高效液相色谱(HPLC)简介

4.2.2 色谱柱简介（二）
聚合物填料柱------通常为聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚 甲基丙烯酸脂等. 优点：PH值为1—14均可使用；具有更强的疏水性；大 孔的聚合物对蛋白质等样品的分离非常有效。 缺点：色谱柱柱效较低。 其它无机填料柱------如石墨化碳黑正逐渐成为反向色 谱柱填料。由于在HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任 何PH与温度下使用，石墨化碳可用于分离某些几何异构体。 氧化铝也可以用于HPLC。氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的 色谱柱柱床，其优点是可以在PH高达12的流动相中使用。
4.2.3 色谱柱简介（三）
手性柱-------将手性聚合物共价键和到硅胶上，实现外 消旋物的广泛分离。如下图：
特点：具有专一性、通用性不广。 价格较贵。
5、分析方法的建立
5.1 色谱柱的选择：
疏水性的样品——反相键合色谱； 亲水性的样品——正相键合色谱；
生物大分子
高分子聚合 同分异构体
——体积排阻色谱；
进样方式 流动相 分离原理 检测器
应用范围
低沸点有机化合物 永久性气体
3、液相色谱仪简介
贮液罐A 贮液罐B 高压输液泵A 高压输液泵B 阻尼器A 阻尼器B
初步混合器
压力传感器
混合器
进样器
色谱柱
检测器
谱图输出
液相色谱仪
液相色谱仪
液相色谱仪
1. 结构流程
4.2.2 主要部件
(1) 高压输液泵
光电二极管阵列检测器
三维：光谱-色谱图
可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数 差值。差值与浓度成正比。 通用型检测器（每种物质 具有不同的折光指数）。 灵敏度低，对温度敏感， 不能用于梯度洗脱。 偏转式、反射式和干涉型 三种。
c. 示差折光检测器 （Differential refractive index 除紫外检测器之外应用最多的检测器。 detector）
4.1.2
色谱法简介（二）
体积排阻色谱法--------以多孔性凝胶为固定相，借助多 孔性凝胶孔径的大小，使样品中的大分子不能进入凝胶孔 洞而完全被排阻，只能沿凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱， 而首先被洗脱出来。被分析样品可按分子的相对大小分别 先后流出。 特点：洗脱时间短，但不适于分离组成复杂的混合物。 适用范围：分子量差别较大的样品。 离子对色谱法--------分析离子化的强极性化合物。 亲和色谱法等等
2 HPLC的特点
2.1 HPLC的特点（一）
项 目
高效液相色谱法
10～25 2～10 5～50
经典液相色谱法
10～200 10～50 75～600
色谱柱：柱长/cm 柱内径/mm
固定相粒径/μm
色谱柱柱效 （理论塔板数） 柱压降/MPa
2×103～5×104
5～15 10-6～10-2 0.05～1.0
特点：消除了溶剂的干扰，不受温度变化影响，灵敏 度高，是通用型检测器。
4、色谱分析法简介
4.1.1 色谱分析法介绍（一）
液固色谱------以固体吸附剂为固定相，依靠吸附－脱附 平衡实现分离，常用的固定相有碳酸钙、硅胶、三氧化二铝、 氧化镁、活性炭等。 特点：有时会发生不可逆吸附，应用受到限制。 液液色谱------以吸附载带在惰性固相载体上的极性或非 极性固定液为固定相，依靠溶解－解吸平衡实现分离。 特点：固定液可选择余地大，重现性、分离效果好。
(3) 进样装置
流路中为高压力工作状 态，通常使用耐高压的六通 阀进样装置， 结构如图所示：
(4) 高效分离 柱
柱体为直形不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
(5) 检测器
紫外检测器 示差折光检测器 荧光检测器 光电二极管阵列检测器
4.2.3 检测器
2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分；
按极性分：极性、弱极性、非极性；
按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。
常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、
乙腈、水。
采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动
相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
3. 流动相选择
在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。
4.1.3 色谱法简介（三）
◆ 键合相色谱法简介
键合相色谱-------是由液液色谱发展起来的，在高效液相色谱法
中占有极其重要的地位。将有机官能团通过化学反应共价键合 到硅胶（载体）表面的游离羟基上，生成化学键合固定相，解
决固定液的流失问题,是目前用的最多的一种色谱分析法。
根据键合固定相与流动相相对极性的强弱，分为正相键合相色谱
2～50
0.001～0.3 0.1～10 1～20
进样量/g
分析时间/h
２.2 HPLC的特点（二）
项 目 高效液相色谱法 样品制成溶液 溶液 吸附、分配、筛析、亲和等 UVD、PDAD、RID等 低、中、高沸点有机化合物 离子型无机化合物 热不稳定化合物 生物活性分子 气相色谱法 样品需气化或裂解 惰性气体 吸附和分配 TCD、FID、ECD等
高效液相色谱（HPLC）简介
目
1, 液相色谱分析法的发展 2, 高效液相色谱的特点 3, 高效液相色谱仪简介 4, 液相色谱法介绍 5, 分析方法的选择 6, 实际分析操作过程
录
1、液相色谱分析法的发展
20世纪初： 俄国植物学家茨维特提出经典液 相色谱法。经典液相色谱法包括柱色 谱、薄层色谱、纸色谱。 20世纪60年代末： 随着色谱理论的发展、高效细微 固定相的开发、高压恒流泵及高灵敏 度检测器的应用，高效液相色谱法得 到了突破性的发展。
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积，损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱 子。如使固定液溶解流失，酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并 在柱中沉积。 （4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测 器时，流动相不应有紫外吸收。
a. 紫外检测器
应用最广，对大部分有机 化合物有响应。 特点： 灵敏度高；
线性范围宽；
流通池可做得很小(1mm × 10mm ，容积 8μL)； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。
b. 光电二极管阵列检测器
紫外检测器的重要进展；
光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测 特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。
采用正相液-液分配分离时，首先选择中等极性溶剂， 若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。
也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使 保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮>二氧六环> 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙醚> 异丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二 硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)
流动相的总流量增加，通常柱效增加。
梯度洗脱--------在洗脱过程中连续或间断的改变流动相的组成， 来改善分析效果的技术。适用范围：当样品中溶质组分较多
及不同溶质的性质差别较大时。
特殊要求：当分析弱酸、弱碱性化合物时，可通过采用缓冲 溶液及调节流动相的Ph值来改善峰型。
5.3
样品组分保留值和容量因子的选择
4. 选择流动相时应注意的几个 问题
3.1 高效液相色谱仪构造
3.2 高压输液泵Βιβλιοθήκη Baidu介
高压输液泵的一般要求：
泵体材料耐酸、耐碱、耐化学腐蚀； 耐压40 ～ 50MPa，能连续工作； 输出流量稳定，重复性佳； 输出流量范围宽，对填充柱：0.1 ～ 100mL／min。 注射型泵------输出精确，无脉动，需更换溶剂而中断工作。
◆恒流泵
往复型泵------造价低廉，溶剂更换方便，但存在脉动。
◆恒压泵--------压力恒定，但流量不恒定；
3.3 阻尼器介绍
阻尼器----消除、减轻往复式柱塞泵输出的压力脉动。
3.4.1 检测器简介（一）
紫外吸收检测器（UVD） 原理：用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测透光率 的变化来测定样品浓度的检测器。它具有波长固定，波 长可变和光二极管阵列三种类型。 特点：选择性检测器、对流量和温度敏感性低、灵敏度较 高（10-9g）。
1. 分析时间控制在10～30min ； 2. 容量因子控制在1～10，对于复杂的样品，容量因子 范围较宽的通常使用梯度洗脱技术。 容量因子定义：调整保留时间与死时间之比，即可表 示为: tR tM k tM
3. 相邻组分分离度的要求：
◆
荧光检测器（FLD）
原理：某些溶质在紫外光激发后能发射可见光（荧光） 的性质检测。 特点：选择性检测器、灵敏度高（10-12g）、对流量和 温度敏感性低。
3.4.3 检测器简介（三）
◆ 蒸发光散射检测器（ELSD）
原理：通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。 色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气 （氮气）喷成雾状液滴，再进入蒸发漂移管中，流 动相不断蒸发，含溶质的雾状液滴形成不挥发的微 小颗粒，被载气载带通过检测器。在检测器中，光 被散射的程度取决于溶质颗粒的大小与数量。
法与反相键合相色谱法。
正相键合相色谱------固定相极性强； 反相键合相色谱------固定相极性弱。
４.2.1 色谱柱简介（一）
正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如 （NH2）和氰基团（CN）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此， 分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先 被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正 已烷，氯仿，二氯甲烷等。 反相柱------固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱 官能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓 冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的 组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。 常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5 （Phenyl）等。
——凝胶色谱； —— 双键或取代基异构用吸附色谱； —— 多环芳烃异构选用反相键合；
无机离子化合物——离子对色谱； 同系物的分离——吸附、分配和键合色谱；
对映异构体 —— 流动相加入手性选择剂或具有光 学活性的固定相。
5.2
流动相、配比、流量、梯度洗脱的选择
根据分析样品的结构、性质，结合色谱分析法确定流动相。 为达到较好的分离效果，确定流动相配比。
d. 荧光检测器 （Fluorescence detector）
高灵敏度，高选择 性。 对多环芳烃，维 生素B，黄曲霉素，卟 啉类化合物，农药， 药物，氨基酸，甾类 化合物等有响应。
4.5.2 分离类型选择
4.3.2 液相色谱的流动相
1. 流动相特性
（1）流动相组成改变，极性改变，可 显著改变组分分离状况。 （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极 性小于固定相的极性，正相，极性柱也称正相柱。 （3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液 液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱 上的出峰顺序相反。
◆
折光指数检测器（RID） 原理：监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测量试
◆
样浓度的检测器。 特点：通用性检测器，温变化要保持在±0.001℃、灵敏度 低（10-6g）。
3.4.2 检测器简介（二）
◆ 电导检测器（ECD）
原理：监测溶液的电导率变化的检测器。
特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的 组成变化有明显响应、灵敏度低（10-3g）。适用于离子 型化合物。
主要部件之一，压力：150×105～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相(<10μm)，液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压 、高速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳，脉冲小，流量稳定可调，耐腐蚀等特
性。
（动画）
(2) 梯度淋洗装置
外梯度（高压梯度）: 利用两台高压输液泵，将 两种不同极性的溶剂按一定的 比例送入梯度混合室，混合后 进入色谱柱。 内梯度（低压梯度）: 一台高压泵, 通过比例调 节阀,将两种或多种不同极性 的溶剂按一定的比例抽入高 压泵中混合。