第八章 动物早期胚胎操作

• 3.羊的超数排卵 • 可采用牛的超排处理方法，FSH减量注射 或PMSG + PGF2α法。 • 也可采用如下方法： • 每日肌注孕酮10-12mg，连续处理约14d后， 一次性肌注PMSG1000—2000IU，1—2天 配种。
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影响超数排卵的因素： 1. 动物个体状况： 不同个体对激素的敏感性不同 动物的遗传基础的差异 动物的年龄差异 2. 外界环境因素： 季节 光照周期 气候条件及动物营养水平 3. 药物因素：PMSG、FSH等 4. 激素的注射部位及超排程序
• 胚胎分割(embryo splitting)是运用显微操作系统 将哺乳动物附植前胚胎分成若干个具有继续发育 潜力部分的生物技术，运用胚胎分割可获得同卵 孪生后代。
• 在畜牧生产上，胚胎分割可用来扩大优良家畜的 数量;在实验生物学或医学中，运用同卵孪生后代 作实验材料，可消除遗传差异，提高实验结果的 准确性。
七）影响胚胎移植成功率的因素
• 1. 胚胎因素：胚胎的质量、发育阶段、数 量、供体质量、体外停留时间等。 • 2. 母体因素：供受体发情的同期化程度、 受体孕酮水平、移植部位、受体营养水平、 受体子宫等生殖系统状态等。
• 3. 其他因素：移植方法、污染程度、操作 熟练程度等。
第二节、胚胎分割技术
4.分割胚的培养
• 为提高半胚移植的妊娠率和胚胎利用率，分割后的 半胚需放入空透明带中或者用琼脂包埋移入中间受 体在体内或直接在体外培养。 • 半胚的体外培养方法基本同于体外受精卵。 体内 培养的中间受体一般选择绵羊、家兔等动物的输卵 管，输卵管在胚胎移入后需要结扎以防胚胎丢失。 • 琼脂包埋的作用是固定胚胎，便于回收，但不影响 胚胎的发育。 • 发育良好的胚胎可移植到受体内继续发育或进行再 分割.
（2）子宫采胚法： 受精后60–72小时，一些致密的8细胞胚 胎已进入子宫。而桑椹胚和囊胚的收集则一 定要从子宫中获得。 需熟悉小鼠胚胎着床前发育过程 （p316 图12-6）
五）供体胚胎的分级检查
• 冲胚液回收后，应立即收集冲胚液中的胚胎， 并进行质量检查。 • 形态学标准：教材P318、P319 • 形态大小正常，卵裂球均一，透明带完整等。 • 采卵时间与胚胎发育时间是否吻合。
二、影响胚胎分割效果的因素
• 一）分割胚的发育 • 1. 透明带的作用：保护作用 • 2. 胚胎分割程度：分割程度越高，分割胚 囊胚发育成功率越低。
• 3. 胚胎不同发育阶段：牛分割胚实验表明， 来自囊胚的半分割胚发育成功率要高于桑 葚胚的半分割胚。
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二）影响胚胎分割效果的因素 1. 分割胚胎发育的阶段 2. 胚胎分割的次数 3. 操作液 4. 动物种类 5. 分割胚的移植
于家畜的胚胎移植技术的应用。
2.同期发情的机理：主要是借助外源激素对卵巢的作用，使被
处理的母畜卵巢按预定的要求发生变化，并使其功能处于一个 共同的基础之上，达到同期表现发情的目的。 A.用孕激素处理抑制卵巢上卵泡的生 长发育和发情表现，待所有处理母畜的自
然黄体退化，功能消失后，同时停药；此
目前的同期 发情技术有 两种方法： 时，由于卵巢失去了孕激素的抑制作用， 于是卵泡又迅速发育并表现发情。 B.采用具有溶黄体作用的前列腺素及 其类似物，使卵巢上的功能黄体同时迅速 溶解、消退，使卵泡解除抑制并迅速发育， 从而导致母畜的同期发情。
第八章 动物早期胚胎操作
• • • • 一、胚胎移植技术 二、胚胎分割技术 三、嵌合体技术 四、细胞核移植技术
第一节、胚胎移植技术wenku.baidu.com
• 一、胚胎移植的概念及生理基础和原则： • 概念：借助一定的器械，从一头优良雌性 动物的输卵管或子宫内取出早期胚胎，移 植到另一头处于相同生理阶段的雌性动物 的相应部位，使之继续发育成为新个体。 即借腹怀胎。 • 供体：提供胚胎的个体，一般为良种。 • 受体：接受胚胎的个体，提供胚胎孕育时 间和空间。
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二、胚胎移植的技术程序
• • • • • • • • 1.供体和受体的选择 2.供体的超数排卵处理 3.同期发情处理 4.供体早期胚胎的收集 5.胚胎的检查 6.胚胎的保存与培养 7.胚胎的移植 8.供体和受体的术后观察
一）供体和受体的选择
• 供体应具有相当高的育种价值 • 供体生殖机能应处于较高的状态：无生殖 系统疾病，体质强健 • 受体应容易购买，繁殖性能好，对地方适 应性强，体型中上等，非优良品种 • 受体健康状况良好，已进入发情季节 • 供受体发情时间应接近或一致
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3.胚胎分割方法： 1）willadsen法 2）williams法 3）铃木分割法 4）显微吸管分割法 5）徒手分割法
• (1)桑椹胚之前的胚胎 （Willianms分割法） 这一阶段胚胎因为卵裂球较大，直接切 割对卵裂球的损伤较大。 常用的方法是用微针切开透明带，用微 管吸取单个或部分卵裂球，放人另一空透明 带中，空透明带通常来自未受精卵或退化的 胚胎。
促性腺激素、人绒毛膜促性腺激素和促性腺激素释放激素 （GnRH)等。
四）供体早期胚胎的收集
• 胚胎的收集是指在配种或输精后的适当时 间，从超排供体回收胚胎，以准备给受体 移植，简称采胚。 • 一般将配种当日记为0天，从配种后第二天 开始计算采胚天数。 • 不同动物早期胚胎发育速度和到达子宫的 时间各有差异（p314，表12-3），应根据 采胚目的来选择合适的采胚时间。
二）胚胎移植的基本原则
• 胚胎移植前后所处的环境的同一性 – 供体和受体在分类学上的相同属性。 – 动物生理上的一致性：受体和供体在发情时间上的 同期性。 – 动物解剖位置上的一致性：空间环境的一致性 • 胚胎发育的期限：胚胎日龄不能超过周期黄体的寿命。 • 胚胎的质量：胚胎必须是正常的，并在处理过程中不 受不良因素的影响。
• (2)桑椹胚和囊胚的分割 对于这一阶段的胚胎， 通常采用直接切割法， 操作时，用微针或微刀由胚胎正上方缓慢下降，轻 压透明带以固定胚胎，然后继续下切，直至胚胎一 分为二，再把裸露半胚移入预先准备好的空透明带 中，或直接移植给受体。在进行囊胚切割时，要注 意将内细胞团等分（P325 图12－18） 。
3.用于同期发情的激素和使用方法：用于同期发情的激素 及其类似物可分两类：
一是抑制卵巢上的卵泡发育和发情表现的孕激素类物质；
二是促使黄体溶解和消退的前列腺素制剂； 另外，还有一些是在以上两类激素施用基础上，为获得 更好的发情和受胎效果，用来促进卵泡的生长、成熟和排卵
的一些辅助激素，主要有：促卵泡素、促黄体素、孕马血清
• 超数排卵的意义
采用超数排卵可大大增加每次的排卵数量 • 在科研上可以在短时间内取得大量的卵和 胚胎，可以满足胚胎工程研究、遗传工程 研究和建立胚胎库的需要。大大缩短了研 究周期 • 在生产中，可以提高优秀动物的繁殖数量， 提高产量，增加经济效益。
超数排卵方法
1.小鼠的超数排卵 腹腔注射PMSG 10U，一 般选择在中午注射，间隔 48小时后注射HCG，光照 周期保持12～14h，
2.牛的超数排卵
1）促卵泡素(FSH) 减量注射法：供体牛在发情 后的 9 ～ 13d 肌注 FSH ，早晚各一次，间隔 12h ，分 4d减量注射。在第3d时同时宫注PGF2α 2.0～2.4mg 或氯前列烯醇0.6mg。如使用国产FSH总剂量为325 单位时，处理方法如附图所示。超排剂量根据不 同厂家激素确定适宜剂量，国产激素 320 ～ 360 单 位，进口激素28～36mg。
二）供体的超数排卵处理
• 超数排卵： 雌性动物间情期内，注射外源促性腺激素，诱 发其卵巢上大量卵泡发育并排卵的方法称为超数排 卵 • 超排原理： 外源激素可以改变卵巢上只有一个或少数卵泡 成熟排卵的定势，解除单胎动物优势卵泡发育对同 一拨其他卵泡发育的抑制作用，促使同一拨卵泡群 中大部分卵泡能够发育成熟并排卵。 • 动物常用超排激素： PMSG、FSH、LH、PGF2α、GnRH、hCG等
• 采胚方法：
• 大家畜：手术法 • 非手术法
• 小鼠等实验动物：处死动物，解剖法。
• 手术法： • 早期胚胎（如4d以前）的收集： • 剖腹，拉出输卵管和子宫，从子宫角尖端（牛、 羊）或输卵管末端（猪）注入冲胚液，从输卵 管伞部接取冲胚液。 • 晚期胚胎（胚胎已经进入子宫角）的收集： • 从子宫角上端注入30—50ml的冲胚液，由基 部接取，或由基部入针，从上端接取。
一、胚胎切割的基本程序
• 1.切割器具的准备
器械：倒置显微镜和显微操作仪。 胚胎固定管：末端钝圆，外径与所固定
胚胎直径相近，内径一般为20~30um。 切割针：玻璃针和微刀两种。玻璃针一 般用实心玻璃棒拉成，微刀是用锋利的金 属刀片与微细玻璃棒粘在一起制成
玻璃针进行胚胎分割
微刀进行胚胎分割
• 2.胚胎预处理： 为了减少切割损伤，胚胎在切割前 一般用链霉蛋白酶进行短时间处理，使透明带软化 并变薄或者在显微操作仪下直接去除透明带。
大动物手术法采胚
• 非手术法： • 此法一般适宜配种后6-8天胚胎的收集。 • 母畜保定---尾椎硬膜外腔麻醉---插入三通管 ---由充气孔注水或气体至气球膨胀，使子宫 角基部堵塞---30-60ml冲胚液从注射孔灌入， 充满整个子宫角---辅以按摩子宫，或将子宫 角倒提等方法令冲胚液回流，从回收孔收集。
牛超数排卵示意图
2）.PMSG法
孕马血清促性腺激素(PMSG)处理法 在情期的 11 ～ 12d ，一次肌注 PMSG2500 ～ 30001U ， 48h后宫注PGF2α 2.4mg。发情后约18h肌注等量的 抗PMSG。
发情观察和配种
PGF2α 处理后40～48h，大部分处理牛发情。 通常要求从注 PGF 第 2d 傍晚开始观察发情，至少 早晚各观察一次。在观察到接受爬跨后 4 ～ 6h 进 行第一次输精，间隔 12h 后第二次输精。每次有 效精子数不得少于 50 × 10 6 ，输入两侧子宫角或 子宫体。注意输精时不得触摸卵巢。
六） 胚胎移植
• 手术法胚胎移植：
大动物非手术法胚胎移植
• 目前牛的胚胎移植主要采用非手术法。人 工受精管中装入胚胎，通过子宫颈后注入 所装胚胎即可。 • 注意： • 移植前应保证受体牛生殖道无病理情况 • 移植中要尽量减少对生殖道的刺激，以免 引起子宫收缩排出移植胚。
• 在体视显微镜下观察输卵管伞，并用 移卵管吸取胚胎，次序为石蜡油、空 气泡1、培养液、空气泡2、胚胎(尽可 能少带入培养液)。空气泡3、培养液。
三）同期发情
（一）同期发情（同步发情）：用人工的方法对母畜发情
周期进行同期化处理的方法叫同期发情。在胚胎移植技术
中，受体子宫和供体胚胎处于高度同步化状态才有利于移 植胚的发育。 1.同期发情在畜牧生产中的意义：A.便于集中或定时对一群 母畜进行输精；B.可做到同期配种，从而使母畜的妊娠、分
娩、幼畜的培育相对集中，提高生产效率和经济效益。C.利
• 小鼠等实验动物的采胚： （1）输卵管采胚法： 以脱颈椎法杀死受精1天后的母鼠（此时胚胎 一般处于2细胞期），暴露子宫、输卵管；剪下子 宫、输卵管，置于平皿中；在灭菌平皿中剪下输 卵管置入盛有冲卵液的集卵杯中，在体视显微镜 下撕开壶腹部，释放受精卵并用用新鲜的培养液 洗1–2次。
• 用透明质酸酶处理受精卵细胞团
胚胎移植的意义
• 1. 充分发挥优良母畜的繁殖潜力，加快优 良品种的改良。对牛羊等繁殖力较低的优 良品种来说，结合人工受精技术可克服其 产仔数和世代间隔的限制。 • 2. 体外受精、胚胎嵌合和核移植等技术都 必须通过胚胎移植获得活体。 • 3. 结合胚胎冷冻可长期保存珍贵遗传资源， 并且方便它们的运输。
一）胚胎移植的生理学基础
• 成年母畜卵巢上存在数千到上万个卵泡，在 外源激素作用下，每个发情期的卵泡发育和 排卵数可达十数个 • 每个发情周期生殖器官都有一个孕向发育 • 早期胚胎处于游离状态 • 胚胎发育不存在免疫问题 • 胚胎发育到一定阶段会与子宫发生生理和组 联系 • 胚胎的遗传性不受受体的影响