核酸的定量与纯度的测定
在分子生物学实验中，核酸提取需要进行其纯度和浓度的测定。目前实验室常用的测定方法主要有分光光度法、荧光染料法、PCR法和杂交定量法等。
分光光度法
分光光度法主要包括紫外分光光度法、定糖定磷法及基于酶催化的核酸定量方法等。（1）紫外分光光度法
紫外分光光度法基于DNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，DNA/RNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm 处。因此，可以用260nm波长进行分光测定核酸浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA，单链DNA浓度约为33μg / ml，RNA约为40μg/ml，寡核苷酸约为35μg/ml。如用1cm 光径，用H2O稀释DNA/RNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：
DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000
RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数/1000。
A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。假如比值低，表示受到蛋白（芳香族）或分类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5相当于50%蛋白质/DNA溶液。
A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA 和RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。
A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度，该值应该接近0.0。假如不足，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。
实验步骤
1、将制备的DNA悬浮溶解于TE缓冲液中pH8.0，10mmo1/L的Tris缓冲液，内含(1mmol/L EDTA)或悬浮溶解在灭菌水中(依据DNA含量加水)。
2、用可扫描的紫外分光光度计测定制备的DNA/RNA的紫外吸收曲线，测定OD260和OD280，并计算比值：OD260/OD280，纯DNA的此比值约为1.8～2.0。纯RNA的此比值
约为大于2.0。
3、根据每毫升1微克的纯DNA的OD260值=0.020，计算所得DNA的纯度；每毫升1微克的纯RNA的OD260值= 0.025，计算所得RNA的纯度。
注意事项
OD值范围应该在0.1～0.99之间，否则不符合上述线性关系。
A260/A280比值可提供DNA纯度的一个参考，但A260/A280 比值会受pH影响。如果未调pH，比值可能与实际差别很大。如果需要准确数值，建议在10 mM Tris Cl，pH 8.5中检测，此时纯净的DNA A260/A280比值应为1.8-2.0（注意应使用同样缓冲液作为对照）。常见问题分析
1、DNA浓度测定的OD260/OD280比值大于1.8，说明存在RNA，可重新用RNaseA处理，酚：氯仿：异戊醇（23：24：1）抽提；DNA浓度测定的OD260/OD280比值小于1.8，则说明有蛋白质等杂质存在，需再用蛋白酶K、SDS及盼、氯仿、异戊醇重新对DNA进行纯化（也可加入1/8体积的3M NaAc(pH5.2)与冷乙醇一同促使DNA沉淀析出。
RNA浓度测定OD260/OD280比值小于1.8时，说明溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显；OD260/OD280比值大于2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。
2、采用紫外检测法测核酸含量的优缺点：用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，具有简单、快速、灵敏度高的优点，并且待测核酸样品中含有的微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质，产生较小测定误差。但该法在测定样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质时，则会产生较大测定误差，需要设法事先除去。
3、样品中含有核苷酸类杂质：假如样品中蛋白质、核苷酸类物质较多可以通过离子层析柱进一步提纯，再用紫外吸收法测定。
4、样品体系中其它物质对实验结果有干扰：蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm处，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA在260nm与280nm 处的吸收比值在2.0以上，DNA的比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时，比值即下降。
（2）定糖定磷法
定糖定磷法是通过测定核酸中戊糖和无机磷含量实现对核酸含量的测定。该法无需特殊仪器，只需要将地衣酚、二苯胺及钼酸铵等与核酸样品反应，再通过分光光度计测定光吸收值即可定量核酸。但此法准确度差、灵敏度低、干扰物多、操作繁琐，在现今的研究中已较
少采用。比如二苯胺法是利用脱氧核糖核酸中的α—脱氧核糖在酸性环境中变成ω—羟基—γ酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在595nm处有最大的吸收，在每毫升含DNA20-400微克范围内，光密度与DNA的浓度成正比，在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。除DNA外，脱氧木糖、阿拉伯糖也有同样的反应。
1、DNA标准曲线的制作
取8支试管，编号，以一定的梯度依次加入不同浓度的DNA溶液和二苯胺试剂试剂。加毕，摇匀，于60℃恒温水浴中保温1小时，（或于沸水中煮沸15分钟，冷却测0.D595nm 值）。以光密度为纵坐标，DNA含量（ug/ml）为横坐标，绘制标准曲线。
2、样品的测定
取2支试管，各加0.2-0.5毫升的待测液（内含DNA应在标准曲线可测范围之内）加蒸馏水稀释至2毫升，再加4毫升二苯胺试剂，摇匀，其操作步骤与标准曲线的制作相同。根据测得的光密度值，从标准曲线上查出相当该光密度DNA的含量，按下式计算出样品中DNA的百分含量。
DNA含量/毫升待测液=标准曲线查得值×稀释倍数
注意事项
1、二茉胺法测定DNA含量灵敏度不高，待测样品中DNA含量低于50mg/L即难以测定。乙醛可增加二苯胺法测定DNA的发色量，又可减少脱氧木糖和阿拉伯糖的干扰，能显著提高测定的灵敏度。
2、样品中含有少量RNA并不影响测定，但因蛋白质、多种糖类及其衍生物、芳香醛、羟基醛等能与二苯胺反应形成有色化合物，故能干扰DNA定理。
（3）酶催化法
基于酶催化的核酸定值方法是一种相对核酸定量法。其原理是染料能同时与酶和核酸结合，通过检测酶的催化活性即可实现对核酸的定量。此法的优点在于不需要通过核酸扩增，操作方便，使用的仪器简单。但该法实验中，酶的催化活性受多方面影响，难以达到最佳状态，会使定量结果出现偏差。
荧光染料法
荧光染料法是通过检测荧光试剂与DNA结合后的荧光强度变化而实现对核酸的定量。某些荧光探针试剂本身荧光强度不大，但与DNA 结合后荧光强度大大增强，如：溴化乙锭
在水溶液中的荧光量子产率很低，但它与DNA结合后，产生很强的荧光，激发波长显著红移；又如Hoechst33258是一种双苯并咪唑荧光染料，可高度特异地与双链DNA非嵌入性结合，结合后其荧光率由0.01增至0.6。
荧光染料法适用于样品中DNA或RNA 含量较低或含有较多杂质的样品，绝对灵敏度很高.如利用Hoechst33258可测定纳克级水平的DNA。PicoGreen及SYBR GreenＩ的检测灵敏度较EB和Hoechst33258更高，PicoGreen可检测低至0.25-0.5ng的DNA样品。
目前已有许多商品化核酸定量荧光染料，如Invitrogen公司用于测定双链DNA的PicoGreen、用于测定单链DNA的OliGreen及用于测定RNA含量的RiboGreen等。含这些染料的核酸定量试剂盒被认为是目前对微量核酸定量较准确的方法。
与紫外分光光度法相比，荧光染料法的应用尚不广泛．它存在以下缺陷：（1）某些荧光染料（如EB等）具有极强的毒性和致诱变性；（2）荧光分析对环境因素极为敏感，易受温度、光度、酸度、溶解氧及污染物等干扰；（3）该法需制作标准曲线，操作较复杂；（4）需专业的定量试剂盒，价格昂贵；（5）精确定量需依赖已知浓度的标准物质，而目前缺乏经过精确定值的标准物质，且少数现今采用标准物质（λDNA）的定量方法为紫外分光光度法，这就产生潜在的偏差并使测量结果无法溯源到国际单位制。
PCR法
（1）PCR电泳法
PCR技术检测简便快速、灵敏度高、特异性强、且扩增模式多样，常见的有套式PCR、竞争PCR及终点稀释法等。套式PCR通过嵌套引物的使用进一步增加了标准PCR的特异性和灵敏度。
终点稀释法通过梯度稀释待检样本及分别PCR，直到扩增结果为阴性，依据稀释倍数计算起始靶基因的分子数。这种分析方法的优点是核酸的定量不依赖扩增效率，操作简便，灵敏度高。但每个样品需多次PCR反应，工作量大，且需获得稳定的PCR反应条件。
无论是标准PCR还是改进的套式PCR、竞争PCR及终点稀释法，反应产物均需进行电泳，而电泳图谱只能通过对比明亮度达到相对定量，其检测灵敏度、特异性及定量准确性均较差，且易受多糖、蛋白等杂质及反应体系的影响。
（2）PCR产物微孔板杂交法
PCR产物微孔板杂交法结合了PCR技术、核酸杂交技术及酶联免疫技术，该法具有以
下突出优点：检测灵敏度高于琼脂糖凝胶电泳；显色反应类似酶联免疫检测，特异性强；仪器容易操作，稳定性好，数据读取客观；杂交过程短，可以同时大量检测；可实现PCR产物的定量或相对定量等。但该法操作步骤较繁琐，且放射性物质对人体有害。
（3）实时荧光定量PCR
qPCR技术由Higuchi于1992年提出，其原理是在标准PCR反应体系的基础上加入荧光染料或荧光基团，利用荧光信号的累积实时监测整个PCR过程，最后通过标准品所建立的标准曲线对未知模板进行绝对定量或通过与内标准基因的对比进行相对定量。qPCR技术因其既可定性又可定量、灵敏度高、动态范围广等优点而得到了广泛的认可和应用，已成为核酸定量的主流技术，其常用的荧光标记物质有TaqMan探针、MGB、SYBR、分子信标等。大量的科研工作使用qPCR，每年产生大量的文章，但是在样品质量控制、实验设计、实验指标及实验结果描述等方面尚缺乏共识，使得各种存疑数据得以发表。
（4）数字PCR
dPCR是近年发展起来的一种可实现绝对定量的PCR技术。与传统PCR相比，数字PCR 以大规模集成流路芯片为基础，可将样品分到许许多多个单独的区域进行PCR反应，反应结果报告“有”或“无”。最后通过PCR循环数推算起始模板含量。因此，样品即便含有会产生干扰信号的杂质分子，但由于杂质分子不会发生PCR放大，其信号将不会影响最终检测结果。数字PCR不仅检测灵敏度高（可检测单个DNA分子）、所需样本量少，且准确度好（误差可控制在0.25%以内）、无需标准物质对照，是一种潜在的基因定量标准方法．研究人员已将其应用于疾病及转基因的检测。但该法的主要缺陷是所使用的仪器和耗材十分昂贵，难以在各实验室普及。
总之，灵敏度和特异性均表现优秀的PCR技术检测是现今生物样品中微量核酸检测的现成、有效的方法。但是，PCR扩增普遍遇到的弊端是管与管之间的扩增重复性较差，即使是在最严格的控制条件下其重复性仍难以保证。重复性差的可能原因有仪器性能、反应条件、抑制剂的存在、样品制备差异、核酸纯化和模板的降解等。另外，还存在以下缺点：qPCR 及dPCR等耗材价格昂贵，很难普及；由于定量全过程封闭，不能监测扩增产物的大小；当引物特异性不高时，可能形成假阳性；RNA反转录时各样品的误差太大等。
杂交定量法
杂交定量法主要包括：Southern杂交、Northern杂交、基因芯片、支链信号放大技术及
Rnase保护技术。
Southern杂交特异性强，但操作复杂，灵敏度低。与Southern杂交类似的是用于检测RNA的Northern杂交技术，可用于基因表达量的比较研究。生物芯片是一种高通量的杂交定量技术。该技术以核酸杂交为基础，将短的寡核苷酸或cDNA序列高密度地固定在固相支持物的表面，然后加入已标记的目的序列进行杂交，之后检测荧光信号。由于荧光信号的强度与目标分子的数目成比例，从而实现核酸定量检测。
支链信号放大技术采用了一种人工合成的、结构如同树枝的DNA信号放大探针——分支链DNA，其优点是：（1）只需将释放的核酸变性，样品处理简单；（2）不经过指数增长的扩增过程，避免了扩增产物污染及PCR抑制因素的影响；（3）可高通量检测病原体。但该方法成本较高，且当放大倍数低时，敏感性较差，检测范围窄，不适用于RNA的低浓度检测。RNase保护技术由Zinn于1983年首次提出，此法的灵敏度高于Northern杂交，但成本比较高、放射性同位素有致癌作用，且所转录成的RNA易降解，增加了实验误差。
参考文献
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核酸检测基本知识 1.什么是核酸检测 核酸的定义：核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。 核酸具有非常重要的生物功能，主要是贮存遗传信息 和传递遗传信息。 2.核酸的分类 核酸大分子可分为两类：脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。 3.核酸的组成
DNA和RNA都是由一个一个核苷酸(nucleotide)头尾相连而形成的，由C、H、O、N、P，5种元素组成。DNA是绝大多数生物的遗传物质，RNA是少数不含DNA的病毒（如HIV病毒，流感病毒，SARS病毒等）的遗传物质。RNA平均长度大约为2000个核苷酸，而人的DNA却是很长的，约有3X10^9个核苷酸。 4.核酸的功能 在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的 作用。核酸不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物 合成上也占重要位置，因而在生长、遗传、变异等一系列 重大生命现象中起决定性的作用。 DNA与RNA都是核酸，它们在化学组成上有什么区别如 下： DNA与RNA的比较DNA RNA 主要存在部位细胞核细胞质 基本组成单位脱氧核苷酸核糖核苷酸碱基种类A、G、C、T A、G、C、U 五碳糖种类脱氧核糖核糖 核苷酸链两条脱氧核苷酸链一条核糖核苷酸链 5.检测方法 核酸检测方法，主要通过同时进行靶核酸扩增和可检 测信号的生成来检测样品中的靶核酸。可应用于临床微生
物学、血液筛选、遗传病诊断和预防、法医学等领域的核 酸检测。 目前主要使用的方法有以下几种： a.核酸序列依赖性扩增法 NASBA是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异性 核苷酸序列等温扩增RNA的新技术。反应在42℃进行,可在2h内将RNA模板扩增约109倍。NASBA原理是提取病毒RNA,加入AMV逆转录酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶和引物进行扩增。 整个反应分非循环相和循环相:在非循环相中,引物I与模板RNA退火后在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA,形成RNA:DNA 杂合体,随即RNaseH降解RNA,引物Ⅱ与cDNA退火,在反转录酶作用下合成第2条DNA互补链。双链DNA可在T7RNA聚合酶的作用下,经其启动子序列起动而转录RNA，RNA又可在反转录酶的作用下反转录成DNA，进入循环相,对模板进行大量 扩增。 b.转录介导的扩增技术 TMA技术原理与NASBA基本一致，略有不同之处是TMA利用的是MMLV逆转录酶及T7RNA聚合酶两种酶，MMLV逆转录酶既有逆转录酶的活性又具有RNA酶H活性。反应在41.5℃进行,可在1h内将RNA模板扩增约109倍。 c.连接酶酶促链式反应(LCR) LCR是基于靶分子依赖的寡核苷酸探针相互连接的一种
编号：2-9 主题：digital PCR 概述： Digital PCR（dPCR)即数字PCR，它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR可以直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。数字PCR是最新的定量技术，基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。由于数字PCR能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量，因此特别适用于依靠Real-time PCR的Ct值不能很好分辨的应用领域，例如：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。目的： 对DNA分子的个数进行绝对定量。 原理： 其主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。 步骤： 1.分离并纯化基因组DNA； 2.计划数字PCR实验，确定样品的最佳稀释度，以获得数字PCR答案；
3.上样，将DNA样品与TaqMan Assay以及OpenArray数字PCR预混液上样到OpenArray 384孔板； 4.循环和成像，利用OpenArray AccuFill 系统将反应上样到OpenArray平板。将OpenArray平板插入OpenArray箱中，装满浸液，并用封箱胶水密封。利用OpenArray? 实时定量PCR系统开展读取。 5.快速轻松地获取和分析数据。 流程图：
核酸检测技术的应用 规ELISA检测。部分标本因为ELISA检测项目不合格直接被淘汰而未 进入到核酸检测环节，有303616份标本分别实行混样核酸检测（191222人份）和单人份核酸检测（112394人份）。⑴混样核酸检测：按照试剂盒说明书要求，筛选ELISA检测合格标本实行8个标本混样 核酸检测，无反应性pooling的8个标本视为该项目核酸检测合格， 有反应性pooling实行标本的拆分单检，拆分无反应性的标本判为合格，拆分亦有反应性的标本判为该项目核酸检测不合格。⑵单人份核 酸检测：采用单个标本核酸检测模式，按照试剂盒和全自动核酸检测 设备要求实行检测，检测无反应性的标本视为HBVDNA、HCVRNA、HIV- 1RNA项目联检合格，检测有反应性的标本则视为HBVDNA、HCVRNA、 HIV-1RNA项目联检不合格。 1.2统计学处理采用x²检验,比较各项目不合格率的差异， p<0.05为差异有统计学意义。 2结果 其中112394人份采用单人份核酸检测系统实行检测，检出单独NAT不 合格数148例，不合格率为1.32‰；191222人份标本采用另外的混样 核酸检测系统实行检测，检出单独NAT不合格数63例，不合格率为 0.33‰.两者不合格率比较，有显著性差异（P<0.05）。 单采血小板标本中，采用ELISA方法检测全血标本278214人份，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2三项不合格数2536例，不合格率为 9.1‰；采用ELISA方法检测单采血小板标本27698人份，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2三项不合格数78例，不合格率为2.8‰.两者不合格 率比较，有显著性差异（P<0.05）。 类，一类为NAT反应性而ELISA无反应性，即为单独NAT不合格结果, 此类不合格的检出即为NAT在血液筛查中所发挥的检测效能。另一类 为NAT反应性ELISA亦为反应性。303616份标本中全血标本和单采血
实验酵母RNA的提取及组份鉴定与核酸的定量测定 【课前预习】 1. 为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？ 2．如何从酵母中提取到较纯的RNA? 3．干扰RNA的提取的物质有哪些并设计排除这些干扰的实验。 4．干扰紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度实验的物质有哪些？ 【目的要求】 1. 了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。 2. 了解核酸的组分并掌握其鉴定方法。 3. 学习紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理。 【基本原理】 由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。酵母含RNA达2. 67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解，从水解液中可用定糖，定磷和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。 核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。核酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用来表示。为每升溶液中含有1克
核酸检测技术的应用 1资料与方法 1.1检测方法及判定规则305912份全血标本和单采血小板标本进行常规ELISA检测。部分标本因为ELISA检测项目不合格直接被淘汰而未 进入到核酸检测环节，有303616份标本分别进行混样核酸检测（191222人份）和单人份核酸检测（112394人份）。⑴混样核酸检测：按照试剂盒说明书要求，筛选ELISA检测合格标本进行8个标本混样 核酸检测，无反应性pooling的8个标本视为该项目核酸检测合格， 有反应性pooling进行标本的拆分单检，拆分无反应性的标本判为合格，拆分亦有反应性的标本判为该项目核酸检测不合格。⑵单人份核 酸检测：采用单个标本核酸检测模式，按照试剂盒和全自动核酸检测 设备要求进行检测，检测无反应性的标本视为HBVDNA、HCVRNA、HIV- 1RNA项目联检合格，检测有反应性的标本则视为HBVDNA、HCVRNA、 HIV-1RNA项目联检不合格。 1.2统计学处理采用x²检验,比较各项目不合格率的差异， p<0.05为差异有统计学意义。 2结果 2.1单检模式及混检模式下的NAT结果303616人份标本进行核酸检测，其中112394人份采用单人份核酸检测系统进行检测，检出单独NAT不 合格数148例，不合格率为1.32‰；191222人份标本采用另外的混样 核酸检测系统进行检测，检出单独NAT不合格数63例，不合格率为 0.33‰.两者不合格率比较，有显著性差异（P<0.05）。 2.2全血标本和单采血小板标本ELISA检测结果305912份全血标本和单采血小板标本中，采用ELISA方法检测全血标本278214人份，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2三项不合格数2536例，不合格率为 9.1‰；采用ELISA方法检测单采血小板标本27698人份，HBsAg、抗-
核酸和蛋白质序列分析 在获得一个基因序列后，需要对其进行生物信息学分析，从中尽量发掘信息，从而指导进一步的实验研究。通过染色体定位分析、内含子／外显子分析、ORF分析、表达谱分析等，能够阐明基因的基本信息。通过启动子预测、CpG 岛分析和转录因子分析等，识别调控区的顺式作用元件，可以为基因的调控研究提供基础。通过蛋白质基本性质分析，疏水性分析，跨膜区预测，信号肽预测，亚细胞定位预测，抗原性位点预测，可以对基因编码蛋白的性质作出初步判断和预测。尤其通过疏水性分析和跨膜区预测可以预测基因是否为膜蛋白，这对确定实验研究方向有重要的参考意义。此外，通过相似性搜索、功能位点分析、结构分析、查询基因表达谱聚簇数据库、基因敲除数据库、基因组上下游邻居等，尽量挖掘网络数据库中的信息，可以对基因功能作出推论。上述技术路线可为其它类似分子的生物信息学分析提供借鉴。本路线图及推荐网址已建立超级链接，放在北京大学人类疾病基因研究中心网站 （https://www.doczj.com/doc/aa5197524.html,/science/bioinfomatics.htm）,可以直接点击进入检索网站。 下面介绍其中一些基本分析。值得注意的是，在对序列进行分析时，首先应当明确序列的性质,是mRNA序列还是基因组序列？是计算机拼接得到还是经过PCR扩增测序得到？是原核生物还是真核生物？这些决定了分析方法的选择和分析结果的解释。 （一）核酸序列分析 1、双序列比对（pairwise alignment） 双序列比对是指比较两条序列的相似性和寻找相似碱基及氨基酸的对应位置，它是用计算机进行序列分析的强大工具，分为全局比对和局部比对两类，各以Needleman-Wunsch算法和Smith-Waterman算法为代表。由于这些算法都是启发式（heuristic）的算法，因此并没有最优值。根据比对的需要，选用适当的比对工具，在比对时适当调整空格罚分（gap penalty）和空格延伸罚分（gap extension penalty），以获得更优的比对。 除了利用BLAST、FASTA等局部比对工具进行序列对数据库的搜索外，我们还推荐使用EMBOSS软件包中的Needle软件 （http://bioinfo.pbi.nrc.ca:8090/EMBOSS/），和Pairwise BLAST
核酸含量的测定——紫外吸收法 [原理] 核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基都具有共轭双键 （ -C-C=C-C=C-），在紫外光区的250-280nm 处有强烈的光吸收作用，最大吸收值在260nm 左右。常利用核酸的紫外吸收性进行核酸的定量测定。 核酸的摩尔消光系数ε(P)表示为每升溶液中含有1摩尔原子磷的光吸收值。RNA 的ε(P)260nm （pH7.0）为7 700～7 800，RNA 的含磷量约9.5%，因此每毫升溶液含1μg RNA 的光吸收值相当于0.022～0.024。小牛胸腺DNA 钠盐的ε(P) 260nm （pH7.0）为6 600，含磷量为9.2%，因此每毫升溶液含1μg DNA 钠盐的光吸收值相当于0.020。 测出260nm 处的光吸收值，可计算出核酸的含量。当核酸变性降解时，其紫外吸收强度显著增加，称为增色效应。 蛋白质也有紫外吸收，通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm 处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。若待测的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的杂质，则测定误差较大，应设法除去。不纯的样品不能用紫外吸收值作定量测定。 从A 260/ A 280的比值可判断样品的纯度。纯RNA 的A 260/ A 280≥2.0；DNA 的A 260/ A 280≥1.8。当样品中蛋白质含量较高时，则比值下降。RNA 和DNA 的比值分别低于2.0和1.8时，表示此样品不纯。 pH 对核酸紫外吸收性有影响，所以在测定时要固定溶液的pH 值。 本实验采用常用的比消光系数法来测定核酸含量。 [方法和步骤] 1、测定 取洁净离心管甲乙两支，分别准确加入 1.0mL DNA/RNA 样液，然后向甲管加入1.0mL 蒸馏水，向乙管加入1.0ml 过氯酸-钼酸铵沉淀剂，摇匀后置冰箱内30min ，使沉淀完全。3000r/min 离心10min ，各吸取上清液0.5mL 转入相应的甲乙两容量瓶内，定容至50mL 。以蒸馏水作空白对照，使用紫外光度计分别测定上述甲乙两稀释A 260值。 2、计算 试液中DNA / RNA 总含量按下式计算： D V A A g DNA ??-= 总乙甲020.0)(660660μ D V A A g RNA ??-=总乙甲022.0)(660 660μ 式中 甲A 260——被测稀释液在260nm 处的总光密度值； 乙A 260——加沉淀剂除去大分子核酸后被测稀释液在260nm 处的光密度值； 两者之差（甲A 260 －乙A 260）为被测稀释液的光密度值； V B ——被测试液总体积（mL ） D ——样液的稀释倍数。 0.020——脱氧核糖核酸的比消光系数，即每毫升含1μgDNA 钠盐的水溶液（pH 为中性）在260nm 波长处，通过光径为1cm 时的光密度值。 0.022——核糖核酸的比消光系数，是浓度为1mg/L 的核糖核酸水溶液（pH 为中性）在260nm 波长处，通过光径为1cm 时的光密度值。 由于大分子核酸易发生变性，此值也随变性程度不同而异，因此一般采用比消光系数计算得到DNA 或RNA 量是一个近似值。
第十四章DNA序列测定 14．1 概述 最早的DNA序列的测定方法借鉴了20世纪60年代发展起来的RNA序列测定技术，其中包括：(1)酶解或化学降解法；(2)毗邻序列分析；(3)游点法。甚至在某些研究工作中，曾用(2)毗邻序列分析；(3)游点法。甚至在某些研究工作中，曾用大肠杆菌RNA聚合酶将DNA 转录成RNA，然后测定RNA序列。 目前，应用的两种快速序列测定技术是桑格(Sanger等)提出的酶法及马克萨姆(Maxam)和吉尔伯特(Gilbert)提出的化学降解法。这两种方法的共同点，是生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或者更多种残基上。由于DNA上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均等，因此上述每一组产物都是一些寡核苷酸的混合物，这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA全片段上的位置所决定。然后在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道之上，即可从凝胶的放射自显影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。现在，大多数蛋白质序列都是通过基因或cDNA的核苷酸序列推导出来的，这充分显示了DNA序列测定技术的发展和意义。 14．1．1 Sanger双脱氧链终止法现行的链终止法是从加减法序列测定技术发展而来的。加减法首次引入使用特异引物在DNA聚合酶作用下进行延伸反应、碱基特异性的链终止，以及采用聚丙烯酰胺凝胶区分长度差一个核苷酸的单链DNA等3种方法。尽管有了这些进展，但加减法仍然不太精确，也不太得法，因此难以广为接受。直至引入双脱氧核苷三磷酸(2＇，3ddNTP)作为链终止剂，酶法DNA序列测定技术才得到广泛应用。2＇，3ddNTP与普通dNTP不同之处在于它们在脱氧核糖的3＇位置缺少一个经基。它们可以在DNA聚合酶作用下通过其5＇三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但由于没有3＇经基，它们不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在增长的DNA链不可能继续延伸。这样，在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP后，链延链延伸将与偶然发生却十分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的核苦酸链，其长度取决于从用以起始DNA 合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。在4组独立的酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的每一个A、每一个C、每一个G或每一个T的位置上。 1．引物酶促测序反应中利用一个与模板链特定序列互补的合成寡核苷酸作为DNA合成的引物。在许多情况下，可将靶DNA片段克隆于M13噬茵体或噬菌粒载体，以取得单链DNA分子作为模板。但也可以采用Sanger法测定变性双链DNA模板的序列。在以上两种情况下，都可以来用能与位于靶DNA侧翼的载体序列相退火的通用引物，而不必取得与未知DNA序列互补的引物。M13噬菌体重组克隆的通用测序引物一般长15个~29个核苷酸，并可与紧靠M13mpl8噬菌体多克隆位点区的Hin d Ⅲ位点或M13mpl9噬菌体多克隆位点区的Eco RⅠ位点的序列互补。这些引物同样也可用于对克隆于pUC质粒的DNA进行＇双链＇测序。此外，还有若干家公司出售一些引物，这些引物是为了对通过多种限制酶切位点克隆于不同质粒的靶DNA进行测序而设计的。 2．模板有两类DNA可以用做Sanger法测序的模板：纯单链DNA和经过热变性或碱变性的双链DNA。采用通常从重组M13噬菌体颗粒中分离得到的单链DNA模板效果最佳，只要细心掌握单链模板与引物的最佳比率，就可以从4组1套的链终止反应中获得数百个核苷酸的序列 3．DNA聚合酶通常用于双脱氧法序列测定的有几种不同的酶，其中包括大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ的K1enow片段、反转录酶、经过修饰消除了3＇一5＇外切酶活性的T7噬菌体
A p p l i c a t i o n N o t e 66 附录（四）核酸定量方法及原理 广泛用于测定制备物中核酸含量的方法有两类。如果样品较纯（即蛋白质、酚、琼脂糖以及其他核酸等杂质含量较低时），可通过分光光度法测定其吸收紫外线的量，既简便又准确。若样品中DNA或RNA含量较低或含有较多杂质，则可以通过溴化乙锭或Hoechst 33258等荧光染料所发出的荧光估测核酸的含量。 DNA或RNA的分光光度法测定 核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长 260 nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD 的吸光值分别相当于50μg / mL的dsDNA，37μg / mL的ssDNA， 40μg/mL的RNA，30μg/ mL的寡核苷酸。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，而后测试空白液和样品液。 然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，对应吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。另外，还需考虑核酸本身理化性质和溶解核酸缓冲液的pH 值、离子浓度等。在测试时，离子浓度太高也会导致读数漂移，因此建议使用pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液（如TE）可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A ，吸光值最好在0.1-1.5 A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。 除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260 / A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280 nm。 纯净的样品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。假如比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、酚盐离子或硫氰酸盐等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0 。A320检测溶液的颗粒度、混浊度和其他干扰因子。纯样品的A320一般是 0。水饱和酚在270nm处有特征吸收，无酚的核酸制品A260/A270比值约为1：2。 各波长具体含义及相关问题 1．A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1至1.0。假如不在此范围，稀释或浓缩样品，使之在此范围内；假如吸光度小于0.05，检查是否存在操作因素（如移液不准确，样品内有悬浮物等）影响。 朗伯－比尔定律： A 吸光值 I0 入射光强度 I 投射光强度 c 吸光物质的摩尔浓度（mol/L） d 光通过的液层厚度（cm） ε摩尔吸光系数（Lmol-1cm-1） 2．A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。假如比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。 3．A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA和 RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0表明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。 4．A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度，该值应该接近0.0。假如不是，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。 5．核酸的吸光值受pH值和缓冲液离子浓度影响。只有在一定的pH值和低离子浓度的条件下（如10 mM Tris-HCl pH 8.0），才能得到精确的检测结果。 核酸是一切生物都含有的存在于细胞核的重要成分,是生命现象中不可缺少的生物大分子,也是生物遗传信息的载体,它控制着蛋白质的合成和有机体细胞的机能,在生物的生长、发育、繁殖、遗传和变异等生命活动中占有极其重要的地位.随着分子生物学的广泛应用,核酸定量已经成为一种常规化的实验手段。
核酸序列的一般分析流程 1.1 核酸序列的检索 https://www.doczj.com/doc/aa5197524.html,:80/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide 1.2 核酸序列的同源性分析 1.2.1 基于NCBI/Blast软件的核酸序列同源性分析 https://www.doczj.com/doc/aa5197524.html,/blast/blast.cgi 1.2.2 核酸序列的两两比较 https://www.doczj.com/doc/aa5197524.html,/gorf/bl2.html 1.2.3 核酸序列的批量联网同源性分析(方案) 1.3 核酸序列的电子延伸 1.3.1 利用UniGene数据库进行电子延伸(方案) 1.3.2 利用Tigem的EST Machine进行电子延伸 EST Extractor: http://gcg.tigem.it/blastextract/estextract.html EST Assembly: http://www.tigem/ESTmachine.html 1.3.3 利用THC数据库对核酸序列进行电子延伸 http://gcg.tigem.it/UNIBLAST/uniblast.html 1.4 核酸序列的开放阅读框架分析 1.4.1基于NCBI/ORF finder的ORF分析 https://www.doczj.com/doc/aa5197524.html,/gorf/gorf.html 1.5 基因的电子表达谱分析 1.5.1 利用UniGene数据库进行电子表达谱分析（方案） 1.5.2利用Tigem的电子原位杂交服务器进行电子表达谱分析 http://gcg.tigem.it/INSITU/insitublast.html 1.6 核酸序列的电子基因定位分析 1.6.1 利用STS数据库进行电子基因定位 https://www.doczj.com/doc/aa5197524.html,/genome/sts/epcr.cgi 1.6.2 利用UniGene数据库进行电子基因定位（方案） 1.7 cDNA的基因组序列分析 1.7.1 通过从NCBI查询部分基因组数据库进行基因组序列的分析(方案) 1.7.2 通过从NCBI查询全部基因组数据库进行基因组序列的分析 https://www.doczj.com/doc/aa5197524.html,/genome/seq/page.cgi?F=HsBlast.html&&ORG=Hs 1.7.3 通过从Sanger Centre查询基因组数据库进行基因组序列的分析 https://www.doczj.com/doc/aa5197524.html,/HGP/blast_server.shtml 1.8 基因组序列的初步分析 1.8.1 基因组序列的内含子/外显子分析 https://www.doczj.com/doc/aa5197524.html,/urllists/genefind.htm 1.8.2 基因组序列的启动子分析 https://www.doczj.com/doc/aa5197524.html,/projects/promoter.html 1.9核酸序列的注册 1.9.1 EST序列的注册(方案) 1.9.2 较长或全长cDNA序列的注册(方案)
核酸检测技术及其在国内外血液筛检中的应用 输血相关传染病的预防和控制已经成为全社会关注的焦点,新技术的引进是进一步提高血液安全性的重要一环。本文就病原体核酸检测技术(nucleic acid testing, NAT)及其在国内外血液筛检中的应用情况和结果作一介绍,并对该方法在我国推广和应用的必要性和可行性作初步探讨。 1. NAT在血液筛检中的必要性 酶免检测(EIA)技术已经广泛运用于血液筛检,该方法的灵敏度和特异性也在不断地改进和提高,但每年仍有少数新发输血后肝炎病例报道,如美国无偿献血者每单位供血传播HBV、HCV和HIV 的危险性分别为1∶66000、1∶103000和1∶676000[1]。这些危险的主要原因是: 病毒感染者“窗口期”献血,病毒变异,免疫静默感染(immuno silent infection)以及人工操作错误[2]。所谓“窗口期”,是指从感染病原开始,直至用某种检测方法能够检测到该病原存在为止的这一段时间[3]。血清学抗原、抗体检测的“窗口期”较长, 如HBsAg、抗-HIV、抗-HCV检测的“窗口期”分别为45-56ｄ、22ｄ、72ｄ[4,5],故美国90%以上输血传播HIV和HBV以及75%以上输血传播HCV的危险性来自“窗口期”感染献血[6]。EIA“窗口期”漏检是当前影响血液安全性进一步提高的瓶颈,对于献血者的筛选,单纯抗原或抗体血清学检测不能有效地保障血液安全。 NAT检测是直接检测病原体核酸的一系列技术的总称。其基本步骤包括核酸提取、扩增、和检测。NAT敏感性高,可检出标本中极微量的核酸,在病毒感染后数天即能检出,可大大缩短“窗口期”。初步研究表明,混合血样NAT检测可将HBV、HCV和HIV感染的平均“窗口期”缩短9d(缩短“窗口期”20%)、59d(82%)和11d(50%)[5,7];此外NAT还可以检出因上述其它3种原因而漏检的被感染献血。如法国应用NAT,从大约150万份献血中筛检出4份HCV RNA阳性、抗体阴性的样本,其中1份即为免疫静默感染[8]。尽管NAT从理论上并不能完全消除感染“窗口期”,但病毒核酸转阳之前的血液传染性极低,可以有效地预防经输血传播病毒性疾病[9]。因此,NAT的引入可使输血传播疾病的危险性降到最低[10]。 2. NAT检测的技术方法 1985年具有划时代意义的聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)的发明,标志着NAT 的诞生。随后,在PCR的基础上,派生出许多其它原理的体外NAT方法[11]。这些技术灵敏度和特异性或高或低,操作或简单或复杂,适合在各自不同的领域运用，目前适用于大样本量血液筛查并能满足高灵敏度要求的扩证扩增技术主要为PCR技术和TMA技术。 2.1 PCR扩增方法 PCR是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术,以其高敏感性、高特异性和快速简便等优势得到了广泛的应用。通过简单的技术改进和联合,涌现出了各种各样不同的PCR方法,如检测RNA的逆转录PCR(RT PCR)、敏感性和特异性均较高的巢式PCR (nested PCR)、可对靶序列进行定量检测的定量PCR、检测基因超长分布的多重PCR以及PCR结合酶标技术(PCR ELISA)、PCR结合寡核酸探针杂交技术(PCR SSOP)、荧光PCR和免疫PCR等。 目前在临床检测中使用较多的是荧光定量PCR,主要用于各种传染病的诊断、病毒滴度监测以及疗效评估,因采用荧光标记的探针杂交或直接使用能和双链DNA结合的荧光素检测PCR扩增产物,
序列分析软件DNAMAN 的使用方法简介 DNAMAN 是一种常用的核酸序列分析软件。由于它功能强大，使用方便，已成为一种普遍使用的DNA 序列分析工具。本文以DNAMAN 5.2.9 Demo version 为例，简单介绍其使用方法。 打开DNAMAN，可以看到如下界面： ： 第一栏为主菜单栏。除了帮助菜单外，有十个常用主菜单，如下所示 第二栏为工具栏：如下所示：
第三栏为浏览器栏：如下所示： 在浏览器栏下方的工作区左侧，可见Channel 工具条，DNAMAN 提供20 个Channel，如左所示： 点击Channel 工具条上相应的数字，即可击活相应的Channel。每个Channel 可以装入一个序列。将要分析的序列（DNA 序列或氨基酸序列）放入Channel 中可以节约存取序列时间，加快分析速度。此版本DNAMAN 提供自动载入功能，用户只需激活某个Channel ，然后打开一个序列文件，则打开的序列自动载入被激活的Channel 中。 本文以具体使用DNAMAN 的过程为例来说明如何使用DNAMAN 分析序列。 1．将待分析序列装入Channel （1）通过File|Open 命令打开待分析序列文件，则打开的序列自动装入默认Channel。（初始为channel1）可以通过激活不同的channel(例如：channel5)来改变序列装入的Channel。 （2）通过Sequence|Load Sequence 菜单的子菜单打开文件或将选定的部分序列装入Channel。 可以通过Sequence|Current Sequence|Analysis Defination 命令打开一个对话框，通过此对话框可以设定序列的性质（DNA 或蛋白质），名称，要分析的片段等参数。
第四节DNA序列测定 目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法（双脱氧链终止法）和Maxam（1977）提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都同样生成相互独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组核苷酸都有共同的起点，却随机终止于一种（或多种）特定的残基，形成一系列以某一特定核苷酸为末端的长度各不相同的寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由这个特定碱基在待测DNA片段上的位置所决定。然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，经放射自显影后，从放射自显影胶片上直接读出待测DNA上的核苷酸顺序。 高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳亦是DNA序列测定技术的重要基础，可分离仅差一个核苷酸、长度达300~500个核苷酸的单链DNA分子。DNA序列测定的简便方法为详细分析大量基因组的结构和功能奠定了基础，时至今日，绝大多数蛋白质氨基酸序列都是根据基因或cDNA的核苷酸序列推导出来的。 除传统的双脱氧链终止法和化学降解法外，自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。此外，新的测序方法亦在不断出现，如上世纪90年代提出的杂交测序法（sequencing by hybridization，SBH）等。 一、双脱氧末端终止法测序 ㈠原理 双脱氧末端终止法是Sanger等在加减法测序的基础上发展而来的。 1980年他又因设计出一种测定DNA(脱氧核糖核酸)内核苷酸排列顺序的方法而与W·吉尔伯特、P·伯格共获1980年诺贝尔化学奖。桑格是第四位两次获此殊荣的科学家。 其原理是：利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，以单链DNA为模板，并以与模板事先结合的寡聚核苷酸为引物，根据碱基配对原则将脱氧核苷三磷酸（dNTP）底物的5′-磷酸基团与引物的3′-OH末端生成3′,5′-磷酸二酯键。通过这种磷酸二酯键的不断形成，新的互补DNA得以从5′→3′延伸。Sanger引入了双脱氧核苷三磷酸（ddTNP）作为链终止剂。ddTNP比普通的dNTP在3′位置缺
全面推行核酸检测试运行工作方案 为预防和控制经血传播疾病的发生，保障临床用血质量和安全，经研究决定我站将全面开展核酸检测。为稳步推进核酸全面检测，不影响血液批放行，满足临床用血需求，制定本 试运行方案。 一、组织管理 为顺利开展全面核酸检测工作，成立核酸检测工作小组，工作组负责全面推行核酸检测试运行工作，协调处理试运行过程中的相关问题。核酸检测工作小组由田站长总负责，分管 站领导和相关科室积极配合。 二、工作目标 根据卫计生发〔2013〕22 号，国家卫生和计划生育委员会关于印发全面推进血站核酸检测工作实施方案（2013 —2015 年）提出的工作目标，到2015 年，血液筛查核酸检测基本覆 盖全国。 2014 年 5 月 27 日，山东省卫计委又下发了“关于全面推进供血核酸检测工作的通 知”，要求各市要按照原卫生部《全面推进血站核酸检测工作实施方案（2013-2015年）》要求，迅速开展核酸检测工作。确保 2014 年下半年在全省全面开展供血核酸检测。为全面推进我站核酸检测工作，目前前期准备工作已就绪，人员、设备、资金已到位。经研究决定自2014年7 月 1 日开始对我站所有献血员标本（包括沂源采血点）进行核酸检测。 三、保障措施 1、资源保障：器械科购买进口核酸采血管，仅供沂源采血点使用，为沂源采血点配备标本 离心机二台（一台备用），购买标本运输箱 3 个（ hiv 送检一个，沂源采血点一个，备用一个）。 （确认 6.20 号之后到位， 6.30 前完成） 2、沂源采血点标本的运送：沂源采血点工作人员严格按《血液标本留取程序 》留取标本和离心，置于2-6 ℃冰箱保存。标本由计划送血人员运回。根据工作需要，沂源计划送血增加一次，同时减少一次急症送血。即每周二、四、六计划送血三次，中午下 班时由送血司机把标本及原料血捎回。为保证核酸标本检测不超 48 小时，沂源采血点工作人员工 作时间调整，接血当日下午采血点工作人员休息，周日休息。 3、机采血小板计划的下达：血液供应科提前和临床沟通，说明我站下一步的工作目标和 任务（全面核酸检测并纳入批放行）及造成的血液供应时间的变更，达成共识，取得谅解。 合理安排血小板预约和采集计划，血小板采集计划截止到每天下午16：00 点之 前。？？？？？？ 4、机采血小板标本的交接：机采成分科按照血液供应科下达的采集计划预约献血员，安 排献血员第二天早上7：30 分之前到达血站，血小板标本必须于每天上午9： 30 之前分别与 酶免实验室和核酸实验室当面交接。 5、全血标本的交接：各采血点 2014 年 7 月 1 日起，所有采集的血液同时留取核酸标本和 酶免实验室标本。待检室每天早上与酶免实验室和核酸实验室当面交接标本，未检、待检 和待放行的原料血和成分血分别存放并标识。 四、核酸检测 1、核酸实验室与酶免实验室同步对当天采集的单采血小板标本和前一天接回的沂源采血 点的标本进行血筛三项检测，并对酶免实验室前一天初次检测无反应性的标本进行血筛三项的 检测，对酶免实验室前一天初次检测单试剂呈反应性的标本进行血筛三项的单检模式，每 天15:30 前完成实验。若遇拆分标本，及时与相关科室沟通，调整放行和血小板发放时间， 并且完成当天拆分检测，保证该批试验中不留待测的标本。若遇突发应急事件，核酸实验室和 酶免实验室同步检测。每天核酸检测完毕后出具书面检测报告交血液质量控制科、血液成 分制备科和献血服务科机采成分。 2、质量保证：核酸实验室应建立室内质控标准操作规程，实验室的每一批检测应至少有
定磷法测定核酸的含量 核酸, 含量, 测定 【实验目的】 掌握定磷法测定核酸含量的原理和方法 【实验原理】 核酸分子结构中含有一定比例的磷(RNA含磷量约为8.5%~9.0%，DNA含磷量约为9.2%)，测定其含磷量即可求出核酸的量。 核酸分子中的有机磷经强酸消化后形成无机磷，在酸性条件下,无机磷与钼酸铵结合形成黄色磷钼酸铵沉淀，其反应为： 在还原剂存在的情况下,黄色物质变成蓝黑色,称为钼蓝。在一定浓度范围内，蓝色的深浅与磷含量成正比，可用比色法测定。若样品中尚含有无机磷，需作对照测定，消除无机磷的影响，以提高准确性。 【实验材料】 1.实验器材 恒温水浴,721分光光度计 2.实验试剂 （1）标准磷溶液：将磷酸二氢钾于110℃烘至恒重，准确称取0.8775g溶于少量蒸馏水中，转移至500ml容量瓶中，加入5ml5mol／L硫酸溶液及氯仿数滴，用蒸馏水稀释至刻度。此溶液每1m1含磷400μg，临用时准确稀释20倍(20μg／ m1)。 （2）定磷试剂 ①17％硫酸：17m1浓硫酸(相对密度l.84)缓缓加入到83m1水中。 ②2.5％钼酸铵溶液：2.5g钼酸铵溶于100ml水。 ③10％抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100ml水，并贮存于棕色瓶中，溶液呈淡黄色尚可使用，呈深黄甚至棕色即失效。 临用时将上述三种溶液与水按如下比例混合：溶液(1):溶液(2):溶液(3):水 =1:1:1:2(V:V) （3）5%氨水,27%硫酸 【实验操作】 1．磷标准曲线的绘制 取干燥试管7支编号，按表所示加入试剂。 试剂管号0123456磷标准溶液，ml0.00.050.10.20.30.40.5蒸馏水， ml3.02.950.92.80.72.62.5定磷试剂，ml3.03.03.03.03.03.03.0A660加毕摇匀，在45℃水浴中保温10min，冷却，以零号管调零点，于660nm处测吸光度。以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标作图。
1.临床实验室若对检测系统进行性能核实,需要进行以下哪组实验(单项该题正确答案: A.精密度、准确 2.基因芯片技术的本质是(单项)该题正确答案: A、核酸分子杂交技术 3.新型冠状病毒肺炎患者行有创机械通气时,正确的方法是(。(单项)该题正确答案: D.小潮气量和低吸气压力 4.合成RNA的原料是:(单功该题正确答案: C、NTP 5.个人防护装置是用于防止人员个体受到生物性、化学性或物理性等()伤害的器材和用品。(单项该题正确答案:A危险因子 6.标记的参与杂交反应的已知核酸序列是(单项该题正确答案 探针 7.级A1型和A2型生物安全柜的通风连接是使用:(单项该题正确答案 A套管“或“伞型罩“连接 8.第三代测序技术的特征(单项该题正确答案 E、单分子测序 9.新冠病毒核酸检测实验室中,不属于净化实验室专用门特点的是:(单项该题正确答案D 以上均不是 10.以下对应关系正确的是()(单项)该题正确答案: B.敏感性一一真阳性/真阳性+假阴性)*100% 11.目前的DNA自动化测序技术可以一次性读取的序列长度约(单项) 该题正确答案D、1000bp 关于分子信标技术的描述,不正确的是(单项该题正确答案 E、分子信标设计简单 13.国内的生物安全实验室一定要按照国务院发布的()进行管理。(单项)该题正确答案: A《病原微生物实验室生物安全管理条例》 14.从鼻咽拭子中提取的检测新型冠状病毒的剩余核酸提取物不可用于哪种病原体诊断(单项该题正确答案 D丙型肝炎病毒 15.退火温度是决定PCR反应特异性的关键因素,通常退火温度为()该题正确答案 C.Tm减5℃ 16.实验室人员培训的主要内容:0(单项该题正确答案E以上都是 17.下列关于Taq DNA聚合酶的描述,正确的是(单项该题正确答案 E、在引物的3-OH末端加入脱氧单核苷酸,形成3',5磷酸二酯键 18.下列关于恒温金属浴的使用说法错误的是()(单项该题正确答案 D孔位不足时,可将0.5mEP管放入1.5m加热孔中进行热裂解,加热时间不变。 9.脱卸三级防护装备的顺序是:0(单项该题正确答案: A.鞋套→护目镜→外层手套→防护服→帽子→内层手套→口罩 20.下列哪项不是临床分子生物学检验分析前质量控制的内容()(单功该题正确答案 E.进行核酸提取的有效性评价 21.在核酸检测体系中加入内质控,其作用不是监控的是(单项) 该题正确答案
核酸检测试剂 一、基本要求： 1.试剂名称：核酸检测试剂(进口) 2.用途：对献血者血液标本进行乙肝病毒DNA、丙肝病毒RNA，人类免疫缺陷病毒RNA检测。要 求HBV/HCV/HIV单管联检试剂。 3.数量：65000人份。[乙型肝炎病毒丙型肝炎病毒人类免疫缺陷病毒（1+2）型核酸检测试剂盒 （PCR-荧光法）：乙型肝炎病毒丙型肝炎病毒人类免疫缺陷病毒（1+2）型核酸质控试剂（PCR-荧光法）]。 4.★试剂适用设备：可以在现有S201设备上使用。 5.适用检测样本种类：血清及EDTA、ACD抗凝血浆。 6.★试剂原理基于荧光PCR技术的汇集模式或基于TMA技术的单检模式。 二、技术要求： 1.试剂必须通过美国FDA批准或欧洲CE（IVD）认可，以保证产品技术和质量达到国际认可水 平，投标试剂的注册标准应具有进字号的注册许可，投标人需在投标文件中提供相关证明文件。 2.试剂可检测到的基因亚型要求覆盖：HBV A-H所有亚型；HCV 1-6亚型；HIV－1 M组A－G所 有亚型、O组、N组；HIV-2组。 3.检测灵敏度(≥95%可信限)：HBV DNA≤20 IU/ml；HCV RNA≤50 IU/ml；HIV RNA≤51 IU/ml； 临床特异性≥99.7%。 4.★根据国家相关机构质控要求进行质控，试剂含有内标质控（Internal Control），为RNA内标 或RNA\DNA双内标，全程监控检测过程，包括核酸提取，扩增及检测步骤，以防止技术性的假阴性。系统内部有UNG酶防扩增污染控制。 5.试剂使用时操作简便，不需要用专用设备进行孵育融化。不需要人工配制或分装，不需要开盖， 试剂封闭操作，能有效防止交叉污染。试剂包装容器需带条形码，满足检测设备自动扫描、自动读取判断试剂组分的需要。 6.装载样本及对应耗材试剂后，无需人工值守，直至试验结束接收结果，避免试验污染。 7.实验结束后，试剂架等材料无需84消毒液浸泡处理，方便操作人员对实验室的维护。 三、配套要求： 1.成交方无偿提供核酸检测正常运转的相关配套设备(包括2台混匀器)。 2.成交方无偿提供所有核酸检测正常运转的相关检测仪器（加样、核酸提取、纯化、扩增、检测） 以及配套实验台等，以进行自动核酸提取、扩增、检测和鉴别；成交方无偿提供设备、安装、调试、培训和维修的服务。 3.检测设备需求量：满足常规8小时至少完成600个标本检测的需求。 4.成交方无偿提供核酸检测正常运转的所有配套耗材，其中须包括一次性带滤芯移液头、一次性 使用核酸检测专用真空采血管、KIMTECH擦拭纸。