八年制细胞与分子生物学实验备考
Part 1 十五个实验概要
Experiment 1细胞有丝分裂
间期：有明显的细胞核，染色质分布较均均，由于染色质易与碱性染料结合，故细胞核的染色比细胞质深。核中可见1～3个染色较浅的呈球状的核仁
前期：细胞核膨大，染色质逐渐螺旋化为丝状的染色丝，其后染色丝进一步缩短变粗，形成一定形态和书目的染色体（这时候的每条染色体由两条染色单体组成，但在光镜下一般不易看清），核膜、核仁逐渐消失
中期：每条染色体中的成对染色单体逐渐分开（但着丝粒仍未分离）全部染色体（2n=16）移向细胞中央的赤道面上，形成赤道板。在赤道板到两面有许多纺锤丝连接细胞两极和染色体的着丝点，成为纺锤体，但不易观察到，此时染色体形态最典型
后期：着丝粒纵裂为二。这是，每条染色体的两条染色单体已完全分开，由于纺锤丝的牵引，分别向细胞的两极移动，形成了数目相等的两组染色体（这是所观察到的染色体数目比原来增加1倍，是由于S期内DNA含量倍增的结果）
末期：染色体移到两极并解旋为染色质，细胞中部出现细胞板，并逐渐向边缘发展。当染色质构成核网时，核膜、核仁重新出现。细胞板达到两边，分裂结束，形成两个子细胞，细胞又进入间期状态。
Experiment 2动物染色体的制备
原理：染色体只有在分裂期的细胞，特别是中期细胞中表现出典型形态便于观察和计数，所以必须采取特殊的技术方法，从发生有丝分裂的组织和细胞悬液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备。骨髓细胞数量多、分裂旺盛，不需体外培养和无菌操作，便于取材。
秋水仙素的作用：抑制纺锤体的形成，使细胞停留在分裂中期
KCl低渗溶液：使细胞膨胀，促使中期染色体散开
固定液：有固定作用，对染色体还有一定的分散作用
Giemsa染色液：染色
结果：低倍镜下，可见到许多大小
不等被染成紫红色呈圆形的间期细胞核以及分散在它们之间的中期分裂象。小鼠染色体一般呈“U”形，染色体
2n=40
Experiment 3蟾蜍血细胞的体外融合
原理：细胞融合又称体细胞杂交，通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程。是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞，此杂交细胞具有很强的生命力，增殖旺盛。细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段，也是制备单克隆细胞株的重要技术。
肝素：血液抗凝
PEG溶液：促进细胞凝集
Hanks溶液：终止PEG作用，平衡缓冲溶液使PEG的浓度降低至诱导融合的要求。
詹纳斯绿：染液
Experiment 4 AKP Km测定
原理：在温度pH和酶浓度一定时，酶促反应初速度与底物浓度的关系满足
Km是酶的特征常数，反映了酶与特定底物的亲和力大小。测定Km值通常用双倒数法，推导上述米-曼氏方程式可得一直线方程：
在横坐标上的截距即可算出Km值。AKP最适pH为10，而酶蛋白最稳定pH为8，测定其Km值时反应体系选择其最适pH。本实验取pH为10。
Experiment 5葡萄糖定量方法─标准管法测定葡萄糖含量
原理：在葡萄糖氧化酶的催化作用下β-D葡萄糖氧化成过氧化氢和葡萄糖酸，在过氧化酶的存在下，过氧化氢与苯酚、4-氨基安替比林与偶联酚缩合成可被分光光度计测定的红色醌类化合物。其红色在510nm波长处有最大吸收峰，颜色的深浅在一定范围内与血葡萄糖浓度成正比。
结果：人体正常血糖：3.9～5.8 m mol/ L
Experiment 6蛋白质定量测定方法─标准曲线法测定蛋白质含量
原理：双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物，在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色络合物，此反应即为双缩脲反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与铜离子络合成紫红色化合物。其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，可以用比色法进行鉴定。
Experiment 7酶联免疫吸附试验（ELISA)─双抗体夹心法
原理：酶联免疫吸附试验是一种固相酶免疫测定的方法，目前广泛应用于各种抗原和抗体的检测。其基本原理是将抗原或抗体固定在固相载体表面，并保持其免疫活性，再与酶标记抗体或抗原联结，并保留酶的活性，然后加入酶反应的底物，后者被酶催化变为有色产物，反应颜色的深浅可与相应抗原或抗体的量相关。在本实验中（1）用一直抗体包被固相载体；（2）加入受检的标本（含待测抗原），使抗原与固相上的抗体结合；（3）加入以辣
根过氧化物酶标记的已知抗体，使之与抗原结合。标记的酶可催化底物（四甲基联苯胺）起显色反应，从而指示特异性抗原抗体反应的存在。
Experiment 8血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
原理：血清蛋白的pI都在7.5以下，在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子的形式存在，分子大小，形状也各有差异，所以在电场作用下，可在醋酸纤维薄膜上分离成A、α1、α2、β、γ五条区带。电泳结束后，将醋酸纤维薄膜置于染色液，使蛋白质固定并染色，再脱色
结果：A、α1、α2、β、γ
Experiment 9免疫电泳与对流免疫电泳
原理：免疫电泳是将电泳与双向琼脂扩散相结合的一种抗原分析方法。首先根据抗原中各种蛋白质组分的电荷和分子量大小的不同，在电场作用下有不同的迁移率，从而可将抗原混合物中的各种不同组分分开，然后使其与特异性抗体进行双向扩散，发生免疫学沉淀反应。
对流免疫电泳是电泳技术与双向琼脂扩散技术相融合而形成的一种定向加速的凝胶内免疫沉淀反应。与双向琼脂扩散技术中抗原与抗体分别向四周自由扩散不同，对流免疫电泳在凝胶中加一直流电场，抗原和抗体受到电泳和电渗两种力量的综合作用而向某一方向定向加速移动，因此可以提高灵敏度，明显缩短反应时间。
Experiment 10小鼠脾单个核细胞的分离─密度梯度离心法：
原理：本次实验根据颗粒沉降原理，将不同密度的小鼠脾脏细胞置于淋巴细胞分离液上进行水平式离心，使单个核细胞在其沉降运动中位于分离液洁面上；达到分离小鼠脾单个核细胞的目的。已知小鼠淋巴细胞和单核细胞的密度约为1.088，而红细胞与粒细胞的密度均大于1.088。因此，用密度为1.088±0.001的淋巴细胞分离液通过密度梯度离心方法，可从小鼠脾脏细胞分离得到单个核细胞。而分离人单个核细胞的淋巴细胞分离液密度为
1.077±0.001.
Experiment 11凝胶柱层析分离鉴定蛋白质
原理：利用交联葡聚糖凝胶G-50的凝胶过滤作用，将脲酶和胰岛素分开，以Folin-Denis反应检查流出液中的蛋白质。此反应主要靠蛋白质中的酪氨酸和色氨酸与含磷鉬钨酸的酚试剂生成蓝色鉬蓝，蓝色深浅与蛋白质含量成正比关系。以纳氏试剂检查脲酶活性，此反应是先将脲酶流出液分解尿素产生胺，而氨可与纳氏试剂作用生成黄色的碘代双汞胺。
脲酶试剂：分子筛层析
结果：先分离出脲酶，再分离出胰岛素，出现两个峰值
Experiment 12 DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析
原理：聚酰胺薄膜层析是一类较特殊的吸附分配层析。混合物随流动相通过聚酰胺薄膜时，由于被分离的物质与聚酰胺薄膜上的酰胺基团形成氢键，各种物质形成氢键能力强弱不同，决定了吸附力的差异，吸附力强展层速度较慢，吸附力弱展层速度较快，同时展层溶剂与被分离物质在聚酰胺粒子表面竞争形成氢键，选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺薄膜表面之间分配系数产生最大差异。一般讲，易溶于展层剂的所受到的动力作用大，展层速度块，反之速度就慢。通过各物质的吸附力和分配系数不同，使得被分离的物质在聚酰胺薄膜层析中得到分离。
结果：聚酰胺薄膜上出现9～10个点。
Experiment 13鼠肝DNA的提取和纯化
