实验 溶菌酶的粗提取、分离纯化及酶活力、纯度及分子量测定

（提取）：把酶从生 物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可 能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。
高度纯化（fine fractionation）
（精纯化）：除去与产
物性质相似的杂质。
纯化方案评价：酶活力、蛋白浓度、纯度
6
粗纯化（ 提取）目标：
a. 将目的酶最大限度地溶解出来。
b. 保持生物活性。
26
3. 操作
2）洗脱:
平衡
上样 冲洗 洗脱
再生
1）上样：上样体积不十分严格。 增加溶液的离子强度 梯度洗脱法 （连续、不连续）改变溶液的pH值 3）再生：0.5-1mol/L NaCl溶液处理。
4.应用
制备纯化生物大分子
27
梯度洗脱方式
28
图4-39 梯度溶液的制备方法和洗脱曲线 （a）线性梯度；（b）凸形梯度；（c）凹形梯度；（d）编程梯度
5. 酶活力及比活性计算：
U=(ODn-OD2)/0.001*T(min)*0.2 C(mg/ml)=A280/13 6. 纯化回收率及纯化倍数计算 US2*V2 US1*V1 S2比活力 S1比活力
回收率＝
×100％
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纯化倍数＝
7. 完成下表
样品 S1 S2 体积 ml V1＝ V2＝ 蛋 白 浓 度 总蛋白 mg/ml mg 活力 u/ml 比活力 u/mg 总活力 U 回收率 提 纯 倍 数 % 100 1
(可吸附带负电的蛋白质)
阳离子交换剂
(可吸附带正电的蛋白质 ) 22
两种离子交换剂
阴离子交换剂： 常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羟丙基 DEAE －C2H4N+(C2H5)2H

QAE

－C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3
阳离子交换剂： 常用羧甲基 CM 磺丙基 SP
10
高速离心机
6000〜 25000
超速离心机
>25000
离心的形式

角式及水平（外摆）式：水平式一般为低速。

角式由低速到超速均有。
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角式离心机和离心头（转子）

角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作 注意稳、盖、旋紧。
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离心管
材质：玻璃， 塑料 强度：和离 心速度相配 大小：和转 子配套 高速超速管 要加盖
Gel Filtration
Ion Exchange
Hydrophobic Interaction
Affinity
Reversed Phase
17
实验二、溶菌酶的分离纯化及酶活力 、蛋白浓度测定
目的：
1. 掌握离子交换层析原理及层析操作所需的必须原
件。
2. 掌握层析柱填装方法及层析填料的保存
3. 掌握比色法测定溶菌酶的浓度与酶活
比色皿
PBS缓冲液/ml 细胞PBS悬液/ml 酶液S1/ml 酶液S2/ml
1
5 -
2
5 -
3
4.8 0.2
4
4.8
0.2
41
实验步骤：
4. 酶活性测定，以①管（PBS）为对照，每隔30s 测定2,3,4管的 OD600并记录
时间（s） 2号 3号 4号 0 30 60 90 120 150 180
测压法：产物中有气体，测气压增加量。
滴定法：产物中有酸生成，用碱滴定。 荧光法：产物中有荧光物质生成或产物与荧光试剂 反应生成荧光产物可用此法。 旋光法：产物中有旋光物质可采用此法。 除了以上方法外，还可根据产物的性质采用其它方法。
4. 回收率和纯化倍数
提纯后酶总活力 提纯前酶总活力
回收率＝
×100％
纯化倍数＝
每次比活力 第一次比活力
实验2.2溶菌酶的活性测定
实验材料： 1. 枯草芽孢杆菌悬液
2. S1，S2
3. PBS等
4. 分光光度计、比色皿、计时器、离心机等
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实验步骤：
1. 取6ml 菌悬液，3500rpm*5min，弃上清，沉淀 6ml PBS重悬。
2. 测定OD600并记录（吸光度0.5~1.0，若读数过高可适当稀释） 3. 测定样品准备（酶液务必在仪器等条件准备好，临测定前加 入）

13
离心机操作

平衡、定温、定速、定时。
14
实验一、 溶菌酶的粗提取——略
15
酶精纯化常用技术
透析

膜分离技术
超滤
凝胶过滤（分子筛/排阻）层析 离子交换层析 疏水层析 吸附层析

柱层析技术
亲和层析

蛋白质结晶
反相层析
16
Principles of Operation for Chromatography Techniques
44
1.原理
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳
（sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel 用于蛋白纯度及蛋白质亚基相对分子量
electrophoresis, SDS- PAGE）简称SDS－ PAGE。 （relative molecular mass, Mr）测定。
29
层析柱的制备与层析操作 柱层析的设备:
层析柱、蠕动泵（恒流泵）、检测仪、 部分收集器、梯度洗脱器。
30
层析设备
层析装置： 梯度混和器 蠕动泵 层析柱 监测仪 记录仪 收集器

31
记录仪
32
现代化层析设备 ——AKTA
层析柱 XK BPG
实验2.1 层析柱的填装

制，能被Mg2+，Ca2+、NaCl所激活
3
4
溶菌酶理化性质：相对分子质量14700 Da，由 129个氨基酸残基构，pI:~10.8，最适温度为 50℃，最适pH为6～7左右。280nm的消光系数 为13.0
5
背景知识： 酶的提取、分离纯化
初步纯化（rough fractionation）
实验1-3 溶菌酶的提取分离及鉴定 （酶活力、纯度及分子量测定）
1
实验内容
1. 溶菌酶的粗提取 2. 溶菌酶的分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定 3. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定
2
背景知识
溶菌酶（lysozyme）：胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质
聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水 解致病菌中黏多糖的碱性酶。 生物学效应：主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰 氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可 溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。该酶活 性可被一些金属离子Cu2+，Fe2+，Zn2+以及N-乙酰葡萄糖胺所抑

c. 填料倾倒入柱管内前先加入少量水覆盖柱底 d. 柱拆卸后填料务必回收，并保存于20%乙醇中。
35
二、酶的活力单位及酶活测定：
1. 酶活单位： 1961 年国际生化协会酶学委员会统一规
定，酶的国际单位（ IU ）规定为：在最适反应条件（温度 25℃）下，每分钟内催化 1微摩尔（μmol）底物转化为产物 所需的酶量（或1分钟内转化底物生成1微摩尔产物的酶量）
Fra Baidu bibliotek
2.离子交换填料：
离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。
纤维素 琼脂糖 —O—CH2—COO-—Na+ 葡聚糖
载体 电荷基团 反离子
21
离子交换剂
--带有电荷基团的不溶性载体
CH2CH3
载 -O-CH CH N-H Cl2 2 体
CH2CH3
Diethylaminoethyl (DEAE)
阴离子交换剂
因此，蛋白质—SDS复合物(SDS-denatured protein)在凝胶中
的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度 （蛋白质分子量）有关。
46
SDS-PAGE separates proteins by MW
47
蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关 系，符合下式：logMW=K-bX MW：分子量；X：迁移率；k、b均为常数 将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质 在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率即可

溶菌酶的活力单位（U）：在室温，pH8.0的条件下，
OD600每分钟降低0.001为1个活力单位。

280nm的消光系数为13.0，根据 A=ECL 可粗略测定溶菌酶 浓度，用于酶比活的评价。
19
离子交换层析
（ion exchange chromatography，IEC）
20
1.原理:根据待分离物质带电性质不同的分离 纯化方法。

注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，
一般采用低温下（0~10℃）操作。
提取原则
a. 相似相溶。
b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
7
离心分离 （一）基本原理 1. 离心力
Fc = m ac ＝ m r ω 2 ＝ m r （2 N/60）2 N为离心机每分钟转数 （r/min ）； Fc通常以相对离心力RCF（relative centrifugal force）表 示，即离心力F的大小相当于地球引力（重力常数g）的多少 倍。一般用g（或数字g）表示。 RCF = m r （2 N/60）2 /mg= 1.12 10-5 N2 r 此公式描述了相对离心力与转速之间的关系 旋转半径用r平均代替
称为1标准单位。
2.酶的比活力：
每单位酶蛋白所含的活力单位数。
对固体酶：用活力单位 /mg 酶蛋白、或活力单
位/mg酶蛋白氮来表示；
对液体酶：用活力单位/ml酶液来表示。
很明显，比活力越大，酶的活力越大。
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3.具体测定方法
分光光度法：产物与适当的化学试剂生成有色物质 或产物有紫外吸收的能力可采用此法。
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原理：

根据溶菌酶 pI 10.8，pH 8.0 PBS 中携带？电，与阴/阳
离子层析填料可结合，通过吸附后，提高pH或离子强度将 溶菌酶与其他蛋白进行分离达到纯化目的。

溶菌酶对革兰氏阳性菌细胞壁的酶解作用导致细菌完整性 破坏，OD600值会下降，通过单位时间内（每分钟） OD600值的下降评价酶活性。
r平均=1/2（r大+r小）cm
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通常：
•低速离心以每分钟的转数表示，如：4000r/min。
•高速离心（超速），常以相对离心力（RCF）表
示，如：65000g。 两者可换算或查测算图。
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离心机的种类
名称 低速离心机 转速(r/min) 6000 注意事项 常温，注意样品热变性和离 心管平衡 冷冻（防止温度升高）， 离心管的精确平衡 冷冻＋真空系统（减少空气 阻力和摩擦）， 离心管的精确平衡
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1.原理
SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合
后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因
而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。 SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，引起蛋白质构象改变，使蛋白 质－SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋 白质分子量成正比。
—CH2COO－ —C3H6SO3－
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化学原料合成 ： sephadex sepharose 载体
天然材料制成： cellulose
如：DEAE-Sepharose， CM-Sepharose
24
实验设计原理
利用不同的蛋白质分子在溶液中所带电 荷不同，因而与离子交换剂有不同吸附力
而分离。 溶菌酶pI:~10.8
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实验3溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定
实验目的: 1、通过实验的学习与操作，在实验过程更好的理解SDS-聚丙
烯酰胺凝胶（PAGE）测定蛋白质纯度与分子量的原理与依据；
2、掌握电泳原理以及SDS-PAGE垂直板电泳分析蛋白质技术； 3、熟悉垂直板电泳操作原理和方法，凝胶染色与脱色方法， SDS-PAGE分子量测定图谱的绘制与计算； 4、了解在电泳中分子量标准物的使用。

1.观摩 2.实验步骤 1）测定酶浓度（S-2） C(mg/ml)=A280/13 2）若填料载量为20mg/ml，计算拟纯化100mg 蛋 白需要的填料量和量取量。
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3）装柱要点： a. 用纯水将乙醇保存液置换 b. 柱头及柱底适配器确保无气泡，可用注射器推注 赶气泡，并确保连接管路密闭无泄漏。
pI < 8.0 蛋白质带负电
pI > 8.0 蛋白质带正电
pH8.0
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2. 阴离子交换剂分离蛋白质的过程
- ClCl Cl-Cl -
Cl-
- ClCl Cl Cl- - Cl Cl Cl- Cl Cl- - Cl Cl Cl- - Cl ClCl
+
平衡
吸附
去吸附
低 盐
分离结束
高 盐
再生
利用不同盐浓度将不同蛋白质洗脱下來
在标准曲线上求得分子量。
48
49
2. 分离效应
PAGE根据其有无浓缩效应，分为： 连续电泳（continuous electrophoresis） 采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统 不连续电泳（discontinuous electrophoresis） 采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系