院(系、部) 化学与生物工程学院专业生物技术（师范）年级13级学号姓名组别第二组课程名称植物细胞工程学实验日期指导老师实验名称植物组织培养综合实验
一、实验目的
1.熟悉MS培养基的组成，掌握贮备液的配制方法
2.学习、掌握植物组织固体培养基的配制和灭菌方法；
3.掌握超净工作台上的接种方法与注意事项，了解接种室的灭菌方法；
4.了解组织培养的基本程序；
5.掌握接种的方法和材料的培养过程；
6.掌握无菌操作技术，包括外植体除菌和接种技术；
7.观察外植体的生长状况、染菌状况，剔除染菌外植体；
8.了解MS培养基和1/2MS培养基的区别
二、实验原理
1.植物细胞的全能性
一切植物都由细胞构成，细胞是构成植物体的基本结构与功能单位。
植物细胞含有全套遗传信息，具有形成完整植物的潜能。
2.植物细胞表现出全能性的条件
1.离体状态；
2.有一定的营养物质，激素和其他外界条件（无菌、温度、pH）；
3.选择性能优良、细胞全能性表达充分的基因型
3.无菌条件
把植物的组织、器官等，使其在人工控制的无菌条件下，使植物在人工培养基上繁殖。用于进行组织培养的组织、器官和细胞称为外植体。在组培中外植体都死带菌的，在接种前必须进行表面消毒，这时取得培养成功的最基本和重要的前体。组织培养的主要过程都是在无菌条件下进行的，所以所有的器材、植物体、接种室都应是无菌的。
4.脱分化与愈伤组织
已有特定结构与功能的植物组织，在一定条件下，其细胞被诱导改变原来的发育途径，逐步逆转其原有的分化形态，转变为具有分生能力的胚细胞的过程称为脱分化。脱分化所用的化学物质与MS培养基的区别是需要激素诱导。所以脱分化培养需在MS培养基上添加激素进行愈伤组织诱导。
5.培养基
植物组织培养常用的培养基为MS培养基。常用的凝固剂是琼脂,它的主要作用是使液体培养基凝固，琼脂本身并不提供任何营养，它只是一种高分予的碳水物从海藻中提取出来，仅溶解于热水，成为溶胶，冷却后(40℃以下)即凝固为固体状凝胶。琼脂的用量一般在4—10克／升之间。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式等有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解而丧失凝固能力，存放时间过久，琼脂变褐，也会逐失去凝固能力。MS培养基属于富盐平衡培养基，特点是：无机盐浓度较高，元素间的比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性，因而在培养的过程中可维持较好的稳定性；营养丰富，在
一般培养中无须额外加入复杂的有机成分；微量元素种类全，浓度高。这类培养基是目前使用最广泛的培养基。
6.生长调节物质
包括天然植物激素额人工激素类似物。植物激素是一类植物自身合成、同时对其生长发育具有重要调节作用的有机化合物。生长调节物质对于离题培养中的细胞分裂分化、器官形成和个体再生等均起着重要而明显的调节作用。一般来说，基本培养基只能保证培养物的生存，维持其最低的生理活动，而只有植物激素的配合使用，才能完成离体培养物中按照需要设计的各个调节环节。常用的植物组培激素种类主要有生长素类、细胞分裂素类、赤霉素。
1)生长素的生理作用主要是促进细胞分裂和生长，有利于外植体脱
分化并启动细胞分裂，有利于形成愈伤组织。同时生长素和细胞
分裂素的协调作用，对于培养物的形态建立十分必要。在离体培
养的分化调节中，生长素促进不定根的形成而抑制不定芽的发生。
在液体培养中，生长素还有利于体细胞胚胎发生。常用的生长素
有吲哚乙酸（IAA）、奈乙酸（NAA）、二氯苯氧乙酸（2，4-D）和
吲哚丁酸（IBA）等。在使用2，4-D时，必须严格控制使用浓度
和培养时期，因为高浓度的2，4-D常常抑制器官的发生，在分化
培养时不能使用2，4-D代替其他生长素。
2)细胞分裂素的主要作用是促进细胞的分裂，调节器官分化，延迟
组织衰老，增强蛋白质合成等。此外，它还能显着改善其他激素。
离体培养中，细胞分裂素能够促进不定芽的发生，与生长素协调
使用能有效调控培养物的生长与分化。常用的细胞分裂素包括6-
卞基嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、异戊烯氨基嘌呤（2ip）、玉米
素（ZT）等。
3)赤霉素（GA）是一类广泛存在于植物体内的激素，目前已发现的
天然赤霉素有20多种。自然界植物体内的赤霉素具有促进细胞伸
长生长、诱导花芽形成、打破种子休眠及诱导单性结实等生理功
能。在离体培养条件下，赤霉素的主要作用时促进细胞伸长生长，
与生长素协同作用对形成层的分化具有一定影响，同时还能刺激
体细胞胚进一步发育成植株。
三、实验材料、试剂和仪器设备
1.植物材料：马齿苋、番茄种子诱导的无菌苗、外植体（盘龙参、波斯
菊、金叶女贞、黄花苜蓿、菊花、香樟、杜鹃、月季）
2.实验药品（试剂）：甲醛、MS培养基母液（见表1）、蔗糖、琼脂、1%
升汞、酒精（75%和90%）、NaOH、HCl、6-BA、NNA、无菌水；
3.仪器设备和实验用具：高压灭菌锅、天平、pH计、超净工作台、电炉、
酒精灯、镊子、解剖刀、剪刀、烧杯、培养瓶、量筒、烧杯、玻璃棒、广口试剂瓶、牛皮纸、滤纸、培养皿、药勺、支架、打火机等。
四、实验步骤
(一)培养基母液的配制(2016/3/4)
1.MS培养基贮备液配制
表1
1)每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻
底溶解，然后再将它们混溶，定容。
2)贮备液III需加热溶解。混合后调至，定容，保存在棕色玻
璃瓶内。
3)6-BA：1 mg/mL(溶于少量1N盐酸后以蒸馏水定容）。
NAA：1 mg/mL（先用少量95%乙醇溶解后以蒸馏水定容）。
4)各种母液配制完成后，分别用玻璃瓶贮存，贴上标签，注明
母液号、配制倍数、日期等，放入冰箱冷藏室保存。一般无机物质的母液在冰箱中可保存半年以上，有机物质的母液保
