高效液相色谱柱的选择、使用与维护

第 二十 一卷 第六册
２１ ０ １年 １ ２月
口 腔 护 理 用 品 工 业
Ｏ ＲＡＬ Ｃ Ｅ Ｉ ＡＲ ＮＤＵ Ｔ Ｓ ＲＹ ３ ７
高 效 液 相 色 谱 柱 的选 择 、 用 与 维 护 使
郑 伟 孙 东方
（ 黑龙江省轻工科学研究院 哈尔滨 １０ １ ） ５ ０ ０
高效液相色谱 （ Ｐ Ｃ 是 ２ 世 纪 ６ ＨＬ ） ０ ０年代后期
１ 液相 色谱柱 的填 料 １１ 硅胶 基质 填料 ． １１ １ 正相 色谱 ．．
正相色谱用的固定相通常为硅胶 （ｉｃ） 以及 Ｓｉ ， ｌａ 其他具有极性官能团 ， 如胺基 团（ Ｈ ， Ｐ ） Ｎ Ａ Ｓ 和氰基 团（ Ｎ Ｃ Ｓ 的键合相填料 。由于硅胶表面 的硅羟 Ｃ ，Ｐ ）
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郑
伟， ： 等 高效液相色谱柱的选择 、 使用与维护
２ １ 年第 ６期 ０１
料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保 留能
力更 强 ， 墨化 碳可 用 于分离 某些几 何 导构体 ， 由 石 又 于ＨＬ Ｐ Ｃ流 动相 中不会 被溶 解 ， 柱 可在 任何 Ｐ 这类 Ｈ 与 温度 下使 用 。氧 化 铝 也 可 用 于 Ｈ Ｌ 氧 化 铝 微 Ｐ Ｃ，
与分析色谱柱的填料完全相匹配。
对 于选择 保 护柱 的原 则 是 ： 满 足分 析 分 离要 在
②尽可能将色谱 柱贮存 于 １０ ０ ％有机溶剂 （ 乙 晴最好 ） 避免在缓 冲溶液中保存 。 中， ③使用缓冲溶液后的色谱柱 ， 应用 １ ２ 倍柱 ５— Ｏ
体 积 的不含 缓 冲剂 的 同种水～ 有 机溶 剂 流动 相 冲洗 色谱 柱 ， 换成 １０ 后 ０ ％有 机溶 剂储 存 。
４ ２ １ 与化学 有关 的拖 尾 问题 ． ． ａ 流动相 中 ， 入 ３ ｍ 的三 乙胺 （ 与碱 性 化 ． 加 ０Ｍ 用
合物） 或醋 酸胺 （ 与 酸性 化 合 物 ） 未 知 化 合 物 加 用 ，
醋酸 三 乙胺 ； ｂ 如仍 然 拖 尾 ， 三 乙胺 换 为二 甲基 辛 胺 （ ． 将 或
市 场调 查及 投 资策 略 分 析 报告 中估 计 ， 国 每年 消 中 耗 的分 析 型反相 色 谱 柱 达 ５万 支 ， 些 被 污 染 的 色 这
聚合物调料多为聚苯乙烯 一 乙烯基苯或聚甲 二 基丙酸酯等 ， 其主要优 点是在 Ｐ Ｈ值为 １ １ — ４均可
使用 。相 对 与硅胶 基 质 的 Ｃ ８填料 ， 类 填 料 具有 １ 这 更强 的疏 水性 ； 孔 的 聚合 物 填 料对 蛋 白质 等 样 品 大
最先 被 冲 出 ， 而极 性 弱 的组 份 会 在 色谱 柱 上 有更 强 的 保 留 。 常 用 的 反 相 填 料 有 Ｃ ８（ Ｄ 、 ８ １ Ｏ Ｓ） Ｃ （ Ｓ 、４ Ｂ 、６Ｉ（ ｈｎ１等 。 ＭＯ ） Ｃ （ ） Ｃ Ｉ Ｐ ｅｙ） － ５
１ ２ 聚合 物 填料 ．
谱柱的使用寿命可能只有百余 次 ， 而且每种 色谱柱 适用的样品有限， 一次错误进样甚至可能导 致色谱 柱失效 。中国市场调查研究 中心在中国反相色谱柱
替甲醇 ， 以降低色谱柱的压力。
３ 如 何保 证 良好 的柱性 能与柱 寿命 要做 到 以下几 点 ：
认证阅读色谱柱使用说明书 ；
使用填充 良好 的色谱柱 ；
尽量减少压力波动 ， 避免机械及热冲击 ； 使用保护柱及在线过滤器 ； 经常以强溶剂冲洗色谱柱 ；
充分 过滤样 品及 流动 相 ， 量 避 免 杂 质微 粒 与 尽 强保 留成 分 ； 用稳 定 的固定相 （ １ Ｃ ８最稳 定 ） ； 在 中等 Ｐ Ｈ值操 作 （ ６～８ ， ） 用有机 缓 冲溶液 ；
的分离非常有效。现在的聚合物填料的缺点是相对 硅胶基质填料 ， 色谱柱柱效较低。 １３ 其他无机填料 ．
其它 Ｈ Ｌ Ｐ Ｃ的无机填料色谱柱也 已经商 品化。
由于其特殊的性质 ， 一般仅限于特殊的用途 。如石 墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料。这种填料 的分离不同与硅胶基质烷基键合相 ， 石墨化碳 的表 面即是保留的基础 ， 不再需其它的表面改性 ， 该柱填
的色 谱填 料 。但是 ， 根据 实 际 的分 析工 作 ， 可不必 也
２０ ｐ ０ ｐｍ的叠氮钠 以抑 制细菌 成长 （ 一定 当心其毒
性 和潜在 的爆 炸 性 ） 或 在 流 动 相 中加 ２ ％ 的有 机 ； ０
改性剂 ， 也可抑制微生物生长 ， 有机改性剂还有助于
流动 相脱 气 。
谱柱有一部分经简单 的方法进 行清洗后 ， 可恢 复部 分甚至大部分离能力 ， 不仅节省资源 ， 还能大大降低 分离分析的成本 。 色谱柱的选择 、 使用与维护方面的研究具有 十 分重要的现实意义 ， 也一直是色谱工作 者和仪器厂 商关注的热点。很多色谱专著介绍过相关知识 ， 并 提出许多简单有效的方法 ， 色谱柱 厂商也推荐对 各 应其商品色谱柱的经验性方法。
求的前提条件下 ， 尽可能的选择较短的保护柱结构 ，
尽 可能 选择对 分 离样 品小 一些保 留性 的填 料 。
７ 色谱 柱 的清洗 与再 生
④避免用纯净水冲洗键合致密的 Ｃ ８ 。 １柱
被污染的色谱柱 ， 根据其具体情况 ， 应选择合适 的清洗与再生方法进行清洗 ， 一般可将其柱效提高
样品溶剂不合适 ；
柱外 效 应 ； 化 学或 二次保 留（ 硅羟基 ） 效应 ； 缓 冲容 量不 足或 不合适 ；
重 金属 污染 。
４ ２ 如 何解 决峰 形拖尾 的 问题 ．
高柱效可提高分离度 ， 但不是唯一的因素。如果 固
定相 选择 是正确 ， 是分 离度不 够 ， 么选 择更 小粒 但 那 度 的填 料 是很 有 用 的 ，ｕ ３ ｍ填 料 填 充 柱 的柱数 比相 同条 件 下 的 ５ ｒ 填 料 的 柱 效 提 高 近 ３ ％ ； 而 ， ｕ ｎ ０ 然 ３ ｍ 的色 相谱 的背 压却 是 ５ ｍ 的 ２倍 。与 此 同时 ， ｕ ｕ 柱效 提高 意味 着在相 同条 件下 可 以选 择更 短 的色谱 柱， 以缩短 分 析时 间 ， 外 ， 以采 用 低 粘 度 的溶 剂 另 可 做流 动相 或增 加色 谱 柱 的使 用 温 度 ， 比如 用 乙腈 代
基 （ ｉＨ） 其 他 团 的极 性 较 强 ， ＳＯ 或 因此 ， 离 的 次序 分 是依 据样 品 中的各 组 份 的极 性 大小 ， 即极 性 强 弱 的
色谱柱极易被污染 ， 是导致柱压升高、 分离能力下降
的原 因之 一 。通 常 ， 品 中含 有 一 些 对 分 析 不利 的 样
组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相 极性相对 比固定 相低 ， ： 乙烷 （ ｅａｅ ， 如 正 Ｈ ｘｎ ） 氯仿 （ｈ ｒｏ ， Ｃ ｌ ｏ ｒ 二氯 甲烷 （ ｅ ｙ ｎ ｈ ｒ ｅ 等。 ｏ ｆｍ） Ｍ ｔ ｌ ｅＣ ｌ ｉ ） ｈｅ ｏｄ
色谱柱 使用 温度最 好小 于 ４ ￣ ０Ｃ；
硅胶基质的的色谱柱 ， 应保持 流动相的 Ｐ Ｈ值
范 围在 ３ ０— ． ． ８ ０；
在水 流 动 相 与 缓 冲 溶 液 中 加 ２０ ｐ 的 叠 氮 ０ｐｍ
钠； 流动 相 中含 有 缓 冲溶 液 ， 注 意应 ９ ：５的水 应 ５ 及有 机溶 剂过 渡 ， 机溶剂 不 能低 于 ５ ； 有 ％
发展起来的一种色谱 方法 ， 已成为现代分离测定 的
重要手段 ， 广泛运用于石油、 化工 、 食品科学 、 环境及 生物等几乎所有研究领域 。色谱柱是色谱分离系统 的“ 心脏” 分离效果好坏很大程度上取决于色谱填 ， 料的选择。但是色谱填料的选择 范围很宽 ， 要做合
适 的选 择 ， 必须对 此 有一 定 的认识 和 了解 。 由于 被分 析样 品种类 繁 多 ， 之 样 品基 质 复杂 ， 加
１１２ 反相 色谱 ．． 反相 色谱 填料 常是 以硅胶 为基 础 ， 面 键 合有 表
物质 ， 这些非 目标物能被检测器检测到而形 成色谱 峰、 气泡、 基线 漂移或负峰 。其 中保 留值 较弱 的物 质， 一般能快速从色谱柱洗脱 出来 ， 对分析不产生干 扰； 中等保 留强度的杂质能被缓慢冲洗出来 ， 可对分 析产生一定的干扰 ； 强保 留杂质通常难以被洗脱 ， 多 次上样后 ， 聚集在柱头或色谱柱中， 有的分析物甚至
粒刚性强， 可制成稳定的色谱柱柱床 ， 其优点是可在
Ｐ Ｈ高 达 １ ２的流 动相 中使用 。但 由于 氧化铝 与碱 性 化 合物 作用 也很强 ， 用范 围受 到一定 的 限制 ， 以 应 所 未 能广 泛应 用 ， 型 氧化 锆填 料也 可用 于 Ｈ Ｌ ， 新 Ｐ Ｃ 商 品化 的仅有 聚合 物涂 层 的多 孔 氧化 锆 微 球 色谱 柱 ， 应 用 Ｐ 范 围 １ ４ 温度 可 达 １０ｃ。 由于氧 化 锆 Ｈ —１ ， ０ｃ 填 料几 年才 开始研 究 ， 加之 面临 的实验 难度 ， 其重 要
可 能在 使 用时 与填 料 发 生 相 互 作 用 ， 些 被 吸 附 的 这 杂 质 累积 到一定 程 度 后 会 形 成 新 的伪 固定 相 ， 而 从 改 变 色谱 柱 的性 能 。对 于 基质 复 杂 的样 品 ， 根 色 一
极性相对较弱的官能团的键合相。反相色谱所使用 的流动相极性较强 ， 通常为水 ， 缓冲液与 甲醇 ， 已腈 等混合物 。样品流 出色谱柱的顺序是极性较强组合
用 途 与优势 尚在进 行 中 。 ２ 怎样 选择 填料 粒度
过夜 或贮存 时 ， 冲洗 掉盐 和缓 冲液 ， 纯有 机溶 用 剂 流动相 保存 （ 乙晴 最好 ） 。
４ 色谱柱 使用 过程 中 出现 问题 的解 决
４ １ 造成 色谱峰 （ ． 不对称 ） 拖尾 的原 因
色谱柱本身填装问题 ， 筛板堵塞或填料塌陷 ；
柱头 有污染 ； 样 品超 载 ；
目前 ， 品 化 的 色 谱 料 粒 度 从 １ｍ 到 超 过 商 ｕ ３ ｕ 均有 销 售 ， 目前 分 析 分 离 主要 用 ３ｍ、ｕ ０ｒ ｎ 而 ｕ ５ｒ ｎ 和 １ｕ ０ ｍ填 料 ， 料 的 粒 度 主 要 影 响 填 充 柱 的 两 个 填 参数 ， 即柱 效 和 背 压 。粒 度 越 小 ， 充 柱 的 柱 效 越 填 高 ； 于 ３ｒ 的填料 应用 ， 相 同选 择 性 条件 下 ， 小 ｕ ｎ 在 提
５ ％ 以上 。对 硅 胶基 质 反 相 柱 ， 染 情 况较 轻 时 可 ０ 污
醋酸 二 甲基 辛胺 ） ； Ｃ降低进 样量 至 ≤ｌｇ ． ｕ。 ４２２ 与色谱 柱有 关 的拖尾 问题 ．． ａ如柱 头处 有强 保 留的样 品组 分 积 聚 ， 相 柱 ． 反 可 用 ２ 柱体 积的 ９ ％ 的二碌 甲烷 与 ４ 甲醇 ， ０倍 ６ ％ 加 １ 氢氧化 铵混 合液 冲洗 ， 向柱可用 甲醇 冲洗 。 ％ 正 ｂ使 用保 护柱 。 ．
４ ２３ 与 Ｈ Ｌ ．． Ｐ Ｃ系统有关的峰拖尾和峰加宽
ａ进样 体 积过大 ，通 常 ＜２ｕ ） ． （ ￣ ５Ｌ ；
ｂ 进样阀与色谱柱及检测器之间的管路体积过 ． 大（ 最佳连接管应 ￣ ０ｍ， ＜ ｃ 内径为 ００ ７） ２ ．０ ” ；
Ｃ ．检测 器流 通池 的体 积过大 。 ５ 色谱 柱 的储存 ① 防止缓 冲溶 液 和 水溶 液 流 动 相 产生 微 生 物 ，
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郑
伟， ： 等 高效液相 色谱 柱的选择 、 使用 与维 护
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做 到 流 动 相 用 多 少 配 多 少 ， 在 水 流 动 相 中 加 或
是否可以更换保护柱柱芯。可以降低保护柱的使用 成本。大多数人是根据色谱分析柱的填料选择保护 柱的填料 ， 正常情况下可 以选择与分析色谱柱一样