兽医生物制品学ppt课件

兽医生物制品 学
生物技术诊断制剂




随着分子生物学的飞速发展，新型诊断技术不 断涌现，与之相配套的生物技术诊断制剂也应运而 生，尤其是基于分子水平的诊断制剂发展迅猛。生 物技术诊断制剂大致包括 重组表达抗原（recombinant antigen）、 核酸探针（nucleic acid probe, gene probe）、 聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR） 基因芯片（gene chip）等。 生物技术诊断制剂不仅特异性强，而且可以获得 常规方法无法制备的一些诊断制剂，或能克服常规 程序制备的诊断制剂的缺陷。同时，基于生物技术 制备的诊断制剂易于标准化、产业化。


三、核酸探针



用放射性同位素、地高辛或生物素等标记核酸分 子或其片段的一条链作为核酸探针，与处理样本中存 在的互补链结合为双链，这个反应就称为核酸杂交或 分子杂交。核酸杂交可分为DNA-DNA杂交，DNARNA杂交和RNA-RNA杂交。 根据方法不同，核酸杂交又可分为原位杂交和转印 杂交。在转印杂交中，检测DNA的称为Southern杂 交，检测RNA称为Northern杂交。核酸杂交已广泛 用于特定基因的检测和基因转录活性的研究，具有重 要的诊断价值。 核酸探针制备的主要步骤包括目的片段的获取，将 信号分子（如放射性同位素35S、32P，地高辛，生 物素，荧光素等）标记核酸分子或其片段，探针纯化， 质量鉴定，探针保存等。
二、核酸图谱分析


核酸图谱分析包括核酸电泳图谱、核酸酶 切图谱、寡核苷酸指纹图谱等。 适用于这些诊断技术的试剂，主要是核酸 提取、酶切、电泳等生化和分子生物学试 剂，商品化程度已很高。
（一）核酸电泳图谱分析

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核酸电泳图谱是指分离纯化的核酸，由于分子量的差 异而在电泳中迁移速率不同，形成不同的带型。通过带型 异同度的分析可确定生物体间的遗传关系。质粒图谱分析 和RNA图谱分析都是电泳图谱分析。 1．质粒图谱分析 质粒是细菌细胞内能自主复制的染色 体外的DNA，它是耐药性、毒力因子等特殊遗传特性的 载体。多数细菌往往含有大小和数量不等的质粒，具有相 对稳定性，因此质粒图谱分析是细菌分型和流行病学的重 要工具，具有诊断价值。 该法简便、特异、快速、可靠，缺点是对一些无质粒 或质粒不稳定的菌株，以及质粒分子量相同而核苷酸序列 不同的菌株无分辨能力。
一、重组表达抗原



基因工程重组表达抗原是用DNA重组技术，将编码特 定抗原的基因插入原核或真核表达质粒，再转入宿主细胞中 使其高效表达，然后运用生物化学分离、纯化技术，提取表 达产物等，最终制成诊断用重组表达抗原。 近年来，重组表达抗原已显示出独特的优越性，具有高 特异性、高纯度、均质性好、重复性强、成本较低、并可大 批量生产等优点，尤其是应用这一制造技术获得了常规方法 无法制备的诊断抗原，如乙型肝炎病毒等一些病原体尚无法 获得纯培养，但应用生物技术已制备出标准的乙型肝炎各组 分诊断抗原， 对人兽共患病特别是高危险病原体（如免疫缺陷病毒、 结核分枝杆菌、炭疽杆菌等）的诊断抗原制备，应用生物技 术更是具有无可比拟的优点。重组表达抗原的发展前景十分 广阔。
（三）寡核苷酸指纹图谱分析
将纯化的RNA经一种特殊的RNA酶（通常 为T1酶）消化后，产生许多理化特性和大小不 同的寡核苷酸片段，经聚丙烯酰胺凝胶双相电泳 分离后进行放射自显影，形成一类似指纹的图谱， 即寡核苷酸指纹图谱。 该法在RNA病毒的研究中得到了广泛应用， 如基因组遗传多样性研究，同一病毒不同毒株的 地理分布、历史演变和宿主类群关系的研究，野 毒株与疫苗株的比较等。
2．RNA电泳图谱分析


常用的是RNA病毒图谱分析，特别是分节 段RNA病毒的电泳图谱分析。 根据不同RNA片段的分子量差异，在 PAGE电泳中迁移的速率有所不同，染色后 显示出不同的电泳图谱，可将不同的病毒 或相同病毒的不同毒株的基因组加以分析 比较。
（二）核酸酶切图谱分析



染色体DNA、质粒DNA或RNA经反转录而形成的 cDNA，经限制性内切酶切割后产生大小不同的片段，经琼 脂糖电泳后可形成不同的带型，即核酸酶切图谱，又称 DNA指纹图谱。 用相同的限制性内切酶消化的DNA所产生片段的异同程 度，直接反应生物体间的遗传关系。用不同的限制性内切 酶消化DNA可分析基因间的连锁关系。本法可用于比较不 同病原体基因组的差异，了解它们之间的遗传关系。 限制性酶切片段长度多态分析（RFLP）是核酸酶切图谱 分析的延伸，它在一些细菌分子流行病学研究中显示出重 要价值，因为细菌染色体DNA限制性酶切片段长度多态性 是细菌基因特征的重要指标。RFLP与核酸杂交技术联合使 用则结果更容易判断和解释。
（一）核酸探针制备技术
基因探针的获取 二 1. cDNA探针：通过提取纯度较高的相应的 mRNA,反转录成相应的cDNA，再利用它与目 的基因DNA相作用 2. 基因文库法：将染色体DNA通过超声波或者限 制性内切酶不完全水解，从而得到许多片段， 选取长度在15-20kb的片段重组到噬菌体中， 经过体外包装，再转录到大肠杆菌，在固体培 养基上可得到许多噬菌斑，然后用菌斑原位杂 交筛选含有目的的基因作为探针。 3. 寡核苷酸探针：人工合成低于50个核苷酸的任 意序列的寡核苷酸片段作为探针
一
二：基因探针的标记方法
1.放射性探针的标记法 缺口平移标记法：在适当浓度的DNaseⅠ作用下， 在双链DNA上随机造成3’-OH端缺口，而大肠杆 菌DNA聚合酶Ⅰ有修补缺口的能力，其具有 5’→3’外切酶活性，在缺口处按5’→3’方向切除单 核苷酸；同时有5’→3’的聚合酶活性，在缺口处3’ 端加入底物中的单核苷酸，因而可从切口的5’除 去核苷酸并与3’端核苷酸的加入同时进行，以互 补的DNA单链为模板合成新的DNA，这时在反 应液中加入一种或多种标记的核苷酸（P-32,H3）,从而形成高放射性的DNA探针

随机引物启动法：随机引物是人工合成的 长度为6个寡核苷酸残基的寡聚核苷酸片段 的混合物。对于任何一个用作探针的DNA 片段，随机引物混合物中都会有一些六核 苷酸片段可以与之结合，起到DNA合成引 物的作用。将这些引物与变性的DNA单链 结合后，以4种dNTP（其中一种是标记物 标记的dNTP）为底物，合成与探针DNA 互补的且带有标记物的DNA探针。