血红蛋白的提取和分离 PPT课件

3次洗涤后 的结果
②洗涤目的: 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯 化，洗涤次数不可过少。
(2)血红蛋白的释放（使用蒸馏水和甲苯）
磁力搅拌器
搅拌器转子
搅拌器正在工作
(3)分离血红蛋白溶液：
甲苯层（无色透明）； 脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）； 血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）； 杂质沉淀层（暗红色）。 过滤：除去脂溶性物质沉淀层和杂质沉淀层。
开 始 进 行 层 析
思考下面的问题：
1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲 液处理的目的是什么？ 答：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结 构和功能。 2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？ 这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？ 答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分 离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收 集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观， 大大简化了实验操作。
思考
血液有哪些成分？
水分 血浆
固体物质
血
液
白细胞
血浆蛋白 无机盐 磷脂 葡萄糖等
血细 胞
血小板
红细胞
两个α—肽链
血红蛋白 两个β—肽链
（最多）
四个亚铁红素基团
血红蛋白的特点：
血红 蛋白
两个α—肽链 两个β—肽链
四个亚铁红素基团
㈠.蛋白质提取和分离步骤
样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定
㈡.凝胶色谱法分离蛋白质操作步骤
装 配 好 的 凝 胶 柱
⑶.样品加入与洗脱
①调节缓冲液面 ②滴加透析样品 注意：正确的加 样操作是： 1.不要触及并破 坏凝胶面。 2.贴壁加样。
3.使吸管管口沿管壁环绕移动。
③样品渗入凝胶床 ④洗ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ ⑤收集 注意：在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动， 说明色谱柱制作成功。
收集得到的纯 化后的蛋白
㈢.你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带 的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据 此判断分离效果？ 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正 确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均 匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果 红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果 不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。
实践训练
1.在凝胶色谱法分离蛋白质中，所用凝胶的化学本质
是( A )
A.糖类化合物
B.脂质
C.蛋白质
D.核酸
2.SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中决定蛋白质或多肽移动
速度的主要因素是( C )
A.蛋白质分子所带的电荷 B.蛋白质分子的形状
C.蛋白质分子的相对质量 D.缓冲溶液的pH
3.凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用
⑵.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程
⑶.凝胶色谱法的原理—分子筛效应： 当相对分子量不同的蛋白质通过凝
胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进 入凝胶内部的通道，路程较长，移动速 度较慢；而相对分子量较大的蛋白质无 法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外 部移动，路程较短，移动速度较快。相 对分子质量不同的蛋白质分子因此得以 分离。 ▲依据的特性是：蛋白质分子量的大小。
(4)透析(粗分离)：
①过程：取1ml的血红蛋 白溶液装入透析袋中，将 透析袋放入盛有300ml的 物质的量浓度为20mmol/l 的磷酸缓冲液中（pH为 7.0），透析12小时。 ②透析目的：除去样品中 分子量较小的杂质。
利用透析袋透析
透析过程动画演示
2.凝胶色谱操作:
⑴.凝胶色谱柱的制作：
的共同点是( A )
A.改变蛋白质分子通过凝胶时的路径
B.吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度
C.将酶或细胞固定在凝胶中
D.与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度
4.在利用凝胶电泳法分离蛋白质时，一定要加入缓冲液，
其作用主要是( C )
A.使酶的活性最高
B.使蛋白质的活性最高
C.维持蛋白质所带的电荷 D.使蛋白质带上电荷
观察你处理的血液样品离心后是否分层，如果 分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血 浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过 长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不 到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯 度。
㈡.你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你 的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？
由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝 胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝 胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子 的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡 聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、 狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如 果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以 消除气泡，消除不了时要重新装柱。
四、实验操作——血红蛋白的提取和分离
1.分离生物大分子的基本思路： 选用一定的物理或化学的方法分离具有
不同物理或化学性质的生物大分子。
2.蛋白质分离和提取的原理： 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的
形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解 度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等， 可以用来分离不同种类的蛋白质。
3.缓冲溶液的配制
三、电泳：
⑴.概念： 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。
在电场的作用下，这些带电分子会向着与 其所带电荷相反的电极移动。
琼脂糖凝胶电泳示意图
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
⑵.电泳原理： 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性
质的差异以及分子本身的大小，形状的不同， 使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样 品中各种分子的分离。
⑶.常见电泳类型：
①琼脂糖凝胶电泳 ②聚丙稀酰胺凝胶电泳
迁移率取决于它所带 净电荷的多少以及分
子的大小、形状。
电泳迁移率
③SDS——聚丙稀酰胺凝胶电泳 完全取决于
分子的大小。
课外拓展： 用SDS测定蛋白质分子量的方法
使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定 蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子 量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分 子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳 迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以 测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分 子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白 试剂出售。
1.样品处理： 思考：人们用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、 羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 答：鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于 进行DNA的提取，哺乳动物成熟的红细胞无细 胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提 取血红蛋白。
(1)红细胞的洗涤: ①洗涤操作：
柜式离心机
初次离心 后的结果
注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮 塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体 残留，蛋白质分离不彻底。
⑵.凝胶色谱柱的装填
①凝胶的选择： ②凝胶的前处理： ③凝胶色谱柱的装填方法： 注意：1.凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间 的空隙。 2.装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气 泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示
二、缓冲溶液
1.概念: 在一定的范围内，凡是能够抵制外加 少量强酸或强碱的影响使原来溶液pH 值基本保持不变的混合溶液。
2.缓冲溶液的组成举例：
H2CO3 —— NaHCO3、CH3COOH —— CH3COONa NaH2PO4 —— Na2HPO4、KH2PO4 —— K2HPO4
血红蛋白的提取和分离
学习目标
体验从复杂体系中提取生物大分子的基本 过程和方法，并了解凝胶色谱法、电泳法等分 离生物大分子的基本原理。
1、主要概念：①凝胶色谱法 ②电泳法 ③缓冲溶液 ④它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。
2、主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理 ②电 泳法分离样品的原理 ③缓冲溶液的组成和作用机理
（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移 动，说明色谱柱制作成功）
④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲
液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用
300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为
7.0）充分洗涤平衡12小时。
50
注意：1.液面不要低于凝胶表面，否则
cm
可能有气泡混入，影响液体在柱内的流
高
动与最终生物大分子物质的分离效果。
2.不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒
的现象。
3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法
4、课题难点：①样品的预处理 ②色谱柱填料的处理 和色谱柱的装填。
一、凝胶色谱法（分配色谱法）
⑴.概念：
根据被分离物质的蛋白质相对分子 质量的大小，利用具有网状结构的凝胶 的分子筛作用，来进行分离。
大多数凝胶是由多糖类化合物（如 葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体， 内部有许多贯穿的通道。
B.层析柱的直径
C.缓冲溶液
D.样品的分布
3.蛋白质的提取和分离一般分为四步，即＿样＿品＿处＿理、 ＿粗＿分＿离＿、＿纯＿化＿和＿纯＿度＿鉴＿定＿。后三步常用的方法
依次是＿透＿析＿法＿、＿凝＿胶＿色＿谱＿法＿、＿SD＿S—＿聚＿丙＿烯＿酰＿胺＿
＿凝＿胶＿电＿泳＿＿。
结果分析与评价
㈠.你是否完成了对血液样品的处理？你能描述 处理后的样品发生了哪些变化吗？
1、(多选)关于血红蛋白分子的叙述正确的是(B ) A.两个α—肽链，两个β肽链，一个亚铁血红素C 基团
B.两个α—肽链，两个β肽链，四个亚铁血红素基团
C.亚铁血红素能与CO2结合
D.血红蛋白在人体主要运输能源物质
2.下列各项中，一般不影响在凝胶色谱法分离蛋白质
中的分离度的是( B )
A.层析柱高