SDS-PAGE配方
1. 30% Acry溶液(4摄氏度)
丙烯酰胺 29.2g
N,N-亚甲基双丙烯酰胺 0.8g
定容至100ml
2. 10% SDS（W/V）（室温）
SDS 10g 定容至100ml
3. 1.5M Tris-HCl pH 8.8(分离胶缓冲溶液)（4摄氏度）
Tris 18.15g 用6N HCl 调制pH 8.8 定容至100ml
4. 0.5M Tris-HCl, pH 6.8(浓缩胶缓冲溶液)（4摄氏度）
Tris 6g 用6N HCl 调制pH 6.8 定容至100ml
5.上样缓冲液（室温）
A液：（A液总量9.5ml）超纯水 3.55 ml
0.5M Tris-HCl, pH 6.8 1.25 ml
甘油（即丙三醇） 2.5ml
10% SDS 2.0ml
0.5%(W/V)溴酚蓝 0.2ml 用时取A液950ul,加入50ul β-巯基乙醇（即巯基乙醇）
样品：上样缓冲液为1：2 95℃加热 4 min
6. 10×电极缓冲液 pH8.3 (4摄氏度)
Tris 30.3g
甘氨酸 144.0g
SDS 10.0g
定容至1000ml（即1L）
注意！！不调pH!! 用时，稀释10倍，在室温下使用
7.10%（W/V） APS (过硫酸铵)
100mg 过硫酸铵加入1ml的超纯水
明胶酶谱配方
1. 1%明胶溶液
1g明胶60℃溶于水中定容至100ml，4℃下贮存
2. 5×上样缓冲溶液
50%甘油、5%SDS、0.05%溴酚蓝、250mM Tris-Hcl pH 6.8
3. 10×电极缓冲液
Tris 30.3g、甘氨酸 144g、SDS 10g定容至1000ml pH 8.3）；
4. 聚丙烯酰胺凝胶电泳贮液：
①30%丙烯酰胺溶液丙烯酰胺29.2g，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺0.8g避光定容到100ml
②分离胶缓冲溶液 1.5M Tris-HCl pH 8.8
③浓缩胶缓冲溶液 0.5M Tris-HCl, pH 6.8
④10%SDS溶液；
⑤10%过硫酸铵溶液；
5. 2.5% Triton X-100溶液；
6. 染色液
90mL 等体积甲醇(45ml)与水(45ml)混合液加入10ml冰乙酸中溶解0.25g考马斯亮蓝R-250
7. 脱色液
300ml甲醇，100ml冰乙酸加水定容至1000ml
8. 明胶酶谱孵育液
50mM Tris-HCl，10mM CaCl
pH 7.0
2
9. 考马斯亮蓝G-250染液
0.1g考马斯亮蓝G-250溶于95%乙醇中，加入100ml 85%浓磷酸加水定容至1000ml 10. 10Mm EDTA二钠溶液
分离胶配方（10ml）
注：分离胶缓冲溶液为1.5M Tris-HCl pH 8.8 分离胶： 50ul 10%APS 和 5ul TEMED
浓缩胶配方（10ml）
注：浓缩胶缓冲溶液为0.5M Tris-HCl, pH 6.8 浓缩胶： 50ul 10%APS 和 10ul TEMED
2.2.1.1 SDS-PAGE电泳试剂的配制
1）30% Acry（m/V）溶液(4℃)：
称取丙烯酰胺29.2g ，N,N-亚甲基双丙烯酰胺 0.8g ，超纯水定容至100mL，溶解过程应注意避光，配制完成的溶液倒入试剂瓶中，外套黑色塑料袋避光，4℃冰箱保存备用。
2）10% SDS（m/V）（室温）：
称取SDS 10g ,采用超纯水溶解定容至100mL，室温放置。
3）1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8(分离胶缓冲溶液)（4℃）：
称取Tris 18.15g，加入80mL左右超纯水溶解Tris，用6mol/L HCl将溶液调至pH 8.8，后用超纯水定容至100mL，4℃冰箱保存备用。
4)0.5mol/L Tris-HCl，pH 6.8(浓缩胶缓冲溶液)（4℃）：
称取Tris 6g ，加入约80mL左右超纯水溶解，用6mol/L HCl 调至pH 6.8，后用超纯水定容至100mL，4℃冰箱保存备用。
5）5×上样缓冲液：
8mol/L尿素，5% SDS，5%巯基乙醇，250mmol/L Tris-HCl(pH7.5)。
6） 10×电极缓冲液 pH8.3：
称量Tris 30.3g，甘氨酸144.0g，SDS 10.0g用超纯水定容至1000ml（即1L），用时稀释10倍，在室温下使用。
7）10%（w/V）过硫酸铵（APS）：
称量0.1g 过硫酸铵，加入1mL的超纯水，震荡混匀，现用现配。
8）SDS-PAGE脱色液：
SDS-PAGE脱色液中含50%的乙醇，9%的冰乙酸。配制试剂的水选用去离子水。配制时应在通风橱下，冰乙酸有强烈的刺鼻气味。
9）SDS-PAGE染色液：
量取454mL的50%的乙醇和46mL的冰乙酸，将两者混合均匀即为固定液。称量0.25g考马斯亮蓝R-250将其溶解于上述500mL的固定液中，完成配制后将染色液放入棕色瓶中保存，防止其见光失效，室温保存。
10）8%分离胶配方（10mL）：
添加顺序为4.7mL的超纯水，2.5mL的pH 8.8的缓冲液，2.7mL的30% Acry 溶液，0.1mL的10%SDS，震荡混匀，后添加50μL 10% APS 和 5μL TEMED，震荡混匀。
11）5%浓缩胶配方（10mL）：
添加顺序为5.7mL的超纯水，2.5mL的pH 8.8的缓冲液，1.7mL的30% Acry 溶液，0.1mL的10%SDS，震荡混匀，后添加50μL 10% APS和10μL TEMED，震荡
混匀。
12）20mmol/L pH 9 Tris-HCl缓冲溶液（含10 mmol/L CaCl
）的配置：
2
，溶于约800ml的去离子水中，用准确称取2.42g Tris，1.11g无水CaCl
2
6mol/L的HCl调溶液pH至9，再用去离子水将溶液定容至1L。
2.2.1.2 明胶酶谱配方
1）1%明胶溶液：
称取0.1g明胶，在60℃的水浴条件下溶于超纯水中，定容至10mL。4℃下贮存，放置时间不超过一周。
2）2.5% Triton X-100溶液：
称量25g Triton X-100，溶解于离子水中，最后定容至1L。
3）明胶酶谱染色液：
量取90mL 等体积甲醇(45mL)与水(45mL)混合液加入10mL冰乙酸中溶解0.25g考马斯亮蓝R-250。试剂配好后倒入棕色瓶中室温保存。
4）明胶酶谱脱色液：
量取300mL甲醇，100mL冰乙酸加水定容至1000mL。
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SDS-PAGE电泳试剂 1)30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲基双丙烯酰（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100 mL,棕色瓶存于4O C； 2) 1.5M Tris-HCl(pH 8.8)：Tris 18.17g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至8.0, 定容至100mL； 3) 1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至6.8,定容至100 mL； 4) 4?分离胶缓冲液：0.4gSDS溶于1.5M Tris-HCl(pH 8.8)，定容至100mL； 5) 4?浓缩胶缓冲液：0.4gSDS溶于1M Tris-HCl(pH 6.8)，定容至100mL； 6) 10?电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.029g，甘氨酸14.415g，SDS 1g加ddH2O 溶解,定容至100mL； 7) 10%过硫酸铵（Aps,现配）：1g AP加ddH2O至10mL； 8) 2?SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH 6.8)2.5mL，β-巯基乙醇1.0mL，SDS 0.6g，甘油2.0 mL，0.1%溴酚兰1.0 mL，ddH2O 3.5mL； 9) 考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰R2501.25g，甲醇225 mL，冰醋酸50 mL，ddH2O 225mL； 10) 脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH2O以2∶1∶7配制而成； 11) 分离胶(12.5%): ddH2O 4mL，30%储备胶5 mL，4?分离胶缓冲液3mL, 10% Aps 0.1mL(现配)，TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL； 12) 浓缩胶（5％）：ddH2O 2.65mL，30%储备胶0.85mL，4?浓缩胶缓冲液1.25mL，10%Aps 50μL，TEMED 5μL。 Tricine（三羟甲基氨基甘氨酸）- SDS - PAGE蛋白质电泳 1 Tricine - SDS - PAGE蛋白质电泳溶液准备 1）正极缓冲液(10 ×)：14g Tris 溶于400mL 重蒸水,用1. 0M HCl 调至pH8. 9 ,定容至500mL。 2）负极缓冲液(10 ×)：将60. 55g Tris ,89. 58g Tricine 及5g SDS 溶于400ml 重蒸水中,加水至终体积为500mL。 3）凝胶缓冲液(3 ×)：将181. 5g Tris ,1. 5g SDS 溶于400mL 重蒸水中,用1M
Discontinuous Native PAGE Stock Solutions and Buffers 1.Acrylamide/Bis (30% T, 2.67% C) 聚丙烯酰胺单体交联剂储备液 87.6 g acrylamide (29.2 g/100 ml) 2.4 g N'N'-bis-methylene-acrylamide (0.8 g/100 ml) Make to 300 ml with deionized water. Filter and store at 4 °C in the dark (30 days maximum). 2. 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 分离胶缓冲液 27.23 g Tris base (18.15 g/100 ml) 80 ml deionized water Adjust to pH 8.8 with 6 N HCl. Bring total volume up to 150 ml with deionized water and store at 4 °C. 3. 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 浓缩胶缓冲液 6 g Tris base 60 ml deionized water Adjust to pH 6.8 with 6 N HCl. Bring total volume up to 100 ml with deionized water and store at 4 °C. 4. Sample Buffer 上样缓冲液 5.55 ml deionized water 1.25 ml 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 3.0 ml glycerol 0.2 ml 0.5% (w/v) bromophenol blue 10.0 ml Total Volume Store at room temperature. Use: Dilute the sample at least 1:2 with sample buffer and heat at 95 °C for 4 minutes. 5. 10x Electrode (Running) Buffer, pH 8.3 电极缓冲液 30.3 g Tris base (15 g/l) 144.0 g Glycine (72 g/l) Bring total volume up to 1,000 ml with deionized water. Do not adjust pH. Gel Formulations (10 ml) 1）. Prepare the monomer solution by mixing all reagents except the TEMED and 10% APS. Degas the mixture for 15 minutes.
试剂配制： （1）30%聚丙烯酰胺贮液：将聚丙烯酰胺（电泳级）150g，N,N′—甲叉双丙烯酰胺（电泳级）4g溶剂于400ml双蒸水中，补充双蒸水至500ml，滤纸过滤后，于棕色瓶中4℃避光保存。 （2）1.5mol/l Tris碱（pH8.8）：将90.75Tris碱溶解于400ml双蒸水中，用1mol/l HCl调至pH8.8，补充双蒸水定容至500ml，4℃冰箱保存。 （3）1.0mol/l Tris碱（pH6.8）：将12.1Tris碱溶解于80ml双蒸水中，用1mol/l HCl调至pH6.8，补充双蒸水定容至100ml，4℃冰箱保存。 （4）10%SDS：将10gSDS溶剂于100ml双蒸水中，混匀后，室温保存。 （5）10%过硫酸铵：将0.1过硫酸铵（电泳级）溶解于1ml双蒸水中（用时加水溶解），4℃冰箱保存。 （6）10倍电泳缓冲液（25mmolTris,192mmol甘氨酸，0.1%SDS，pH8.3）：在10L大玻璃管中加8L双蒸水，303gTris碱，1442g甘氨酸，100gSDS溶解后调pH8.3补水至10L，混匀后，室温保存。 （7）样品缓冲液：将1.6ml10%SDS，0.8ml甘油，1.0ml1.0mol/l Tris（pH6.8），加入到4.0ml 双蒸水中，加0.01%溴酚蓝，0.4ml巯基乙醇。 （8）染色液配制 0.25%考马斯亮蓝（CCB）染色液：考马斯亮蓝R-250甲醇-醋酸混合液。取1.25g考马斯亮蓝R-250，溶于227ml蒸馏水中，加甲醇227ml，再加入冰乙酸46ml（近似5:5:1）搅拌使其充分溶解，室温保存备用。 （9）脱色液配制：甲醇：水：醋酸=5:5:1混合备用。或用20%乙醇水溶液。 实验步骤 1待测蛋白样品制备 （1）根据每种方法提取的蛋白，用含SDS的样品缓冲溶液溶解，充分溶解后沸水加入3-5min，1600r/min离心5min，取3上清液进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。 （2）用不含SDS的样品缓冲液溶解蛋白，充分溶解后沸水加入3-5min，1600r/min离心5min，取上清液进行无SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。 垂直板状SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制 1 安装：根据电泳仪说明书安装在灌胶架上。 2根据下表配制分离胶溶液 加入1过硫酸铵，立即摇匀，将其迅速、联系地灌注在两块玻璃板的间隙中，高度据玻璃上边2cm。之后，用带有针头的注射器小心的在丙烯酰胺溶液的上部覆盖上一层去离子水（不要冲击胶面），在室温下垂直放置30min左右，使其完全聚合凝固。 吸出覆盖层溶液，用去离子水洗涤顶部1-2次，弃去多余的溶液。将配置好的浓缩胶溶
各类试剂 DNA extration buffer(1000ml)： 1M Tris-HCl（PH8.0） 100ml 0.5M EDTA 40ml 5 M NaCl 100ml 10%SDS 150ml DH2O 610 0.5M EDTA(pH8.0)：46.53g(EDTA含2份结晶水，fw＝372.2)溶至200ml， 加入4gNaOH调PH=8.0,最后调至250ml； 0.5M EDTA(pH8.0)：46.53g(EDTA含2份结晶水，fw＝372.2)溶至200ml 加入5gNaOH调PH=8.0,最后定容至250ml 5×TBE（1L）: 54g Tris,27.5g硼酸；20ml 0.5M EDTA(pH8.0) 1×TBE:（5×TBE稀释5倍） NaOH溶液(400ML):6g NaOH;0.076g四硼酸钠； NaOH溶液(20L): 300g NaOH;3.8g四硼酸钠； 40％page：Acrylamide 38g；N-N-Methylenehisacny lamide 2g； ddH2O定容100ml。 APS: 4克过硫酸氨配成40ml 固定液中甲醛加入量：400ml NaOH溶液加1.6ml 染色液：AgNO3 0.05%--0.1%
固定液： NaOH 15g/l 甲醛 4ml/l 硼砂 0.2g/l 6%非变性PAGE胶配制如下（1块胶）： 5×TBE 5ml 40%PAGE 3.75ml H2O 16ml APS 200-250ul TEMED 12 ul
DNA提取 1. 在50 ml带盖离心管中加入10~15 ml抽提液(100 mmol/L Tris-HCL pH8.0，20mmol/L EDTA，500 mmol/l NaCl，1.5% SDS)，在66°C水浴中预热； 2. 取剪小的水稻叶片放在研钵内，倒入液氮，磨成细粉，迅速转入经预热的抽提液中，混匀；66°C水浴30 min，保温期间搅动几次； 3. 放在摇床上缓慢振荡（60 rpm）10~20 min； 4. 加入10~15 ml氯仿，内含4%（V/V）异戊醇，10~20%（V/V）乙醇，混匀，继续缓慢振荡20 min； 5. 在室温下离心（3000rpm）20 min； 6. 将上清液倒入50 ml离心管，加入0.8至1倍经4°C预冷的异丙醇，混匀，在室温下放置片刻，出现纤维状沉淀； 7. 在室温下离心（3000rpm）10 min； 8. 弃上清液，然后加入75%乙醇震荡洗涤； 9.在室温下离心（3000rpm）10 min； 10. 弃乙醇，倒置晾干； 11. 加入1 ml 1×TE并溶解，溶解后转移入1.5ml 离心管中，贮藏于-20°C待用.
SDS-PAGE配方 1. 30% Acry溶液(4摄氏度) 丙烯酰胺 29.2g N,N-亚甲基双丙烯酰胺 0.8g 定容至100ml 2. 10% SDS（W/V）（室温） SDS 10g 定容至100ml 3. 1.5M Tris-HCl pH 8.8(分离胶缓冲溶液)（4摄氏度） Tris 18.15g 用6N HCl 调制pH 8.8 定容至100ml 4. 0.5M Tris-HCl, pH 6.8(浓缩胶缓冲溶液)（4摄氏度） Tris 6g 用6N HCl 调制pH 6.8 定容至100ml 5.上样缓冲液（室温） A液：（A液总量9.5ml）超纯水 3.55 ml 0.5M Tris-HCl, pH 6.8 1.25 ml 甘油（即丙三醇） 2.5ml 10% SDS 2.0ml 0.5%(W/V)溴酚蓝 0.2ml 用时取A液950ul,加入50ul β-巯基乙醇（即巯基乙醇） 样品：上样缓冲液为1：2 95℃加热 4 min 6. 10×电极缓冲液 pH8.3 (4摄氏度) Tris 30.3g 甘氨酸 144.0g SDS 10.0g 定容至1000ml（即1L） 注意！！不调pH!! 用时，稀释10倍，在室温下使用 7.10%（W/V） APS (过硫酸铵) 100mg 过硫酸铵加入1ml的超纯水
明胶酶谱配方 1. 1%明胶溶液 1g明胶60℃溶于水中定容至100ml，4℃下贮存 2. 5×上样缓冲溶液 50%甘油、5%SDS、0.05%溴酚蓝、250mM Tris-Hcl pH 6.8 3. 10×电极缓冲液 Tris 30.3g、甘氨酸 144g、SDS 10g定容至1000ml pH 8.3）； 4. 聚丙烯酰胺凝胶电泳贮液： ①30%丙烯酰胺溶液丙烯酰胺29.2g，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺0.8g避光定容到100ml ②分离胶缓冲溶液 1.5M Tris-HCl pH 8.8 ③浓缩胶缓冲溶液 0.5M Tris-HCl, pH 6.8 ④10%SDS溶液； ⑤10%过硫酸铵溶液； 5. 2.5% Triton X-100溶液； 6. 染色液 90mL 等体积甲醇(45ml)与水(45ml)混合液加入10ml冰乙酸中溶解0.25g考马斯亮蓝R-250 7. 脱色液 300ml甲醇，100ml冰乙酸加水定容至1000ml 8. 明胶酶谱孵育液 50mM Tris-HCl，10mM CaCl pH 7.0 2 9. 考马斯亮蓝G-250染液 0.1g考马斯亮蓝G-250溶于95%乙醇中，加入100ml 85%浓磷酸加水定容至1000ml 10. 10Mm EDTA二钠溶液
凝胶电泳各试剂配制 （1）10000mg/L苄嘧磺隆母液：称取60%的苄嘧磺隆颗粒500mg于灭菌的棕色 试剂瓶，再加入30mL灭菌的蒸馏水，每次使用前混匀再吸取。 （2）10000mg/L乙草胺母液：吸取500ul 89%的乙草胺，再加入49mL分析纯甲醇溶解。 （3）30%丙烯酰胺混合液（50ml）：称取丙烯酰胺14.5g，甲叉双丙烯胺酰胺O 30ml溶解，定容到50ml，于棕色瓶中4℃保存。 0.5g，加ddH 2 （4）1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8(100ml):称取Tris18.17g于烧杯中加入ddH2O 80ml溶解，用浓盐酸于25℃下调pH为8.8，定容到100ml，高温灭菌室温保存。（5）1.5mol/L Tris-HCl pH 6.8（50ml）：称取Tris 9.08g于烧杯中加入O 30ml溶解，用浓盐酸于25℃下调pH为6.8，定容到50ml，高温灭菌室温 ddH 2 保存。 （6）10%SDS：称取2gSDS粉末于20ml水中37℃1h水浴。 （7）TEMED（四乙基乙二胺）原液 （8）10%过硫酸铵:称取0.15g过硫酸铵溶于1.5mldH2O中，4℃保存，一星期可用。 （9）2×样品缓冲液（10ml）：2.5ml 1.5mol/L的Tris-HCl(pH6.8),0.5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，2ml 1%溴酚蓝，2.5ml蒸馏水。配好 后按每管500ul分装好与-20℃保存待用。 （10）Tris-甘氨酸电极缓冲液（5×）：称取Tris 15.1g，甘氨酸94g，SDS 5g，加蒸馏水约800ml，溶解后用蒸馏水定容至1000ml。临用前稀释10倍。 （11）50%甘油：水：甘油=1:1，高温灭菌，4℃保存。
（1）Acr-Bis液（丙烯酰胺溶液）500 mL：于800 mL洁净的烧杯中，依次称取双丙烯酰胺4 g，丙烯酰胺146 g，缓慢倒入双蒸水约350 mL，以玻璃棒缓慢搅拌促进溶解。注意，双丙烯酰胺粉末易漂浮在空气中，所以要称重时注意周围空气流速，称取丙烯酰胺时可以将烧杯中的双丙烯酰胺掩盖。玻璃棒搅动幅度不要太大以免溶液底部的双丙烯酰胺浮起并扩散到空气中。完全溶解的溶液应清澈无色透明。待溶解完全后补加双蒸水至500 mL，倒入无色玻璃试剂瓶中，4℃冰箱可保存10个月。 （2）4×分离胶缓冲液，500 mL：于500 mL洁净的量筒中，依次加入375 mL 2 M Tris-HCl (实测pH 8.9±0.1，25℃)，100 g/L SDS 溶液（冰箱取出后可微波加热促进储存液的溶化）20 mL，最后加入适量双蒸水至500 mL。倒入无色玻璃试剂瓶中，4℃冰箱最少可保存12个月。有时冰箱温度过低会使储存液混浊，微波略微加热使其澄清后即可使用。 （3）100 g/L 过硫酸铵溶液(ammonium persulfate, AP)20 mL：2g过硫酸铵加20 mL 双蒸水，倒入无色塑料试剂瓶中，4℃冰箱最少可保存10个月。注意配胶时不要交叉污染TEMED，可以以5 mL分装到4个无色塑料试剂瓶中分别保存。 （4）TEMED 成品液：购买后分装成2或5 mL小管装使用可避免母液受到污染。 （5）5×样品缓冲液，100 mL：依次加入50 mL 75%（v/v）甘油，20 mL 100 g/L SDS 溶液，10 mL 10 g/L 溴酚蓝溶液，5 mL 2 M Tris-HCl (实测pH8.9±0.1，25℃)，5 mL巯基乙醇，9 mL 双蒸水。混合母液倒入无色玻璃试剂瓶中，4℃冰箱至少可保存12个月。可分装成10 mL 使用，不会使母液受到蛋白污染。 （6）10×电泳缓冲液，1000 mL：称取10 g SDS，30 g Tris base，144g 甘氨酸（事先要明确甘氨酸溶液的颜色，选用溶解后澄清无色的产品）于1000 mL的烧杯中，加水约700 mL 溶解，可微波炉加热（< 80℃）以促进溶解，注意不要使其沸腾，加热至烧杯烫手即可，间歇用玻璃棒搅拌。分装至无色玻璃试剂瓶中，室温最少可保存6个月。其pH值约为pH 8.4±0.1。 【注意可省去pH6.8的浓缩胶缓冲液，用4×分离胶缓冲液pH8.9的替代即可】 【三】12% 电泳胶的配制 要注意的是，配胶时分离胶的五个组分按下表依次加入洁净的配制分离胶的小烧杯内，以枪头搅拌约10-20 sec，灌胶后再在胶面上小心地铺上一几毫米厚的水层（这可使凝固后的胶面平滑整齐），然后于37℃凝固15-30 min。而在配胶时浓缩胶只加前三个组分，混合液要于4℃冰箱保存，待分离胶凝固后再取出加入AP和TEMED溶液，枪头搅拌均匀，灌胶后插入梳子，然后于37℃凝固15-30 min。凝固的胶连带其附着的玻璃板用塑料薄膜严密包裹可在4℃冰箱保存2-4天，长时间保存易干胶，要重新做胶。 12% 电泳胶的配制（10mL) Table 12% Gel components Reagents Seperating gel Condensing gel 二块 30% Acr-Bis solution 4 mL 0.67 mL 4×seperating gel buffer 2.5 mL pH8.9 1 mL pH8.9 H2O 3.5 mL 2.3 mL
双向试剂 第一向等电聚焦：胶条、水化液、矿物油。 第二向SDS PAGE：30% Acrylamide/Bis Solution,37.5:1,10% (w/v)SDS Solution, 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8，Ammonium Persulfate，TEMED,Tris/Glycine/SDS。 染色：考马斯亮蓝染色。 双向电泳中溶液配制 水化上样缓冲液（I）：尿素8M 4.805g CHAPS 4% 0.4g DTT 65mM 0.098g（现加） Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40%）（现加） 溴酚蓝0.001% 10μl（1% 溴酚蓝） MilliQ水定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。 （一般推荐先用这个） 水化上样缓冲液（II）：尿素7M 4.2g 硫脲2M 1.52g CHAPS 4% 0.4g DTT 65mM 0.098g（现加） Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40%）（现加） 溴酚蓝0.001% 10μl（1% 溴酚蓝） MilliQ水定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。 水化上样缓冲液（III）：尿素5M 3.0g 硫脲2M 1.52g CHAPS 2% 0.2g SB 3-10 2% 0.2g DTT 65mM 0.098g（现加） Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40%）（现加） 溴酚蓝0.001% 10μl（1% 溴酚蓝） MilliQ水定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。 胶条平衡缓冲液母液：尿素6M 36g SDS 2% 2g Tris-HCl 0.375M pH8.8 25ml（1.5M pH8.8 Tris-HCl） 甘油20% 20ml MilliQ水定容至100ml；分装成10管，每管10ml，-20℃冰箱保存。 胶条平衡缓冲液I：胶条平衡缓冲液母液10ml DTT 0.2g 充分混匀，用时现配。 胶条平衡缓冲液II：胶条平衡缓冲液母液10ml 碘乙酰胺0.25g 充分混匀，用时现配。 低熔点琼脂糖封胶液：低熔点琼脂糖0.5% 0.5g
电泳相关溶液的配置： 1、30%丙稀酰胺混合溶液（100ml）：称取29g丙稀酰胺和1g bis丙稀酰胺，用水溶解定容到100ml，过滤，4摄氏度保存一个月。 2、5×SDS电极缓冲液：称取Tris base15.1g，甘氨酸94.g，SDS 5.g 加dH2O定容至1000ml。 3、2×样品缓冲液（10ml）：甘油2ml，溴酚蓝0.0202g，1MTris·Cl （pH6.8）1ml巯基乙醇0.14ml，10%SDS 4ml。 4、染色液的配制（1000ml）: 用量筒分别量取250ml甲醇或者乙醇、80ml乙酸；在电子天平上称取0.125%考马斯亮蓝R250 1.25g，再将其一一加到1000ml锥形瓶中，用蒸馏水加以补足至1000ml。加入的先后顺序为：考马斯亮蓝R250，甲醇或者乙醇，蒸馏水，乙酸。充分混匀后进行过滤，收集滤液备用。当过滤速度变慢时要更换滤纸，快速过滤完，不可隔夜以免影响染色效果。 5、脱色液（1000ml）: 用量筒分别量取250ml甲醇或者乙醇、80ml乙酸、670ml蒸馏水加入烧杯中，待溶液混和均匀后加入盛脱色液的广口瓶；备用。 收集液的SDS-PAGE分析： 1、取20ul收集液，加入5×样品缓冲液5ul，在80℃水浴锅中煮5min。
分离胶配方 Resolving Gel (10ml)6%8%10%12%15% H2O 5.4 4.7 4.1 3.4 2.4 30% acrylamide mix 2.0 2.7 3.345 4x resolving-gel buffer 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 20% SDS0.050.050.050.050.05 20% APS0.050.050.050.050.05 TEMED0.0080.0060.0040.0040.004 浓缩胶配方（10ml） H2O 6.9 ml 30% acrylamide mix 1.7 ml 8x stacking-gel buffer1.25 ml 20% SDS0.05 ml 20% APS0.05 ml TEMED0.01 ml 2、按照上面配方制SDS-PAGE凝胶，安装好电泳仪，在槽中加入电极缓冲液。 3、按一定顺序在加样孔中加入样品。 4、打开电源将电压调到80v，待样品跑过压缩胶后将电压调到120v至样品电泳到胶底部为止。 5、将凝胶小心取下放入容器中，加入染色液，用摇床摇2－3h 6、待条带清晰后倒出染色液，加入脱色液过夜 7、将脱色液倒掉，在灯箱下观察 8、用数码相机拍照，分析。
wb实验中电泳液配制方法 导言 在分子生物学研究中，常常需要进行核酸电泳实验来分析和比较DNA或RNA片段的大小和纯度。为了保证电泳实验的准确性和可重复性，我们需要正确配制电泳液。本文将详细介绍wb实验中电泳液的配制方法，包括所需试剂、具体操作步骤以及常见问题和注意事项。 试剂准备 1. 缓冲液 •Tris缓冲液 –Tris-HCl (pH 8.0) 1 M – 1 M Tris-HCl (pH 8.0) 用于配制1× Tris缓冲液 •TAE缓冲液 –50× TAE缓冲液：242 g Tris base、57.1 ml 0.5 M EDTA、114.1 ml 10% 醋酸溶液 (pH 8.0)，用去离子水加至1 L –1× TAE缓冲液：将50× TAE缓冲液按需稀释至所需体积 •TBE缓冲液 –10× TBE缓冲液：108 g Tris base、55 g Boric acid、40 ml 0.5 M EDTA，用去离子水加至1 L –1× TBE缓冲液：将10× TBE缓冲液按需稀释至所需体积 2. 电泳液 •TAE电泳液：1× TAE缓冲液中加入适量的琼脂糖 (通常为0.8-1.0%)•TBE电泳液：1× TBE缓冲液中加入适量的琼脂糖 (通常为0.8-1.0%) 3. 变性载体 •DNA标记物 (e.g. DNA分子量标记物) •RNA标记物 (e.g. RNA分子量标记物)
4. 负载缓冲液 •6×蓝酶载体缓冲液：300 μl 10% SDS、60 μl Bromophenol Blue、9 ml 水，加Tris缓冲液至15 ml •6×酚红载体缓冲液：300 μl 10% SDS、60 μl Phenol Red、9 ml 水，加Tris缓冲液至15 ml 操作步骤 1. 缓冲液配制 1.根据所需实验类型选择合适的缓冲液 (TAE或TBE) 2.准备所需量的缓冲液配方中的试剂 3.按照配方比例将试剂溶解在去离子水中 4.使用溶液计准确计量，搅拌均匀直至完全溶解 5.调整pH值 (如有需要) 并使用其他试剂完全溶解 2. 电泳液配制 1.根据所需实验类型选择合适的电泳液 (TAE或TBE) 2.按照所需体积计算电泳液的配方 3.加入适量的琼脂糖，通常为0.8-1.0% 4.搅拌均匀直至琼脂糖完全溶解 5.如有需要，使用滤纸过滤液体以去除悬浮物 3. 变性载体准备 1.准备所需的DNA或RNA标记物 2.根据标记物浓度和所需载体浓度计算添加的体积 3.加入足够的载体缓冲液，使标记物达到所需浓度 4.混合均匀，避免气泡形成 5.如有必要，对混合物进行热变性 4. 负载缓冲液配制 1.准备所需量的蓝酶载体缓冲液和酚红载体缓冲液 2.按照配方比例将试剂溶解在去离子水中 3.使用溶液计准确计量，搅拌均匀直至完全溶解 4.负载缓冲液可根据实验需要在电泳液中稀释或直接加入样品中
1、电泳缓冲液，pH8.3 Tris 3.03g Gly(甘氨酸) 14.4g SDS 1g ，加水至1000 ml。 转印缓冲液 Tris 3.033g , Gly14.42g, 甲醇200ml, 加水至1000ml。 2、交联剂：acrylamide(Acr)丙烯酰胺，29.2g methylene-bisacrylamide(Bis)甲叉双丙烯酰胺，0.8g 加水至100ml, 4℃避光保存。 3、APS：现用现配，用量少，10%APS配制，0.1gAPS加水1ml,可放置一周。 4、分离胶(Separating Gel ) 7.5%分离胶10%分离胶 water 8.74 ml 17.47ml water 7.24ml 14.47ml 1.5M分离胶缓冲液 4.5 ml 9.0 ml5M分离胶缓冲液 4.5 ml 9.0 ml 10%SDS 180 ul 360ul10%SDS 180 ul 360ul Arc-Bis 4.5 ml 9.0ml Arc-Bis 6.0 ml 12.0 ml 10%APS 90ul 180ul 10%APS 120 ul 240 ul TEMED(不能提前加) 12ul-24ul 24-48ul TEMED 12ul-24ul 24-48ul 总量18ml 总量36ml 总量18ml 总量36ml 25-200KD 用此 15-100 KD用 10、4%浓缩胶（Stacking Gel，总10ml） 浓缩胶缓冲液 2.5 ml 5.0ml 10%SDS 100 ul 200ul Arc-Bis 1.33 ml 2.67ml 10%APS 100 ul 200ul water 6.1 ml 12.2ml TEMED 10-20 ul 20-40ul 11、TBS (pH 7.2) 10×TBS： Tris 60.57g Nacl 87.66g 浓HCL 33 ml H2O 至1000ml 调pH至7.4 12、TBST：10×PBS 100 ml，加0.5ml Tween-20 (0.5%)，加水至1000ml，调pH至8.0。
1 SDS-PAGE电泳试剂配制 30% Acr/Bis：Acr 29.2 g，Bis 0.8 g，混匀后加蒸馏水，37℃溶解，定容至 0.1 L，棕色瓶存于4℃。 1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）：Tris base 18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调pH至8.0，定容至0.1 L，4℃保存。 1M Tris-HCl（pH 6.8）：Tris base 12.11g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8，定容至0.1 L，4℃保存。 10% SDS：电泳级10 g加蒸馏水68℃助溶，浓盐酸调至pH 7.2，定容至0.1 L。 10% APS：1 g过硫酸铵加蒸馏水至10 mL。 电泳缓冲液（pH 8.3）：Tris 3.02 g，Gly 18.8 g，10% SDS 10 mL加蒸馏水溶解，定容至1 L。 电泳上样缓冲液Loading Buffer：1M Tris-HCl（pH 6.8）1 mL， -巯基乙醇1 mL，SDS 0.4 g，甘油2.0 mL，0.1% 溴酚蓝1.0 mL，蒸馏水5.0 mL。 考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R250 0.15 g，甲醇45 mL，冰醋酸10 mL，ddH2O 45 mL。 脱色液：甲醇45 mL，冰醋酸10 mL，蒸馏水45 mL。 15%分离胶配方：蒸馏水2.3 mL，30% Acr/Bis 5.0 mL，1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）2.5 mL，10% SDS 0.1mL，10% 0.1 mL，TEMED 4 uL。 5%浓缩胶配方：蒸馏水3.3 mL，30% Acr/Bis 4.0 mL，1.0 M Tris-HCl（pH 6.8）0.38 mL，10% SDS 0.03 mL，10% AP 0.03 mL，TEMED 3.0 uL。 2 SDS检测原核蛋白的表达 （1）组装胶架：玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。） （2）灌制分离胶：配制15％分离胶，加入TEMED 后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用3 mL的吸管吸取适量的胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水液封。当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝固。数分钟后使胶充分凝固即可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。 （3）灌制浓缩胶：配制5％的浓缩胶,加入TEMED 后立即摇匀即可灌胶，将剩
8%Gel 5ml10ml15ml20ml 30%Acr 1.3 2.7 4.0 5.3 1.5M Tris-HCl (8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 10%SDS0.050.10.150.2 10%APS0.050.10.150.2 TEMED0.0030.0060.0090.12 10%Gel 5ml10ml15ml20ml 30%Acr 1.7 3.3 5.0 6.7 1.5M Tris-HCl (8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 10%SDS0.050.10.150.20 10%APS0.050.10.150.20 TEMED0.0020.0040.0060.008 12%Gel 5ml10ml15ml20ml 30%Acr 2.0 4.0 6.08.0 1.5M Tris-HCl (8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 10%SDS0.050.10.150.20 10%APS0.050.10.150.20
15%Gel 5ml10ml15ml20ml 30%Acr 2.5 5.07.510.0 1.5M Tris-HCl (8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 10%SDS0.050.10.150.20 10%APS0.050.10.150.20 TEMED0.0020.0040.0060.008 30%Acr0.670.83 1.0 1.4 1.5M Tris-HCl (6.8)0.50.630.75 1.0 10%SDS0.040.050.060.08 10%APS0.040.050.060.08 TEMED0.0040.0050.0060.008
1.电泳液配方：5×（使用时稀释1×使用） Tris/Triz：7.55g（红） Gly（甘氨酸）：47g（蓝） SDS:2.5g（绿） 蒸馏水：500ml 2.TBST：(500ml，5×）稀释1×使用 NaCl：22g 1M Tris-HCl（PH=8.0):50ml 水：400ml Tween（吐温）20：1.25ml 定容：500ml 或TBSB 10×（50ml+450ml蒸馏水定容至500ml） 3.转膜液：（1×，1L)半干转 Gri：2.9g SDS:0.37g 湿转：Gly： Yriz： SDS: *封闭液：TBS Borine serum Album in 0.9g+TBST 1×30ml（两个，离心管，混匀） 1.2gBSA+TBST 1×40ml 4.完全培养基制备： 2管血清FBS (15％） 2％双抗 600ul/500ul两性（配置100pg/ml） 以上于（F-12）培养基中 *60ml 1ng/ml 加入54你ml完全培养基中 100pg/ml×（X+完全培养基）=100pg/ml×X X=完全培养基量/9 Xml＞500+X X：500=1：9 成纤维细胞；前14天用全加，接板后用含TGF-β全加 巨噬细胞：第1天用不含，第2-6天用含 95％酒精转75％酒精： V（95％）=15/19V（75％） V（75％）=19/15V（95％） 5.MH平板配方： 200ml水 4.2gMH（高压灭菌锅灭菌） 3g琼脂
6.LB培养基： 胰蛋白胨：1g 酵母提取物：0.5g NaCl：1g 蒸馏水：100ml 7.TG3％（促进小鼠巨噬细胞分化转化溶液）： TG（BD)1.5g+蒸馏水50ml（瓶子别扭太紧，防止爆裂）0.6g 20ml 121℃15min （0.6g+20ml蒸馏水） 8.50％甘油200ml=100ml丙三醇+100ml蒸馏水（121℃15min ） 9.乳酸菌培养基：1.8284g：35ml水
电泳相关溶液配制LT
1.将过硫酸铵倒入2ml的离心管中，加 1mL 去离子水，用漩涡振荡器震荡溶 解，贮存于 4℃。 备注(Remark)：10%过硫酸铵溶液在 4℃保存可使用 2 周左右，超过期限会失去催化作用。 4%分离胶 品名(Name) 单位 (Unit) 配方量 (Prescription) 实际称量 (Actual usage) 备注 (Remark ) 纯水ml 11.9 30%丙烯酰胺ml 5.4 1.5M Tris-HCl(pH8.8) ml 10 10%SDS μl 200 10%过硫酸铵μl 200 TEMED μl 12 1．按照配方依次将纯水、30%丙烯酰胺、1.5M Tris-HCl(pH8.8)、10%SDS、10%过硫酸铵、TEMED加入100ml的烧杯中，加入搅拌子，用磁 力搅拌器搅拌均匀。 备注(Remark)：TEMED为交联剂，应最后加入，以防胶凝固。 20% 分离胶 品名(Name) 单位 (Unit) 配方量 (Prescription) 实际称量 (Actual usage) 备注 (Remark ) 纯水ml 1.3 30%丙烯酰胺ml 13.3 1.5M Tris-HCl(pH8.8) ml 5 10%SDS μl 200 10%过硫酸铵μl 200 TEMED μl 8
1．按照上述配方依次将纯水、30%丙烯酰胺、1.5M Tris-HCl(pH8.8)、10%SDS、10%过硫酸铵、TEMED加入100ml的烧杯中，加入搅拌子， 用磁力搅拌器搅拌均匀。 备注(Remark)：TEMED为交联剂，应最后加入，以防胶凝固。 5%积层胶 品名(Name) 单位 (Unit) 配方量 (Prescription) 实际称量 (Actual usage) 备注 (Remark ) 纯水ml 10.2 30%丙烯酰胺ml 2.55 1.5M Tris-HCl(pH8.8) ml 1.875 10%SDS μl 150 10%过硫酸铵μl 150 TEMED μl 15 1．按照上述配方依次将纯水、30%丙烯酰胺、1.5M Tris-HCl(pH8.8)、10%SDS、10%过硫酸铵、TEMED加入100ml的烧杯中，加入搅拌子， 用磁力搅拌器搅拌均匀。 备注(Remark) TEMED为交联剂，应最后加入，以防胶凝固。 10*电泳液品名(Name) 单位 (Unit) 配方量 (Prescription) 实际称量 (Actual usage) 备注 (Remark ) Tris base g 30 甘氨酸g 144 SDS g 10 纯水ml 定容至1000