实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）
一目的要求
1．了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。
2．初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。
3．观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征，学会初步鉴别微生物的种类的方法。
二实验内容与原理
1．简单染色法原理
简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。
由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
简单染色过程：涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检
涂片→固定→干燥→水洗、吸干→镜检→染色 1mim
2．革兰氏染色法原理
革兰氏染色法是由丹麦医生 Hans Christian Gram于 1884 年创立。它是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G + ）和革兰氏阴性菌（G －）两大类。
革兰氏染色过程：涂片→固定→结晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脱色（95% 酒精,30s）→番红复染（30 秒）→干燥→镜检
阳性菌：紫色阴性菌：红色
革兰氏染色要点：
（1）初染：用结晶紫，染色 1 分钟，水洗。
（2）媒染：加碘液覆盖 1 分钟后水洗。
（3）脱色：连续滴加 95％乙醇，约 30 秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。
（4）复染：加番红染色 1 分钟，水洗。
（5）干燥。
（6）镜检：先低倍镜，后油镜观察。
注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。
学生做大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌的革兰氏染色。观察细菌个体形态与排列，绘图。
3．芽孢染色原理
细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。
操作方法：
（1）用枯草杆菌涂片、干燥、固定。
（2）在涂菌处滴加 5％的孔雀绿染液，用木夹夹住玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但不沸腾 5－6 分钟。加热时应添加染料，以免蒸干。水洗。
（3）0.5％番红复染 1 分钟，水洗，烘干，镜检（芽孢绿色，菌体红色）。
4．荚膜染色原理
荚膜与染料亲和力低。在用简单染色法时，可以辨认出来。而通过荚膜染色也可以把它和细胞区别开来。
操作方法：
（1）涂片，晾干。
（2）用 Tyier 氏醋酸结晶紫溶液染色 2 分钟，再用 20%硫酸铜溶液洗涤，水洗，用滤纸吸干、干燥。
（3）镜检：荚膜染成浅红色，细胞呈紫红色。
5．鞭毛染色法原理
细菌鞭毛直径为 10-12nm，超过了光学显微镜的分辨能力。所以染色时，不仅要使鞭毛染色，还要使一部分染料堆积在鞭毛上，加粗鞭毛的直径以便能观察。鞭毛染色的方法很多，但染色成功的关键一是必须使用新鲜培养、活动活泼的菌体进行染色；二是使用绝对无油的干净玻片，以便菌液流过玻片时能保持自然形态。细菌的运动性，可通过悬滴法制片观察。注意区分布朗运动
和细菌本身的运动。
操作方法：
（1）载片的制备：经过严格清洗后，置于95%乙醇中浸泡，用时才取出，用火焰烧去酒精，立即使用。
（2）菌种的制备：取已活化 3-5 代的变形杆菌（或枯草杆菌）接种于新制备的肉汤琼脂斜面，斜面下部最好有冷凝水，培养 8-9h 即可使用。
（3）制片：在载玻片的一端滴一滴蒸馏水，挑取少许菌苔底部有水部分的菌体，将接种环悬放在水滴中片刻，再将载片稍倾斜，使菌液随水滴缓慢流到另一端，放平，晾干。
（4）染色：滴加鞭毛染色液 A，3-5分钟，小心水洗干净，然后滴加鞭毛染色液B，30-60 秒，水洗，晾干。
（5）镜检：菌体、鞭毛均为褐色。
悬滴法：
（1）在盖玻片上滴小半滴无菌水。
（2）以无菌操作挑菌，接种环在水上轻点几下。
（3）将盖玻片迅速翻转置于凹玻片上即可观察。
6．菌落特征的观察
注意细菌落形状、大小、颜色、光泽、透明度、干燥或湿润、粘稠度、隆起情况、边缘状况等等。
三实验材料
1．显微镜 1 台，载玻片数片，盖玻片数片。
2．枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。
3．香柏油、二甲苯、察镜纸等。
四实验报告
1．绘出枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的个体形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。五思考题
1.革兰氏染色法涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当，为什么？
