丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA 微板法)
简介：
动物或植物细胞发生氧化应激(oxidative stress)时，会发生脂质氧化。丙二醛(Malondialdehyde, MDA)是一种生物体脂质氧化的天然产物，一些脂肪酸氧化后逐渐分解为一系列包括MDA 在内的复杂化合物，此时通过检测MDA 的水平即可检测脂质氧化的水平，因此MDA 的测定被广泛用作脂质氧化的指标。
丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA 微板法，MDA Assay Kit)又称脂质氧化(MDA)检测试剂盒，是采用一种基于MDA 和硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)反应产生红色产物的显色反应，特别适用于微量样本的检测。丙二醛在较高温度及酸性环境中可与TBA 发生反应，形成红色的MDA-TBA 加合物，MDA-TBA 加合物在535nm 处有最大吸收，据此可以通过比色法进行检测。本试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 样本处理：
①血清、血浆、尿液、脑脊液样本：从待测样本中分理出的血清或血浆不应有溶血，直接检测，如超过线性范围，用生理盐水稀释后检测。
②组织、细胞等样本：组织或细胞可以使用PBS 或Leagene Western 及IP 细胞裂解液等进行匀浆或裂解。匀浆或裂解组织时，组织重量占匀浆液或裂解液的比例应为10%；对于细胞，每106个细胞使用0.1ml 裂解液或匀浆液。匀浆或裂解后，取上清用于后续测定。匀浆或裂解等样品制备步骤宜在冰浴或4℃进行操作。样品准备完毕后可以用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内的MDA 含量。
编号 名称
TO1011 100T Storage
试剂(A): TBA 40mg RT 避光 试剂(C): 抗氧化剂
300μl RT 避光 试剂(D): MDA 标准品(1mmol/L) 200μl -20℃ 避光 试剂(E): MDA 检测液 100ml
RT 避光 使用说明书
1份
本试剂盒对于样品中的常见化学成分的兼容性参考下表：
试剂类别化学成分是否干扰
缓冲液
HEPES (100mM) 否Borate (50mM) 否Phosphate (100mM) 否Tris (25mM) 否
去垢剂
CHAPS (≤1%) 否Triton X-100 (≤1%) 否Tween 20 (≤1%) 否
抑制剂/螯合剂
PMSF (≤200μM) 否
EDTA (≤1mM) 否
EGTA (≤1mM) 否Antipain (≤100μg/ml) 否Chymostatin (≤10μg/ml) 否Leupeptin (≤10μg/ml) 否Trypsin (≤10μg/ml) 否
其他Glycerol (≤10%) 否
Sucrose (250mM) 是
2、TBA工作液的配制：BA工作液。TBA工作液需完全溶解后再使用，可以加热到60－
70℃促溶，并可通过反复剧烈Vortex促溶。配制好的TBA工作液4℃避光保存，至少3－4个月内有效。
3、MDA检测工作液的配制：临检测前，根据待测定的样品数(含对照)，参考下表新鲜配
制适量的MDA检测工作液。
检测次数1次10次20次
TBA工作液50μl 500μl 1000μl
抗氧化剂3μl 30μl 60μl
MDA检测液150μl 1500μl 3000μl
总体积203μl 2030μl 4060μl
4、稀释标准品：取适量标准品用恰当溶液稀释至1、2、
5、10、20、50μM(如果进行简
易快速检测，标准品直接稀释10μM)。注意：待测样品为血清、血浆时，标准品宜用生理盐水稀释；待测样品由匀浆液、裂解液、PBS获得时，标准品宜用相同溶液稀释。
其原则是保证空白管、标准管、测定管具有可比性。配制好的MDA标准品4℃避光保存，至少3－4个月内有效。
5、样品测定:
①在离心管或其它适当容器内加入100μl匀浆液、裂解液、PBS、生理盐水等适当溶液作
为空白对照(注意：待测样品为血清、血浆时，标准品宜用生理盐水稀释；待测样品由匀浆液、裂解液、PBS获得时，标准品宜用相同溶液稀释。随后加入200μl MDA检测工作液。可参考下表设置检测反应体系，依次加入试剂：
空白管标准管测定管匀浆液、裂解液、PBS、生理盐水等100μl－－
标准品－100μl－
待测样品100μl
MDA检测工作液200μl200μl200μl
②混匀, 加盖，水浴煮沸，加热时务必注意避免液体暴沸溅出。如果使用加热块(Heat block)进行加热注意用重物压紧离心管盖；如果使用沸水浴，则需使用可把盖子锁死的离心管或螺旋盖离心管，或用Parafilm封住离心管口，用针头刺一小孔。最方便和准确的加热方法是使用带有热盖并可以加热的金属浴或者0.5mlPCR仪。
③水浴或流水冷却至室温。
④取上清，蒸馏水调零，用酶标仪检测532nm或535nm处吸光值，如果不方便测定535nm 的吸光度，也可以测定530-540nm之间的吸光度。
计算：
对于血浆、血清或尿液等样品可以直接根据标准曲线)计算；如果进行简易快速检测，直接以10μM标准品进行计算)获得MDA的摩尔浓度，对于细胞、或组织样品，计算出样品溶液中的MDA含量后，可以通过单位重量的蛋白含量或组织重量等来表示最初样品中的MDA含量，例如μmol/mg蛋白或μmol/mg组织。
简易快速血清、血浆、尿液等液体样品中MDA含量计算公式：
MDA浓度(μmol/L)=(OD测定-OD空白)/(OD标准-OD空白)×10
简易快速细胞、组织样品中MDA含量计算公式：
MDA浓度(μmol//mg)=(OD测定-OD空白)/(OD标准-OD空白)×10//蛋白质质量浓度(mg/ml)
参考区间：
健康成年人血清MDA：9.58±2.15μmol/L
健康成年人血浆MDA：7.31±1.27μmol/L
注意事项：
1、上述低温试剂避免反复冻融，以免失效或效率下降。
2、参考取样量：血清、血浆、尿液取100μl；低密度脂蛋白悬液取100-200μl；食用油
取30μl；肝脏、心肌、肌肉等，取5%或10%匀浆100-200μl。
3、测定样品吸光度值较低时，可将水浴延长至80min，但应同时延长，以免造成批间差
异。
4、待测样本如不能及时测定，应置于-20℃保存，4天内稳定。
5、避免使用EDTA、枸橼酸、氟化钠、草酸等抗凝剂。
乳酸检测试剂盒(乳酸脱氢酶微板法) 简介： 乳酸(Lactic acid ，LD)又称2-羟基丙酸是一种化合物，是一种含有羟基的羧酸，分子式是C 3H 6O 3，参与生物化学很多反应过程。 乳酸检测试剂盒(乳酸脱氢酶微板法)其检测原理是在NAD 存在条件下，乳酸脱氢酶(LDH)催化乳酸生成丙酮酸，同时生成NADH 。在碱性条件下显色剂与丙酮酸生成复合物，并使平衡偏向乳酸氧化为丙酮酸的方向，驱动反应完成，生成的NADH 与乳酸为等量摩尔。通过分光光度比色法(酶标仪)测定340nm 处吸光度，据此通过比色分析就可以计算出LD 水平。该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清等样品中内源性的乳酸含量。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、 准备样品： ①_x0001_ 血浆、血清、尿液及其他体液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，尿液通常也可以直接用于测定，-20℃冻存。 ②_x0001_ 细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要需进行适当匀浆，低速离心取上清，-20℃冻存，用于LD 的检测。 ③_x0001_ 高浓度样品：如果样品中含有较高浓度的LD ，可以使用原有的裂解液或 PBS 等进行稀释，如鸡血清、血浆可稀释5～10倍后检测。 2、 配制标准品工作液：取乳酸标准(20mmol/L) 0.1ml 溶解于0.3ml 乳酸标准稀释液，使 浓度达到5mmol/L ，即为标准品工作液-乳酸标准(5mmol/L)。4℃避光保存2个月有效。 编号 名称 TC0731 110T Storage 试剂(A): 乳酸标准(20mmol/L) 1ml -20℃ 避光 试剂(B): 乳酸标准稀释液 1ml RT 试剂(C): LD 显色液 C1: LD Assay buffer 5ml 4℃ 避光 C2: NAD 2支 -20℃ 避光 C3: LDH solution 15μl -20℃ 避光 试剂(D): LD 终止液 30ml RT 使用说明书 1份
丙二醛含量测定
实验六、植物组织丙二醛含量测定 植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内活性氧代谢的平衡被破坏而有利于活性氧的积累。活性氧积累的危害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。活性氧包括含氧自由基。自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。生物体内产生的活性氧主要有超氧自由基(O-2)、羟自由基(OH·)、过氧自由基(ROO·)、烷氧自由基(RO·)、过氧化氢（H2O2）、单线态氧（O21）等。植物对活性氧产生有酶促和非酶促两类防御系统，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶POD和抗坏血酸过氧化物酶(ASA—POD)等是酶促防御系统的重要保护酶，抗坏血酸(ASA)和还原型谷胱甘肽(GSH)等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。 丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤。因此，丙二醛产生数量的多少能够代表膜脂过氧化的程度，也可间接反映植物组织的抗氧化能力的强弱。所以在植物衰老生理和抗性生理研究中，丙二醛含量是一个常用指标。 [原理] 植物组织中的丙二醛(MDA) 在酸性条件下加热可与硫代巴比妥酸(TBA) 产生显色反应，反应产物为粉红色的3，5，5一三甲基恶唑2，4一二酮(Trimet—nine)。该物质在539nm波长下有吸收峰。由
于硫代巴比妥酸也可与其它物质反应，并在该波长处有吸收，为消除硫代巴比妥酸与其它物质反应的影响，在丙二醛含量测定时，同时测定600nm下的吸光度，利用539nm与600nm下的吸光度的差值计算丙二醛的含量。 [材料、仪器、药品] 1．材料：植物抗逆性鉴定实验中的四种菠菜样品，即绿色和黄色叶片的高温处理和室温对照。 2．仪器：(1) 分光光度计；(2) 离心机；（3）水浴锅：(4) 天平；(5) 研钵；(6) 剪刀；(7) 5ml刻度离心管；(9) 刻度试管(10ml)；(10) 镊子；(11) 移液管(5ml、2ml、1ml)；（12）冰箱。 3．药品： (1) 0.05mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液； (2) 石英砂； (3) 5％三氯乙酸溶液：称取5g三氯乙酸，先用少量蒸馏水溶解，然后定容到100ml； (4) 0.5％硫代巴比妥酸溶液：称取0.5g硫代巴比妥酸，用5％三氯乙酸溶解，定容至100ml，即为0.5％硫代巴比妥酸的5％三氯乙酸溶液。 [方法] 1．丙二醛的提取：取0.5g样品，加入2ml预冷的0.05mol/L pH7.8的磷酸缓冲液，加入少量石英砂，在经过冰浴的研钵内研磨成匀浆，转移到5ml刻度离心试管，将研钵用缓冲液洗净，清洗也移
碱性磷酸酶检测试剂盒(PNP 微板法) 产品简介： 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase ，简称ALP 或AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内，其活性所需最适pH 9.2~9.8。此酶主要存在于物质交换活跃之处(细胞膜)，如肠上皮和肾近曲小管的刷状缘、附睾上皮之静纤毛、肝的毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉部之内皮，还见于内质网、高尔基复合体、吞饮小泡、肠上皮之溶酶体、中性粒细胞之中性颗粒以及平滑肌的细胞膜。 Leagene 碱性磷酸酶检测试剂盒(PNP 微板法)(Alkaline Phosphatase Colorimetric Assay Kit)采用PNP 比色法，其检测原理是Para-nitrophenyl phosphate (pNPP)为一种常用的磷酸酶显色底物，在酸性条件下，可在碱性磷酸酶的作用下生成p -nitrophenol 。在碱性条件下p -nitrophenol 转变成醌式结构，呈较深的黄色，产物黄色越深，说明碱性磷酸酶活性越高，反之则酶活性越低，通过分光光度比色法测定处吸光度，据此通过比色分析就可以计算出碱性磷酸酶活性水平。该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的碱性磷酸酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 产品组成： 自备材料： 1、 水浴锅或恒温箱 2、 96孔板 3、 酶标仪 操作步骤(仅供参考)： 1、 配制显色工作液： 取出1支pNPP ，恢复至室温后溶解于ALP Assay buffer ，混匀， 冰上预冷备用。新配制的显色工作液应在6h 内用完。 2、 配制标准品工作液：取出p -nitrophenol(10mM)恢复至室温后，取10μl 溶解于190μ 编号 名称 TE0002 100T Storage 试剂(A): ALP Assay buffer 15ml 4℃ 试剂(B): pNPP 2支 -20℃ 避光 试剂(C): p -nitrophenol(10mM) 0.1ml -20℃ 避光 使用说明书 1份
植物组织或器官中丙二醛含量的测定 一、实验目的 二、实验原理： 三、实验仪器：紫外可见分光光度计离心机 四、实验步骤： ●1 MDA的提取称2g叶片，加入10％三氯乙酸(TCA)2ml及少量石英砂，研磨；进一步加入8mlTCA充分研磨，接着把匀浆液以4000r／min离心10min，其上清液即为MDA提取液。 ●2 MDA显色反应及测定取2ml MDA提取液（对照组取2ml 蒸馏水），在加2ml 0.6％TBA混匀，在试管上加棉塞，置沸水中加热15min，迅速拿出水浴锅冷却，以4000r／min离心15min ，于波长532nm和450nm下测定OD值。 五、结果计算 ●以测得的OD532减去OD600的非特异吸收值，分别计算衰老和对照组的值。 MDA浓度(μmol/L)=6.45OD532-0.56OD450 D450、D532分别代表450nm、532nm波长下的光密度值。 六、注意事项： ●0.1-0.5％的三氯乙酸对MDA—TBA反应较合适，若高于此浓度，其反应液的非专一性吸收偏高； ●MDA-TBA显色反应的加热时间，最好控制沸水浴10-15min之间。时间太短或太长均会引起532nm下的光吸收值下降； ●如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间。 ●低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充Fe3+（最终浓度为0.5 nmol·L-1） ●可溶性糖与TBA显色反应的产物在532 nm也有吸收（最大吸收在450 nm），当植物处于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。 丙二醛(MDA)含量的测定 ①测定步骤 称取剪碎的试材1g，加入2ml10%三氯乙酸(TCA)和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8mlTCA进一步研磨，匀浆在4000r/min离心10分钟，上清液为样品提取液。吸取离心的上清液2ml(对照加2ml蒸馏水)，加入2ml0.6%硫代巴比妥酸溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532、600和450nm波长下的吸光度。 ②计算(3-6)式中：C—MDA的浓度；A450，A532 和A600—分别代表450、532和600nm 波长下的吸光度值。 丙二醛(MDA)含量的测定 丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5—三甲基恶唑-2，4。二酮)，其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，但532nm处也有吸收。 关键词：丙二醛含量测定氧化作用MDA膜脂过氧化硫代巴比妥酸TBATBA显色反应 植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。MDA从膜上产生的位置释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，从而丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。因此，MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。 [原理]丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5—三甲基恶唑-2，4。二酮)，其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，但532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁
丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒(赖氏微板法) 简介： Leagene 丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒(赖氏微板法)其检测原理是丙氨酸氨基转移酶催化丙氨酸与α-酮戊二酸之间的氨基转移反应，在ALT 催化下，其反应公式如下： L-丙氨酸+α-酮戊二酸→丙酮酸+L-谷氨酸。 二硝基苯肼与α-酮酸反应，生成相应的二硝基苯腙，在碱性条件下，二硝基苯腙的吸收光谱有差异，通过酶标仪检测在500-520nm 处差异最大，以等摩尔浓度计算出丙酮酸的生成量，进而计算酶的活性。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、 准备样品： ①_x0001_ 血浆、血清样品：血浆、血清按照常规方法制备，可以直接用于本试剂盒的 测定，-20℃保存1个月有效，用于ALT/GPT 的检测。 ②_x0001_ 细胞或组织样品：取恰当细胞或组织进行匀浆，低速离心取上清，-20℃保存 1个月有效，用于ALT/GPT 的检测。 ③_x0001_ (选做)样品准备完毕后可以用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便 于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内的ALT/GPT 含量。 2、 制作ALT 标准曲线：取适量的丙酮酸标准(100mmol/L)，按丙酮酸标准(100mmol/L)： 丙酮酸标准稀释液=1：49的比例混合，即为丙酮酸标准工作液-丙酮酸标准(2mmol/L)，按下表制备标准曲线。最好设定平行检测管，求平均值。 编号 名称 TE0121 100T Storage 试剂(A): 丙酮酸标准(100mmol/L) 1ml 4℃ 避光 试剂(B): 丙酮酸标准稀释液 2ml RT 试剂(C): 标准对照液 2ml 4℃ 试剂(D): ALT assay buffer 3ml -20℃ 避光 试剂(E): 二硝基苯肼显色液 3ml 4℃ 避光 试剂(F): ALT 显色基液 25ml RT 使用说明书 1份 加入物 0 1 2 3 4 丙酮酸标准(2mmol/L)(μl) 2 4 6 8
硫代巴比妥酸法（丙二醛含量测定） 一：原理 丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5—三甲基恶唑-2，4。二酮)，其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，但532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532、450nm处的消光度值，所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为每克千重100—300ug·g-1，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3+的终浓度为0．5umol·L-1。 二：试剂 1：质量分数为10％三氯乙酸(TCA)； 2：质量分数0.6％硫代巴比妥酸：先加少量的氢氧化钠(1mol·L-1)溶解，再用10％的三氯乙酸定容； 三：方法 1：MDA的提取称取剪碎的试材1g，加入2mll0％TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8mlTCA研磨，匀浆在4000r·min-1离心10min，上清液为样品提取液。
2：显色反应和测定吸取离心的上清液2ml(对照加2ml蒸馏水)，加入2ml 0．6％TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532、600和450nm波长下的消光度。 四：结果 C1＝11.71D450 C2＝{6.45(D532 - D600) - 0.56D450}NW-1 C1——可溶性糖的浓度(mmol·L-1) C2——MDA的浓度（·umol·L-1） D450、0532、D600分别代表450、532和600nm波长下的消光度值。 N:提取液总体积（ml） W:植物组织鲜重
苹果酸脱氢酶(MDH)检测试剂盒(OAA微板法) 简介： 苹果酸脱氢酶(Malate Dehydrogenase, MDH)是合成苹果酸的关键酶之一，催化苹果酸和草酰乙酸(OAA)的相互转化，参与众多生理代谢途径如TCA循环C4循环脂肪酸的氧化呼吸作用氮同化等，因此MDH在植物的生长发育中发挥着重要作用，广泛存在于线粒体、细菌细胞膜上，为三羧酸循环中的一种酶，由于酶的来源不同，其某些性质也不尽相同。MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性，MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH，细菌中通常只含有NAD-MDH，在真核细胞中，NAD-MDH 分布于细胞质和线粒体中。 Leagene苹果酸脱氢酶(MDH)检测试剂盒(OAA微板法)检测原理是在弱碱条件下，以草酰乙酸(OAA)作为显色底物，OAA在MDH催化下被NADH还原为苹果酸(Mal)，每催化1分子OAA消耗1分子NADH，通过分光光度比色法(酶标仪)测定处吸光度的变化，计算出NADH的消耗速率进一步推算出苹果酸脱氢酶活性水平。该试剂盒主要用于检测植物样本、血清等中苹果酸脱氢酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、研钵或匀浆器 2、离心管或试管 3、低温离心机 4、96孔板 5、酶标仪 操作步骤(仅供参考)：编号 名称TE0461 100T Storage 试剂(A): MDH Lysis buffer 250ml 4℃避光试剂(B): PMSF 1ml -20℃ 试剂(C): MDH Assay buffer20ml RT 试剂(D): NADH 1支-20℃ 试剂(E): ddH2O 10ml RT 使用说明书1份
植物组织中丙二醛含量测定 方法一： 一、目的 通过实验，掌握植物体内丙二醛含量测定的原理及方法。 二、原理 丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的。它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。测定植物体内丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸(TBA)在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5－三甲基恶唑2、4－二酮），三甲川最大的吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100－300μg·g－1Dw，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3＋的终浓度为0.5nmol· L－1。在532nm、600nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。 三、材料、仪器设备及试剂 1. 材料：植物叶片。 2. 仪器设备：离心机，分光光度计；电子分析天平；恒温水浴；研钵；试管；移液管（1ml、5ml）、试管架；移液管架；洗耳球；剪刀。 3. 试剂：10％三氯乙酸；0.6％硫代巴比妥酸（TBA）溶液：石英砂。 四、实验步骤 1. 丙二醛的提取 称取受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片1g，加入少量石英砂和10％三氯乙酸2ml，研磨至匀浆，再加8ml10％三氯乙酸进一步研磨，匀浆以4000r/min离心10min，其上清液为丙二醛提取液。 2. 显色反应及测定 取4支干净试管，编号，3支为样品管（三个重复），各加入提取液2ml，对照管加蒸馏水2ml，然后各管再加入2ml 0.6％硫代巴比妥酸溶液。摇匀，混合液在沸水浴中反应15 min，迅速冷却后再离心。取上清液分别在532、600和450nm波长下测定吸光度（A）值。
植物组织MDA 含量测定 一、目的要求 1．掌握植物组织MDA 含量测定的原理及具体测量步骤； 2．深化理解MDA 与逆境和衰老的关系，理解植物组织MDA 含量测定的意义； 3．了解膜脂过氧化、氧自由基和MDA 形成的关系； 4．能够根据待测材料的具体情况设计实验步骤测定MDA 含量； 5．学习分光光度计，低温离心机等仪器的使用方法。 二、实验原理 植物遭受逆境胁迫或衰老时，体内会发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低，活性氧平衡失调及内源激素平衡失调等。活性氧代谢失调直接导致植物体内活性氧的大量积累，从而引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。 膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、脂类过氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙二醛（Malondialdehyde ，MDA ）是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤。因此在植物衰老生理和抗性生理研究中，MDA 含量是一个常用指标，可通过测定MDA 了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。 MDA 在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸（TBA ）反应，产生红棕色的产物3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮（Trimet —nine ），又名三甲川，该物质在532nm 处有最大光吸收，在600nm 处有最小光吸收。由于TBA 也可与其它物质反应，并在532nm 处有吸收，为消除硫代巴比妥酸与其它物质反应的影响，同时测定600nm 下的吸光度，利用532nm 与600nm 下的吸光度的差值计算MDA 的浓度。 即：A 532－A 600＝ε·C ·L 式中，A 532和A 600分别表示532nm 和600nm 处的吸光度值，C 是MDA 浓度，L 为比色杯厚度，ε=155L·mmol -1·cm -1。 + 100 C O H N S N H O O O H H H N H S N H O O H O OH N N H S 2O TB A MDA 3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮 需要指出的是，植物组织中糖类物质可能对MDA-TBA 反应有干扰作用。可用下列公式消除由蔗糖引起的误差。
单胺氧化酶(MAO)检测试剂盒(醛苯腙比色法) 简介： 单胺氧化酶(Monoamine Oxidase ，MAO)是一组催化多种单胺类化合物氧化脱氨的酶，属于细胞外酶，含有铜离子，分布于肝脏、肾脏等组织的线粒体内，其含量分布为肝脏＞心脏＞肾脏＞脑＞肺＞骨骼肌。血小板、胎盘中也含有MAO 。线粒体中的MAO 与膜紧密结合，仅少量为可溶性的，存在于细胞质中，血液和结缔组织中的MAO 为水溶性。 Leagene 单胺氧化酶(MAO)检测试剂盒(醛苯腙比色法)其检测原理是待测样品在MAO 作用下，氧化底物苄胺生成苄醛，后者经催化反应生成醛苯腙，呈棕红色，通过酶标仪检测吸光度，根据标准曲线即可测出MAO 活力。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 蒸馏水 2、 离心管或小试管 3、 比色杯 4、 分光光度计 操作步骤(仅供参考)： 1、 准备样品： ①血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备，可以直接用于本试剂盒的测定，尿液通常也可以直接用于测定，冻存，用于MAO 的检测。 ②细胞或组织样品：取恰当细胞或组织进行匀浆，低速离心取上清，冻存，用于MAO 的检测。 高活性样品：如果样品中含有较高活性的MAO ，可以使用MAO Assay buffer 稀释。 编号 名称 TE0251 100T Storage 试剂(A): 苄醛标准(5mmol/L) 1ml 4℃ 避光 试剂(B): MAO Assay buffer 50ml RT 试剂(C): 苄胺缓冲液 5ml 4℃ 避光 试剂(D): 苄醛显色液 2.5ml 4℃ 避光 试剂(E): 苄醛显色缓冲液 5ml RT 使用说明书 1份
简介： 5′-核苷酸酶(5′-NT 或NTP)广泛分布于肝脏、胆道及其他各种组织中，该酶活性变化常与ALP 活性相平行。但在骨骼系统的疾病中，如肿瘤骨转移、畸形性骨炎、甲亢、佝偻病等，ALP 活力增高，但是5′-NT 活力正常。 Leagene 5′-核苷酸酶(5′-NT)检测试剂盒(钼蓝微板法)先检测ALP 和5′-NT 总的活性，利用镍离子能选择性的抑制5′-NT 的特性，用总活性减去ALP 活性即获得5′-NT 活性。通过酶标仪检测680nm 处吸光度。该酶的检测对于研究自由基代谢平衡，抗衰老和肿瘤发病机制具有一定的价值。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、 准备样品： ① 血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备，可以直接用于本试剂盒的 测定，尿液通常也可以直接用于测定，-70℃冻存，用于5′-NT 的检测。 ② 细胞或组织样品：取恰当细胞或组织进行裂解，可以采用Leagene Western 及IP 细胞裂解液，如果有必要需进行适当匀浆，低速离心取上清，-70℃冻存，用于5′-NT 的检测。 ③ 高活性样品：如果样品中含有较高活性的5′-NT ，可以使用AMP 酸性缓冲液稀释。 ④ (选做)样品准备完毕后可以用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便于后续 计算单位蛋白重量组织或细胞内的5′-NT 含量。 2、 配制对照NT Assay 工作液：取适量的NT Assay buffer Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，配制对照NT Assay 工作液，4℃保存备用。 3、 配制测定NT Assay 工作液：取适量的NT Assay buffer Ⅰ、Ⅱ，配制测定NT Assay 工 作液，4℃保存备用。 编号 名称 TE0261 100T Storage 试剂(A): NT Assay buffer Ⅰ 15ml RT 试剂(B): NT Assay buffer Ⅱ 2ml RT 试剂(C): NT Assay buffer Ⅲ 1ml RT 避光 试剂(D): 5′-AMP buffer 2ml 4℃ 试剂(F): 磷标准(6mmol/L) 1ml 4℃ 试剂(H): 定磷还原液 3ml 4℃ 避光 使用说明书 1份
实验六、植物组织丙二醛含量测定 植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内活性氧代谢的平衡被破坏而有利于活性氧的积累。活性氧积累的危害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。活性氧包括含氧自由基。自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。生物体内产生的活性氧主要有超氧自由基(O-2)、羟自由基(OH·)、过氧自由基(ROO·)、烷氧自由基(RO·)、过氧化氢（H2O2）、单线态氧（O21）等。植物对活性氧产生有酶促和非酶促两类防御系统，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶POD和抗坏血酸过氧化物酶(ASA—POD)等是酶促防御系统的重要保护酶，抗坏血酸(ASA)和还原型谷胱甘肽(GSH)等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。 丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤。因此，丙二醛产生数量的多少能够代表膜脂过氧化的程度，也可间接反映植物组织的抗氧化能力的强弱。所以在植物衰老生理和抗性生理研究中，丙二醛含量是一个常用指标。 [原理] 植物组织中的丙二醛(MDA) 在酸性条件下加热可与硫代巴比妥酸(TBA) 产生显色反应，反应产物为粉红色的3，5，5一三甲基恶唑2，4一二酮(Trimet—nine)。该物质在539nm波长下有吸收峰。由于硫代巴比妥酸也可与其它物质反应，并在该波长处有吸收，为消除硫代巴比妥酸与其它物质反
应的影响，在丙二醛含量测定时，同时测定600nm下的吸光度，利用539nm 与600nm下的吸光度的差值计算丙二醛的含量。 [材料、仪器、药品] 1．材料：植物抗逆性鉴定实验中的四种菠菜样品，即绿色和黄色叶片的高温处理和室温对照。 2．仪器：(1) 分光光度计；(2) 离心机；（3）水浴锅：(4) 天平；(5) 研钵；(6) 剪刀；(7) 5ml刻度离心管；(9) 刻度试管(10ml)；(10) 镊子； (11) 移液管(5ml、2ml、1ml)；（12）冰箱。 3．药品： (1) L 磷酸钠缓冲液； (2) 石英砂； (3) 5％三氯乙酸溶液：称取5g三氯乙酸，先用少量蒸馏水溶解，然后定容到100ml； (4) ％硫代巴比妥酸溶液：称取硫代巴比妥酸，用5％三氯乙酸溶解，定容至100ml，即为％硫代巴比妥酸的5％三氯乙酸溶液。 [方法] 1．丙二醛的提取：取样品，加入2ml预冷的L 的磷酸缓冲液，加入少量石英砂，在经过冰浴的研钵内研磨成匀浆，转移到5ml刻度离心试管，将研钵用缓冲液洗净，清洗也移入离心管中，最后用缓冲液定容至5ml。在4500转/min离心10min。上清液即为丙二醛提取液。 2．丙二醛含量测定：吸取2 ml的提取液于刻度试管中，加入％硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液3ml，于沸水浴上加热10min，迅速冷却。于4500
甘油三脂(TG)检测试剂盒(GPO-PAP 单试剂微板法) 简介： 甘油三酯(Triglyceride ，TG ）又称三酰甘油，是3分子长链脂肪酸和甘油形成的脂肪分子，是人体内含量最多的脂类，大部分组织均可以利用甘油三酯分解产物供给能量，同时肝脏、脂肪等组织还可以进行甘油三酯的合成。 Leagene 甘油三脂(TG)检测试剂盒(GPO-PAP 单试剂微板法)又称磷酸甘油氧化酶法或磷酸甘油氧化酶-过氧化物酶偶联法等，甘油三脂被LPL 水解为甘油和脂肪酸，再经过氧化物酶(POD)催化，使4-氨基安替比林与酚(三者合称PAP)反应，生成红色苯醌亚胺(Trinder 反应)。酶标仪在500~520nm 处进行比色测定。本试剂盒用于人或动物的血清、血浆、脑脊液、细胞、组织等样本中的甘油三脂含量定量测定。本试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、 样本处理： ①血清、血浆、脑脊液样本：从待测样本中分理出的血清或血浆不应有溶血，直接检测，如超过线性范围，用生理盐水稀释后检测。 ②细胞样本： a 、取适量的细胞(一般推荐>106以上)，弃上清，留取沉淀。 b 、用PBS 或生理盐水清洗1~2次，弃上清，留取沉淀。 c 、加入200~300μl 的PBS 或生理盐水匀浆，冰浴条件下超声破碎细胞，功率300W ，每次3~5s ，间隔30s ，重复3~5次。亦可手动匀浆，制备好的匀浆液不可离心，待用。 d 、③组织样本：准确称取适量组织样本，按质量(g)：生理盐水或PBS(ml)=1：9的比例， 编号 名称 TC1241100T Storage 试剂(A): GPO-PAP 工作液 Tris-HCl buffer 30ml -20℃ 避光 LPL 、GK 4-氨基安替比林 对氯酚 试剂(B): Glycerol 标准(1.7mmol/L) 1ml RT 试剂(C): ddH 2O 1ml RT 使用说明书 1份
本站最近研究开发了ABO血型全自动微板检测法，并对2857名献血者进行ABO血型鉴定，一次判读准确率达到99.83%。该法的应用大大地降低了实验者的工作强度，避免了人为因素导致的错判血型，确保了临床输血的安全。笔者着重对该方法的可靠性和干扰因素进行 研究，结果报告如下。 1 材料和方法 1.1 材料2857份献血者血液标本（ 2.5mgEDTANa 2/ml抗凝全血）；Genesis RSP-100型全自动样本处理系统，SLT自动扫描酶标仪及随机购置的支持软件Soft2000(瑞士TECAN 公司产品)；T.S温控孵育振荡仪（奥地利Anthos公司）；KUBOTA Ks-5000平板式离心机（日本久保田公司）；9 6孔硬质U型板（丹麦）；单克隆抗-A、抗-B血清（长春生物制品研究所）；5% 3 人份以上混合试剂红细胞（自制）；A2亚型红细胞（Ortho公司产品）， 经盐水洗涤2次配成5 %的盐水悬液。 1.2 全自动微板检测法（简称微板法）用96孔U型微量反应板，通过全自动加样器处理样本和试剂。正定型中，分别加入标准抗血清30μl和5%样本红细胞30μl，反定型中，分别加入样本血浆50μl和5%标准红细胞30μl。经孵育、离心、悬浮和静止，再用自动酶标仪取 620nm波长对反应板进行扫描、判读，随后在电脑中进行正反定型结果配对比较，确认无误后，将最终正确结果经站电脑网络与相应献血者资料存放在一起。经多次正交试验检测和各参数指标间的对比试验，优化得出ABO正反定型检测最终试验条件为，孵育：3min，500r/min，2level；离心：400g，90s；悬浮：3min，900r/min，3 level；静止：正定型1～2min，反定型5～6min；判读：620nm波长，40点扫描，Tc＞15%为凝集反应，Tc＜10为非凝集反应，10≤Tc≤15为可疑，需手工法重新鉴定。依据Soft20 00支持软件结构，微凝板经扫描后每孔都可获得一最小透光率（minimum transmission, Tn）和最大透光率(maximum transmission,Tm)，非凝集孔Tm与Tn的差值（contrast transmission,Tc）较小，凝集孔Tc值较大；当Tc值超过一特定值时，提示细胞凝集，结果判为阳性；反之，Tc值较小时表明细胞不凝集，结果判为阴性。根据ABO正反定型原则 ［3］，确定其血型。 1.3 试管法，平板法见文献［3］方法。 2 结果 2.1 方法的可靠性 2.1.1 可重复性取8份样本，连续进行20次反定型，每次得阳性Tc 值9个，阴性Tc值7个，分别算出它们的平均Tc值，然后对20份阳性和阴性的平均Tc值分别进行数理统计，依次得标准差(s)为2.091、0.295和变异系数(cv)为2.91%、8.03%，均＜10%， 说明该试验具有良好的可重复性。 2.1.2 稳定性取48份标本，连续进行3次正反定型，每次间隔11 d,显示：正定型凝集试验中均为4+，无任何变化;而对反定型凝集试验中的Tc值按配对资料的两两比较进行数理统计，无显著性差别、(t＝0.387，n=62，经查表，t0.05 =2.000,故P＞0.05)。 2.1.3 准确率通过2857份献血者样品的正反定型，得出正反定型试验1次判读准确率为99.83%，证明该试验方法完全可靠。异常结果主要出现在反定型中，其中3份样本 为严重脂血，2份为血型抗体极弱。 2.1.4 敏感性将单克隆-抗A血型试剂倍比稀释，每种稀释度加样30 μl，再分别加入5%A型和A2亚型红细胞悬液30μl，按上述3种方法进行操作，分别测得其结果（表1）。用B型血浆代替上述单克隆抗-A，加样量改为50μl，其余不变，分别测得其结果 （表2）。 表1 A和A2亚型红细胞在3种方法中测得单克隆抗-A效价
碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(磷酸苯二钠微板法) 简介： 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase ，简称ALP 或AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内，其活性所需最适pH 9.2~9.8。此酶主要存在于物质交换活跃之处(细胞膜)，如肠上皮和肾近曲小管的刷状缘、附睾上皮之静纤毛、肝的毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉部之内皮，还见于内质网、高尔基复合体、吞饮小泡、肠上皮之溶酶体、中性粒细胞之中性颗粒以及平滑肌的细胞膜。 碱性磷酸酶检测试剂盒(磷酸苯二钠微板法)(Alkaline Phosphatase Colorimetric Assay Kit)采用磷酸苯二钠比色法，其检测原理是磷酸苯二钠在碱性条件下，可在碱性磷酸酶的作用下生成游离酚和磷酸。在碱性条件下酚与氨基安替比林结合，并经氧化生成红色醌式结构物，呈深浅不一的红色，产物红色越深，说明碱性磷酸酶活性越高，反之则酶活性越低，通过酶标仪测定吸光度，据此通过比色分析就可以计算出碱性磷酸酶活性水平。该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清等样品中内源性的碱性磷酸酯酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 96孔板 2、 水浴锅或恒温箱 3、 酶标仪 操作步骤(仅供参考)： 1、 配制标准品工作液：取出Phenol 标准(1mg/ml)恢复至室温后，取溶解于ddH 2O ，使 浓度达到，即为标准品工作液-Phenol(0.05mg/ml)。按照下表稀释系列标准品溶液。 编号 名称 TE0005 50T TE0005 100T Storage 试剂(A): ALP Assay buffer 2.5ml 5ml 4℃ 避光 试剂(B): ALP 显色液 2.5ml 5ml -20℃ 避光 试剂(C): 显色基液 7.5ml 15ml -20℃ 避光 试剂(D): Phenol 标准(1mg/ml) 1ml 1ml RT 试剂(E): ddH 2O 1ml 1ml RT 使用说明书 1份 1 2 3 4 5
苯丙氨酸解氨酶(PAL)检测试剂盒(苯丙氨酸微板法) 简介： 苯丙氨酸解氨酶(L－phenylalanine ammonia-lyase，PAL)是催化直接脱掉L-苯丙氨酸上的氨而生成反式桂皮酸的酶。该酶多存在于高等植物、酵母、菌类可溶性部分物质，是1961年J.Koukol在大麦中发现的，推测其分子量约为30万，这是一个可把苯丙氨酸用于酚类化合物合成的酶。在组织中的活性可随外界因素而发生显著变化，用光照、病伤害、植物激素处理等会使活性显著增加。在多数情况下，在组织中活性增加时，酶发生失活作用，这时组织中具有活性酶的量很快就会减少，据认为这种失活是与类蛋白质物质作用有关。测定细胞木质素合成途径中间代谢物及关键酶活性，可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量提高其品质提供依据。 Leagene苯丙氨酸解氨酶(PAL)检测试剂盒(苯丙氨酸微板法)检测原理是以苯丙氨酸作为底物，在酶促反应的最适条件下采用每隔一定时间测定产物生成量的方法，于酶标仪290nm处检测吸光度，以吸光度变化所需酶量进行计算。该试剂盒主要用于植物组织的裂解液或匀浆液、血清等样品中内源性的苯丙氨酸解氨酶活性，尤其适用于检测水果中苯丙氨酸解氨酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、蒸馏水 2、研钵或匀浆器 3、离心管或试管 4、低温离心机 5、恒温箱或水浴锅 6、酶标板 7、酶标仪 操作步骤(仅供参考)：编号 名称TE0401 100T Storage 试剂(A):PAL Lysis buffer250ml4℃避光试剂(B):PAL Assay buffer5ml4℃避光使用说明书1份
过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒(紫外微板法) 简介： 过氧化氢酶(Catalase，CAT)又称触酶，是一类以铁卟啉为辅基的结合酶，由四个相同亚单位组成的四聚体酶，共含4分子的亚铁血红素作为辅基，分子量约为24KD。CAT 能将细胞代谢产生的毒性物质过氧化氢迅速清除，可与GSH-Px 共同保护巯基酶、膜蛋白、过氧化氢解离。 Leagene 过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒(紫外微板法)检测原理是血清或血浆等样品H 2O 2在240nm 处有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过H 2O 2，使待测溶液吸光度随反应时间而减少，通过紫外酶标仪测定240nm 处吸光度，该酶的检测对于研究植物代谢强度及抗旱、抗病能力有一定的价值。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、蒸馏水、生理盐水 2、研钵或匀浆器 3、离心管 4、96孔板 5、酶标仪 操作步骤(仅供参考)： 1、配制CAT Assay buffer 工作液：按CAT Assay buffer(2.5×)：蒸馏水=的比例稀释， 即获得CAT Assay buffer 工作液，4℃预冷，待用。 2、配制100mM H 2O 2基液：本试剂盒提供的H 2O 2基液中的H 2O 2浓度约为1M。由于过 氧化氢不是非常稳定，使用前需自行测定过氧化氢的实际浓度。而计算出本试剂盒提供的H 2O 2基液中的H 2O 2的实际浓度。然后再根据实际的过氧化氢浓度，配制100mMH 2O 2基液。3、准备样品： ①植物、动物样品：取正常或逆境下的新鲜植物组织(或动物组织)，清洗干净，擦干，切碎， 编号 名称 TO1072100T Storage 试剂(A):H 2O 2基液 2×1ml RT 试剂(B):CAT Assay buffer(2.5×)500ml 4℃避光使用说明书 1份
植物体内丙二醛含量的测定 一、目的 通过实验，掌握植物体内丙二醛含量测定的原理及方法。 二、原理 丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的。它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。测定植物体内丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸(TBA)在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5－三甲基恶唑2、4－二酮），三甲川最大的吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100－300μg·g－1Dw，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3＋的终浓度为0.5nmol· L－1。在532nm、600nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。 三、材料、仪器设备及试剂 1. 材料：植物叶片。 2. 仪器设备：离心机，分光光度计；电子分析天平；恒温水浴；研钵；试管；移液管（1ml、5ml）、试管架；移液管架；洗耳球；剪刀。 3. 试剂：10％三氯乙酸；0.6％硫代巴比妥酸（TBA）溶液：石英砂。 四、实验步骤 1. 丙二醛的提取 称取受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片1g，加入少量石英砂和10％三氯乙酸2ml，研磨至匀浆，再加8ml10％三氯乙酸进一步研磨，匀浆以4000r/min离心10min，其上清液为丙二醛提取液。 2. 显色反应及测定 取4支干净试管，编号，3支为样品管（三个重复），各加入提取液2ml，对照管加蒸馏水2ml，然后各管再加入2ml 0.6％硫代巴比妥酸溶液。摇匀，混合液在沸水浴中反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液分别在532、600和450nm波长下测定吸光度（A）值。 五、丙二醛含量计算： 由于蔗糖－TBA反应产物的最大吸收波长为450nm，毫摩尔吸收系数为85.4×10－3，MDA －TBA反应产物在532nm的毫摩尔吸收系数分别是7.4×10－3和155×10－3。532nm非特异性吸光值可以600nm波长处的吸光值代表。 按双组分分光光度法原理，建立方程组，解此方程组即可求出MDA及可溶性糖浓度。方程组： A450=（85.4×10－3）·C糖 （A532－A600）=（155×10－3）·C MDA+（7.4×10－3）·C糖 解得： A450 C糖= —————— = 11.71A450（mmol·L－1） 85.4×10－3