ反应顺注意 哪些问题。
实验三 RNA提取
一、实验目的 通过本实验学习从植物组织中提取RNA的方法。 二、实验原理 RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最 大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对 RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质 ，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所 以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了 RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机 溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。
６．变性温度：在９３～９５℃之间使模板充分变性。 ７．复性温度：５５℃左右，此温度选择是根据模板 和引物配对结合强弱而定， 它是反应特异性的决 定因素。 ８．延伸温度：７０～７２℃左右，为Taq酶最适反应 温度。
Biblioteka Baidu
１０×buffer: 500mM KCl 100mM Tris-HCl (pH9.0) 0.1% 明胶 1% TritonX-100 MgCl2 2.5mM ４×dNTP: 1mM 引物：TGGCCGAGCTG 5.0uM 模板： 20ng/µl Taq酶： 5u/µl PCR仪，凝胶成像系统，电泳系统
模板ＤＮＡ在９４℃条件下变性形成单链； 在５５℃ 条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分别与其同 源序列结合；７０℃下在耐热性ＤＮＡ聚合酶Taq 酶 催化下， 在４种dNTP存在条件下延伸形成双链。完成 一次循环。 接着又以新合成的ＤＮＡ为模板进行同样 反应，如次往复循环３０次，由于每次循环目标ＤＮ Ａ都以２n次幂扩增，３０次循环后目的DNA的量增加 １０ ６－７ 倍。成功的ＰＣＲ反应要求反应有很好的特 异性，和相当的扩增效率。 要达此目的ＰＣＲ反应要 注意以下问题：
五、实验步骤
DNA的提取 1. DNA的提取
（1） 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。 （2）取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状； （3） 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动； （4） 将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌离心管中，磨碎液 的高度约占管的三分之二； （5）置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇 动，40 min后取出； （6）冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管， 剧烈振荡2~3 min，使两者混合均匀； （7）放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时， 将600 µl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；