PCR方法在ApoE基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用
摘要目的为ApoE基因敲除鼠探索快速、简单的基因型PCR检测方法。方法设计两对引物扩增野生型ApoE基因和ApoE缺陷突变基因的DNA片段，用PCR仪梯度方案测试最佳退火温度，然后用PCR鉴定方案检测小鼠基因型并将所得基因型结果与已经过经典的Southern blot方法检测得到的基因型结果比较。结果野生型仅在155 bp处有一条条带，突变纯舍子仅在245 bp处有一条条带，杂合子则在155和245bp处出现两条条带。用PCR方法获得的ApoE基因分析结果与经典的Southern blot方法获得的结果完全一致。结论用PCR方法分析ApoE基因敲除鼠的基因型具有快速、简单、廉价和适用的特点。
关键词聚合酶链反应基因型基因打靶载脂蛋白E
Genotype identification of ApoE Gene Knockout Mice with
Polymerase Chain Reaction
Objective This study was to explore a simple and quick polymerase chain reaction（PCR）method for genotyping of ApoE knockout mice.Method Two pairs of primers were designed to amplify genomic DNA fragment of wild-type ApoE gene and the same region on ApoE targeting veceor respectively.A gradient PCR strategy was used to test the best annealing temperature. Results A 155bp band was found in wild-type ApoE mice,a 245 bp band in homozygous mutated ApoE mice and both bands in hetemzygous mice.The genotyping results were completely coincided with those from typical Southern blot. Conclusion PCR is a simple,fast and practical method for the genotyping of ApoE gene knockout mice.
Key words Poiymerase Chain Reaction genotype gene targeting ApoE
载脂蛋白(apolipoprotein，ApoE)是清除乳糜微粒和极低密度脂蛋白的受体的配体，因此，缺乏ApoE则会导致血液循环中富含胆同醇的物质积累而更加容易引起动脉粥样硬化
(atl-rosclerosis，AS)病灶形成。ApoE基因敲除小鼠亦称ApoE基因缺陷小鼠，由美国洛克菲勒大学生化遗传与代谢实验室和北卡罗莱那大学病理遗传实验室应用胚胎干细胞基因敲除(gene knockout)技术于1992年培育成功；这种小鼠无论正常或高脂饮食均可形成严重的高脂血症及AS病灶。此后，各国学者利用ApoE基因敲除小鼠在高脂血症及AS的发病机理和治疗措施等方面做了许多卓有成效的研究。为了深入研究基因敲除小鼠表型的改变，基因敲除动物在用于实验研究前，必须准确、及时地进行基因型鉴定。由于需要鉴定的动物数量多，工作量大，而传统的Southern blot方法费时、昂贵，又涉及同位素可能对环境的污染，不便于进行大规模的动物筛选。我们采用聚台酶链反应(poiymerase chain reaction，PCR)技术分析ApoE基因敲除小鼠基因型，旨在为ApoE基因敲除鼠的基因型鉴定探索一种快捷、准确和廉价的方法，并为其他基因敲除动物的基因型鉴定提供参考。
材料与方法
1.材料
1.1 ApoE基因敲除小鼠
1.2 仪器PCR仪（BIOMETRA T-GRADIENT THERMOBLOCK、BIONEER）电泳仪（BIO-RAI）、离心机（SIGMA 1-14ED）、离心机（SIGMA 1-14ED）BIO-RAD凝胶成像系统
1.3 试剂GOTAG SYSTEM（PROMEGA）、引物（上海生工）、10*TBE缓冲液(???)、琼脂糖、marker（NEB）、EB、宝生物LA Taq酶、蛋白酶K（Promega）tris-HCL（Amresco分装）、EDTA(Amresco分装)、SDS（国药集团化学试剂有限公司）
2.实验方法
2.1PCR引物设计：以正常野生型小鼠ApoE基因组DNA序列为模板，设计第一对引物oIMR0180与oIMR0181(5’GCC TAG CCG AGG GAG AGC CG 3’，5’ TGT GAC TTG GGA GCT CTG CAG C 3’，以检测小鼠野生型ApoE基因，PCR扩增片段长度为155bp。以ApoE基因打靶载体中取代ApoE基因的新霉素抗性基因cDNA序列为模板，设计第二对引物
oIMR0180与oIMR0182(5’GCC TAG CCG AGG GAG AGC CG 3’，5’GCC GCC CCG ACT GCA TCT 3’)，以检测发生缺失突变的HSF1基因，PCR扩增片段长度为245 bp。
2.2采样与消化：剪ApoE基因敲除小鼠脚趾,杂合子小鼠脚趾以及野生型小鼠脚趾各一个，分别放入无菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号1．5 ml Eppendorf(EP)管中，加消化缓冲液17ul 和蛋白酶K3ul，置于55℃空气恒温摇床振摇消化3 h或过夜，然后置PCR仪中99摄氏度5分钟失活SDS，100度失活蛋白酶K，13000r /min离心1min，取上层富含基因组DNA的样品加入500ul无菌水作基因型检测备用。
2.3 PCR步骤：取200ul无菌EP管18支，编号1至18，各加入总体积为20ul的PCR混合缓冲液: Reaction Component Volume (µl)Final Concentration Total Volume (µl) ddH2O 12.26 - 12.26
10 X AB PCR BufferII 1.20 1.00 X 1.20
25 mM MgCl2 0.96 2.00 mM 0.96
2.5 mM dNTP0.96 0.20 mM 0.96
20 uM oIMR0180 0.30 0.50 uM 0.30
20 uM oIMR0181 0.30 0.50 uM 0.30
20 uM oIMR0182 0.30 0.50 uM 0.30
5 mM DNA Loading Dye 1.6
6 0.69 mM 1.66
