实验一培养基母液的配制
一、目的要求
通过对MS培养基母液的配制，学习掌握培养基母液配制方法。
二、说明
在配制培养基时，为了取用方便和提高各种药品称量的准确性，往往先把各组成成分按其需用量配成扩大一定倍数的浓缩液，即母液贮存备用，用时稀释。配制母液时，一般按药品的种类和性质分别配制，单独保存或几种混合保存。如把所有大量元素配在一起，配成大量元素母液，把微量元素放在一起配成微量元素母液，以及单一的维生素、铁盐、植物激素等母液。母液扩大的倍数主要取决于用量的多少，用量大的扩大的倍数宜低，反之则高，但要注意过高浓度和不恰当的混合会引起沉淀，影响培养效果。
三、仪器和药品
电子天平1/1000、1/10000。药品按MS培养基配方准备。激素按需要准备。
四、方法和步骤
一）、大量元素母液：
因大量元素用量大，为避免过高浓度的混合液会发生沉淀，一般配成10倍的母液。根据所选培养基配方，按大量元素在表中排列顺序，以其10倍用量用1/1000天平逐个称出，按次序加入盛有蒸馏水的烧杯中，并搅拌。注意每种溶解后，再加下一种。原则上应注意把Ca2+与SO4-PO4错开，以免产生沉淀，最后加蒸馏水定容至刻度，此即大量元素母液。配培养基时，每配一升，取母液100ml。
二）、微量元素母液：
微量元素因用量小，为称量方便及精确，常配成100倍或1000倍的母液，即将每一种微量元素化合物的量扩大100倍或1000倍，分别称量、溶解、定容，方法向上。配1升培养基取母液10ml或1ml。
本实验配成100倍。
三）、铁盐
铁盐不是都需要单独配成母液，如柠檬酸铁，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的铁盐为FeSO4· 7H20，由于在使用过程中容宜产生Fe（OH）3沉淀，一般先将其
配成螯合物。常配成100倍称取FeSO4· 7H2O，Na2-EDTA，分别加热溶解，然后混合、定容，或混合后加热，至呈黄色，定容。每配制1升用10ml。
注意：在配制铁盐时，如果加热搅拌时间过短，会造成FeS04和Na2-EDTA 鳌合不彻底，此时若将其冷藏，FeSO4会结晶析出。为避免此现象发生，配制铁盐母液时，FeSO4和Na2-EDTA 应分别加热溶解后混合，并置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色(约加热20 - 30 min)，调pH值至5 .5，室温放置冷却后，再冷藏。
四）、有机物质：
主要指氨基酸及维生素类物质，配成100倍母液。按100倍量分别称取、定容，方法同上。配一升培养基取母液10ml。
注意：由于维生素母液营养丰富，因此贮藏时极易染菌。被菌类污染的维生素母液，有效浓度降低，并且易给后期培养造成伤害，不宜再用。避免此现象发生的方法是:配制母液时用无菌重蒸馏水溶解维生素，并贮存在棕色无菌瓶中，或缩短贮藏时间。
上述四种MS培养基母液的配制见表1-1
五）、植物激素：
各种激素是分别用感量为0.0001g的分析天平称量，分别用容量并配成所需浓度（0.2-1mg/ml）的单一母液。用时，根据不同的配方要求分别加入。最常用的植物激素有：
1)、生长素：如2,4-D，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA），吲哚丁酸（IBA）等。对于这类物质，配制时先按要求称好药品，置于小烧杯或容量瓶中，用少许0.1N NaOH溶解，或用少量95%酒精溶解，再加水定容至所需浓度。
2）、细胞分裂素：如玉米素（Zt）、6-苄基嘌呤（BAP），激动素（KT），异戊烯腺嘌呤（2-iP）。配制这类物质类时，应先用少量0.5或1N HCl溶解，然后再加水定容。
3）、赤霉素：常用GA3。配制时，先用少量95%酒精溶解，然后再加水定容，过滤灭菌。
以上所说的各种母液均应倒入试剂瓶中，贴好标签，注明母液名称、倍数（或浓度）、日期，并应放入2-4℃冰箱中保存存，以免变质、长霉。使用时，如出现浑浊或沉淀以及微生物污染，则不宜再用。至于蔗糖、琼脂等可按配方中要求酌情变动，随称随用。
五、作业：
1、欲配制MS（1962）培养基附加IBA0.2mg/1，BA2mg/11000毫升、500毫升、300毫升，需取用各母液各多少毫升？请列表说明。
2、在母液的配制、贮存及使用中应注意哪些问题？
表1-1 MS培养基母液的配置
实验二培养基配制与灭菌
一、目的要求：
以MS培养基为例，熟悉培养基配制与灭菌的操作方法。
二、说明：
培养基是将植物细胞或组织生长所需要的各种营养物质，用人工方法配制成的一种营养基质。除含有水份、碳水化合物、无机盐外，还有各种必要的维生素、有机附加物及生长调节物质。并根据植物细胞或组织生长的需要，将培养基的PH值调节在一定范围内。按照是否在培养基中加入琼脂等凝固剂，培养基又分为固体培养基和液体培养基。由于不同的植物细胞或组织营养要求不同，人们设计了各种培养基。常用的基本培养基有MS 培养基（Murashige and Skoog,1962）,B5培养基（Gamborg et al,1968）,N6培养基（Chu et al,1974）等。
培养基含有的各种营养物质，对细菌和霉菌等微生物来说也是很好的营养物质。微生物在培养基中往往比植物细胞生长更为迅速，并且产生霉素，可致植物细胞死亡。因此，为防微生物污染，培养基配制好后需及时进行灭菌处理。
三、仪器和药品：
普通天平，烧杯（100ml、300ml、500ml），三角瓶（50ml），量筒（50ml、500ml），移液枪（10ml、2ml、1ml、0.1ml）、搅拌器、PH仪、培养瓶等。
蔗糖、琼脂、1N HC1，0.1N HC1，1N NaOH，培养基母液。
四、方法和步骤：
一）、MS培养基的配制：
MS培养基组成见附表1-1，取用实验一配制的母液，每组配制1000ml分装20瓶。
1、根据MS培养基配方，各种母液的浓度及要求配制的总量，计算好需各种母液的量。取1000ml烧杯一只，加入700ml水，用量筒和移液枪量取大量元素、微量元素、铁盐、有机物等母液，按需要加入植物激素（浓度临时确定）。
2、加入30g蔗糖，磁力搅拌器溶解后，定容至1000ml。
3、用1M NaOH（或KOH）或0.1M HC1将PH调整5.8。
4、加入8g琼脂粉，微波炉溶化。
5、分装, 封口（塑料盖、铅铂纸等）。
二）、培养基的灭菌：
培养基灭菌的方法有多种，但似高压蒸汽灭菌法最为常用。其方法：
