微生物蛋白质组研究

微生物蛋白质组研究简介
主要内容
一、蛋白质组研究的概念及简单介绍 二、蛋白质组研究的主要手段 三、微生物蛋白质组的研究 四、蛋白质组技术在微生物研究领域的应用
一、蛋白质组研究的概念及简单介绍
蛋白质组（Proteome）的概念1994年由Wilkins 和 Williams提出，指一种细胞或一个组织内所存在的全部 蛋白质。蛋白质组学(Proteomics)通常指用生物化学等方 法对不同条件和不同生物学过程中的蛋白质组进行定性 和定量的比较研究。
4. 嗜血流感菌（Haemophilus influenzae）蛋白质组的研究：
对于致病菌株 Haemophilus influenzae 以及嗜血杆菌属其他菌 株的蛋白质组进行对比，可以研究基因表达的情况以及本属 内蛋白种类的变化。(比较蛋白质组学)
下图是对 Haemophilus influenzae 蛋白质组的研究：
到1997年，在2DE图谱上的1550个蛋白斑点，大约25%找到了 对应的基因。
4. 嗜血流感菌（Haemophilus influenzae）蛋白质组的研究：
Haemophilus influenzae 基因组有1830 Kbp , 预测编码蛋白质 1743种。
Haemophilus influenzae 基因组非常小。研究这样的微生物对 于估计一个自由生活的生物至少需要有哪些基因和蛋白质是 很有意义的。并且本身它也是人的病原菌。
二、蛋白质组研究的主要手段
1. 双向凝胶电泳
得到的布满蛋白斑点的图像，即“参考胶图谱”，还要 进一步进行蛋白的鉴定。这需要把蛋白从胶中分离出来。
现在的分wk.baidu.com方法是做快速的氨基酸组成分析。或者先做 N末端微量测序，再做氨基酸组成分析，结合其分子量 和等电点，查对数据库，如果是已知蛋白，通常就可以 进行初步的判断了。如果再根据C末端序列，判断结果 的准确性就更高了。
Fig. 1. Analysis of soluble cellular proteins expressed by (A) Neisseria meningitidis and (B) Escherichia coli by 2DE. E. coli and N. meningitidis were grown on nutrient agar or chocolate agar, respectively, and the soluble proteins were prepared and analysed by 2DE on small format 2D gels as described previously [90]. The axis show the location for markers indicating the pH gradient (horizontal axis) and Mr (vertical axis).
一、蛋白质组研究的概念及简单介绍
基因是遗传信息的携带者，但单纯得到基因序列并不是基因组 研究的终点。生命活动的执行者是蛋白质，蛋白质有其自身的规律， 基因组中开放阅读框架（ORF）的存在并不意味着基因一定有活性， 蛋白质的修饰也不能从DNA序列上看出来，翻译后产物的修饰和 加工也只能从蛋白质组分析得出。蛋白质组学是基因组学不可缺少 的后续部分——后基因组学。
1. 微生物蛋白质组研究的一般策略：
细菌细胞培养、收集以后，接下来是破碎细胞，以后的 每一步操作都要谨慎，以保证蛋白的溶解、防止蛋白裂 解以及其电荷性质的改变。细胞的破碎也是容易出问题 的环节，因为不同细菌细胞壁的结构差别很大，有的还 有荚膜。无荚膜的gram-negative bacteria 可以采用无离 子试剂（如NP40）加上8M urea 和蛋白水解抑制剂来进 行裂解，超声波常被用于破碎有荚膜的gram-negative bacteria ，例如 Pseudomonas spp. and some E. coli isolates。 Gram-positive bacteria 由于具有厚的肽聚糖层而需要用 超声波作用更长的时间。
二、蛋白质组研究的主要手段
1. 双向凝胶电泳
分离蛋白质组所有蛋白的两个关键参数是高分辨率 和可重复性。
80年代开始采用固定化pH梯度胶（immobilised pH gradients IPG），克服了两性电解质飘移的缺点， 可以建立稳定的、可以精确设定的pH梯度，使不同 实验室的结果之间具有很高的可重复性。
二、蛋白质组研究的主要手段
1. 双向凝胶电泳
1975年由O’Farrell, Klose, Scheele 等人发明。
第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离； 第二向按蛋白质的分子量不同用SDS-PAGE分离。
这样就把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。 经过多方面改进，这种方法已经成为蛋白质组研究的最有 实用价值的核心方法。
一、蛋白质组研究的概念及简单介绍
蛋白质组是一个整体和动态的概念。
蛋白质组的研究比基因组学的研究要复杂得多, 蛋白质组是一个整体和动态的概念,一个有机体 只有一个基因组,但不同组织的细胞蛋白质种类和 数量很不相同;一个细胞只有一个基因组,但其表达 的蛋白质在不同环境下及不同生长状况下也不相 同。由于有基因剪切,蛋白质翻译后修饰等,基因与 蛋白质的关系可能不是一个基因一个蛋白质的关 系。蛋白质还可以通过改变在细胞内的位置、裂解或 改变其结合的物质来回应环境的变化。
A 为脑膜炎萘瑟氏球菌
B为大肠杆菌
2. 微生物蛋白质组研究的现状：
对于细菌的蛋白质组研究来说，已经发展起来了一些数 据库，可以通过网上进行检索。如下表所示：
已经有专门的软件帮助研究者们进行数据的分析与比较。
2. 微生物蛋白质组研究的现状：
细菌的蛋白质组研究可以用来阐明细菌蛋白质的生物合 成，研究细菌的生理代谢、遗传变易，致病性及疫苗研 究等方面。
三、微生物蛋白质组的研究
对微生物进行蛋白质组研究具有一些明显的优势：
微生物基因组相对较小，编码蛋白的数目也少，某些微生物 （如 E. coli）,其细胞代谢过程也已经比较清楚，而且很多哺乳 动物细胞代谢过程中所需基因在微生物体系中也是保守的， 是研究蛋白质网络体系的理想的模式生物。
很多病原微生物的基因组已经完成测序工作，这些DNA 序列的信息为进一步研究蛋白质组奠定了良好的基础。 目前对病原微生物的蛋白质组研究也比较集中。
3. 大肠杆菌(E. coli)蛋白质组研究的现状：
E. coli 是研究细菌生理学和细菌基因表达的常用模式生物。
E. coli 基因组总长度为4639 Kbp , 具有4288个ORFs，其中 38%的ORFs没有明确的生理功能。
Pedersen 等人研究了E. coli 在不同培养条件下合成的140种含 量丰富的蛋白质，它们可以分为5组，只有其中的21种蛋白可 以同已知的蛋白联系起来（可以被鉴定）。其中10种是RNA 合成酶，3种是RNA聚合酶亚基，另外8种主要包括核糖体蛋 白。
二、蛋白质组研究的主要手段
1. 双向凝胶电泳
目前，一块胶板（16*20cm）可分出3-4千个，甚至1万 个可检测的蛋白斑点。检测蛋白斑点，银染法可检测到 4ng 蛋白，最灵敏的是同位素标记，检测灵敏度可达 20ppm。
检测几千个蛋白斑点, 这与10 万个基因可以表达的蛋白 数目相比还是太少了。不过 细胞中的基因在某一条件下 并不是全部得到表达, 除脑细胞外, 一个细胞大约只有5～ 6 千种不同的蛋白, 其中80% 的蛋白是维持生命所必需而 为所有的细胞所共有, 称为“看家蛋白”。人体至少有 250 种不同的细胞, 每一种细胞可能表达3～ 4百种自己特 有的蛋白, 所以人体拥有的总蛋白数还是大于10 万个基 因的数目。
4. 嗜血流感菌（Haemophilus influenzae）蛋白质组的研究：
Fig. 2. Detection of H. influenzae proteins by either (A) colloidal Coomassie brilliant blue G250 or (B) silver staining. Soluble proteins from H. influenzae (HI-64443) were prepared and analysed by 2DE [90]. Following electrophoresis the proteins were detected with either (A) Coomassie brilliant blue G250 or (B) silver staining. The gel shown in panel Awas loaded with twice the amount of sample as the gel in panel B. The axes show the location for markers indicating the pH gradient (horizontal axis) and Mr (vertical axis).
1. 微生物蛋白质组研究的一般策略：
一般情况下样品是破碎细胞后的蛋白溶液。根据不同的 实验目的，细菌可以用液体培养，也可以用固体培养。 如果是蛋白在细菌细胞内已经加上了放射性标记，利用 放射自显影的方法来检测的话，一般是采用液体培养， 这在E. coli 和 B. subtilis 的蛋白质组研究中是常用的。
前面两种技术都是分离技术，而质谱是鉴定技术。
质谱技术不但可以进行蛋白质的鉴定，而且可以进行其高级 结构的研究。
二、蛋白质组研究的主要手段
4. 生物信息学
基因组和蛋白质组研究会得到天文数量的数据，这些数 据必须要有高度自动化的处理，这样，生物信息学技术 便应运而生。
生物信息学可以高效地进行对蛋白质组数据的分析，而且 可以对已知的或新的基因产物进行全面的功能分析。
二、蛋白质组研究的主要手段
1. 双向凝胶电泳 （2-Dimentional gel Electrophoresis）
目前面临的挑战：
（1）低拷贝蛋白的检定。目前还无法检出拷贝数低于1000的蛋白质。 （2）极酸或极碱蛋白的分离。 （3）极大（>200KD）或极小（<10KD）蛋白的分离。 （4）难溶蛋白的检测。
1. 微生物蛋白质组研究的一般策略：
细胞破碎后，样品通常需要在含有0.3% SDS 的情况下 加热，以促进蛋白的溶解，这时候不能加脲，以防止蛋 白的氨甲基化。 然后是去除SDS，进行等电聚焦电泳和SDS-PAGE 电泳。
电泳后的胶板，如果具有放射性，则采用放射自显影技 术显像，否则采用考马斯亮蓝或银染的方法染色。
二、蛋白质组研究的主要手段
2. “双向”高效柱层析
先进行一次分子筛柱层析，从柱上流出的蛋白峰自动进 入第二向层析，第二向层析通常是利用蛋白质表面疏水 性质进行分离的反向柱层析。
这种方法可以分离得到较多量的蛋白质，并可以直接连通 进入质谱进行鉴定，操作步骤较少。但是精度较低。
二、蛋白质组研究的主要手段 3. 质谱技术 （Mass Spectrum MS）
3. 大肠杆菌(E. coli)蛋白质组研究的现状：
随着研究工作的进行，到1983年，157种蛋白已经被鉴定。
研究者们建立了大肠杆菌的基因组文库，然后把基因重组表 达，表达后的蛋白和2DE图谱上的蛋白斑点对应起来，这样， 就可以建立从2DE图谱上的蛋白质到大肠杆菌基因组之间的 联系。
后来，Kohara利用λ 噬菌体建立E. coli的基因组文库，利用 低拷贝数质粒载体pFN476建立亚克隆。此质粒在噬菌体T7启 动子的控制下表达，表达前，宿主（ E. coli ）先用利福平处 理，以消除其自身的蛋白合成。这种方法效率更高。
二、蛋白质组研究的主要手段
总结：
目前最现实、最有效的技术是双向凝胶电泳分离纯化蛋 白质，结合计算机定量分析电泳图谱，并进一步用质谱 对分离到的蛋白质进行鉴定，并运用现代生物信息学的 知识和技术对所得到的数据进行处理，对蛋白质以及它 们所执行的生命活动作出精细、准确的阐述。
蛋白质组的研究可分为两个阶段，首先是建立一个细胞或 一个组织或一个机体的蛋白质二维凝胶图谱，可以称为 “组成蛋白质组”，然后是研究在各种条件下的蛋白质组的 变化，可以称为“功能蛋白质组”。
通过2DE，大约检测到Rd Strain of Haemophilus influenzae 400种蛋白斑点，其中150种表达量丰富,119种蛋白得到鉴定 并同ORF联系起来。
4. 嗜血流感菌（Haemophilus influenzae）蛋白质组的研究：
另外对一种非典型菌株 Haemophilus influenzae NCTC 8143 ， 其蛋白质组也进行了研究。
大约观察到400个蛋白印迹，对其中303个进行了进一步研究。 其中263种蛋白证实为此菌株独特的蛋白（unique proteins）。 其余因缺乏完全的质谱数据而无法鉴定。
在这263种蛋白中，发现一种色氨酸酶，而产生此酶的基因在 Rd Strain of Haemophilus influenzae 中是缺失的，这个结果表 明，研究同一类细菌的不同菌株，对于完全阐明其蛋白质组 是非常有益的。