第3章 分子荧光分析法

相对荧光强度
苯 10
苯酚 18
苯胺 20
苯基氰 20
苯甲醚 20
λ emmax (nm) 278~310 285~365 310~405 280~390 285~345
2）吸电子取代基减弱荧光、加强磷光 —C=0， — COOH ， —NO2
不产生 p →π共轭
O
NO2
硝基苯：不产生荧光、弱磷光
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荧光强度( I f ) 发射的光量子数 f 吸收的光量子数 吸收的光强度 I a ) (
f
k f ki
kf
影响因素：荧光产生过程中， 辐射和无辐射过程； 与每一过程的速率常数有关； kf 分子结构决定（内因）； 主要取决于化学结构和化学环境和结构共同决定。
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（1）跃迁类型：具有电子跃迁类型的结构 荧光 n
待测物 丙三醇 糠 醛 氨基酸 维生素A 蛋白质 肾上腺素 青霉素 试剂 苯胺 蒽酮 氧化酶 无水乙醇 曙红丫 乙二胺 α-甲氧基-６-氯-９-(β-氨 乙基)-氨基氮杂蒽 3-乙酰氧基吲哚 邻苯二醛 苯二胺
直接法：可测定的化合物很少 衍生化法：与荧光试剂形成共价化合物 λ exmax 紫外 465 315 345 紫外 420 420 λemmax 蓝色 505 425 490 540 525 500 测定范围 ppm 0.1~2 1.5~15 0.01~50 0~20 0.06~6 0.001~0.02 0.0625~0.625
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2 影响荧光强度的因素 3）介质酸度的影响 具酸或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，荧光体的存在 型体不同，不同的型体(分子与其离子)在电子构型上有所不 同，而且基态和激发态所表现出来的酸、碱性也有所差别 苯胺：弱的有机碱
在碱性溶液pH7～12中以分子形式存在，蓝色强荧光
在酸性pH<2或>13以离子形式存在，荧光弱。
c1
c2
c3
c4
c5
cx
2. 单点校正法（标准对比法）
As Ax cs
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Ax cx cs As
cs和cx应很接近
cx
3.3.4 荧光分析法的应用 1 无机化合物的荧光分析 衍生化法：与荧光试剂形成荧光配合物
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3.3.4 荧光分析法的应用
2 有机化合物的荧光分析
—Cl， — Br ， —I
S1 →T1的系间窜跃由于重原子的存在增强 含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。
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3.1.4 溶液的荧光强度
1 荧光强度与溶液浓度的关系
I f f Ia
It A log cl I0
I t I 0 10cl I 0 e2.3cl
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光源
激发 单色器
样品池 发射 单色器 检测器
数据处理 仪器控制
检测器 光电倍增管 放大倍数：2n~5n;n=10,103~107， 最大108~109 样品池：液池、荧光池 问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的 样品池有什么区别？ 1.样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收池一样
荧光峰/nm 410 405 398 390
荧光效率 0.064 0.055 0.041 0.002
极性增加，荧光效率增加；粘度增加，荧光效率增加
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2 影响荧光强度的因素 2）温度对荧光强度的影响 随着温度的增高，荧光物质溶液的
荧光量子产率及荧光强度将降低
碰撞几率增大 粘度降低
不同温度下邻菲啰啉的 荧光光谱（在邻二苯中）
单色器
检测器 信号显 示系统
3.1.2 激发光谱和发射光谱 荧光激发光谱与发射光谱的特征 a.Stokes位移
在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为 Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，也由于溶液 中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此，在激发和发 射之间产生了能量损失。
4 3 2 1
S1
IF4800
4400 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200
固定ex=290nm (MAX)
1→1 1→2
1→4 1→1
4 3 2 1
S0
800 400
0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
激发光谱的形状与发射波长也无关
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c. 镜像规则
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称 关系。
基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似； 基态上的零振动能级与第一激发态的各振动能级之间的跃迁和反跃迁几率相等 固定em=620nm(MAX)
1→ 4 1→ 3 1→ 2 1→4
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ex =290nm (MAX)

em= 620nm(MAX)
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200
250
300
350
400
450
蒽的激发光谱和荧光光谱
500 nm
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3.1.3 荧光与分子结构的关系 分子荧光产生的必备条件
分子必须能够吸收激发光
分子必须具有一定的荧光量子产率
问题：基体干扰较为严重
二、间接荧光法（衍生化法和荧光探针法）
与标准品的激发和发射光谱谱图进行对照
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3.3.3 荧光定量分析
定量依据
I f Kc
1. 标准曲线法（校准曲线法）
A
0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 1 2 3 4 5
cmol L-1
b.发射光谱的形状与激发波长无关
分子被激发到高于S1的电子态的更高振动能级，然而由于内转换和 振动弛豫的速率很快，很快损失多余的能量而衰变到S1电子态的最低振 动能级 尽管分子受激到达不同能级的激发态，不管激发波长如何，电子都 是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层，而与 荧光体被激发至哪一个电子态无关。 无论激发波长是λ1还是λ2，荧光的波长都是λ΄2
特点：
1)灵敏度高（1-100 ppb)：有的可达0.01ppb； 2)选择性强； 3)方法简单快速，用样量少; 4)提供比较多的物理参数。
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3.1 荧光分析的基本原理 分子发光：处于基态的分子吸收能量（电、热、化学 和光能 等）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态 返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。 荧光和磷光: 当紫外光照射某些物质时，由于这些物质结构的 特殊性，会发出比吸收波长更长的不同波长的可见光， 当紫外光照射停止时, 随之消失的光叫做荧光，不立 即消失的光叫磷光。
3.2 荧光光谱仪
3.2.1 荧光光谱仪基本结构
光源 单色器 吸收池
与紫外-可见 光谱仪的不同
单色器
检测器 信号显 示系统
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光源 1. 光源的要求： 发射强度足够且稳定的连续光谱 光辐射强度随波长的变化小 有足够长的使用寿命
常用气体放电灯类型： 氙灯光源 高压汞光源 2.氙灯光源
I a I 0 It I 0 (1 e2.3cl )
I f f I 0 (1 e2.3cl )
e 2.3cl (2.3cl) 2 (2.3cl)3 1 2.3cl 2! 3!
e 2.3cl 1 2.3cl
当lc0.05
波长范围：200~1000nm 工作压力：5~20 atm 启动电压：20~40KV 使用寿命：1000~2000h
最广泛应用的连续光源： 发射波长范围宽 发射光强度大 22:17:39
单色器
第一单色器：在光源与 样品池之间，滤去不需 问题：荧光分光光度计与 紫外-可见分光光度计有何 异同点？
要的光，得到所需要的 激发光。 第二单色器：在样品池 与检测器之间，滤去溶 剂、容器表面散射光， 瑞利和拉曼光以及杂质 发出的散射光等，获得 待测物质发射的荧光。
磷光)强度与照射光波长的关系 曲线 （图中曲线I ）
激发光谱形状与吸收光谱形状完全相 似，经校正后二者完全相同！
发射光谱：固定激发光波长(选 最大激发波长), 化合物发射的荧
光源
单色器
吸收池
光(或磷光强度)与发射光波长关 系曲线(图中曲线II或III)。
荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？
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第三章
一、 荧光分析的基本原 理
分子荧光分析法
molecular fluorescence analysis
二、荧光分析仪
三、分子荧光分析法及其 应用
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3.1 荧光分析的基本原理 1575：西班牙植物学家N.Monardes观察到荧光现象 1852：Stokes 研究荧光，提出作为一种分析手段 1867：Goppelsroder首次应用方法 1880：提出荧与化学结构关系的经验法则 1928：Jette和West 第一台光电荧光计 1952：第一台商品化的荧光分光光度计
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S2 S1 T2
T1
S0
3.1 荧光分析的基本原理
3.1.1分子发光的产生
非 辐 射 跃 迁
振动驰豫
内转换 系间跨越
去 活 化
化 学 反 应
外转换
熄灭或猝灭
发 射 光 子
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荧光
激发光去除后，荧光立即消失
激发光去除后，磷光不会立即消失
磷光
3.1.2 激发光谱和发射光谱 激发光谱:固定测量波长(选最大 发射波长),化合物发射的荧光(
二苯甲酮：弱荧光、强磷光 S1 →T1的系间窜跃产率接近1
3）取代基的位置
空间位阻对荧光发射的影响
H3C -O3S N CH3
H3C SO3N CH3
F=0.75
立体异构体对荧光发射的影响
H C H源自文库C
F=0.03
C H
C
H
反式二苯乙烯 强荧光物质
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顺式二苯乙烯 非荧光物质
（5）重原子取代基效应
苯 0.11 205 278
萘 0.29 286 321
蒽 0.46 365 400
丁 省 0.60 390 480
戊 0.52 580 640
省
F
λexmax(nm) λemmax (nm)
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（3）具在刚性平面结构
0.92
1
0.18
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（4）取代基效应
1）给电子取代剂加强荧光 —HN2， — NHR ， —NR2， — OH， — OR ， — CN 产生 p →π共轭 化合物
激发 n 振动弛豫
跃迁是产生荧光的主要跃迁类型 •较大的摩尔吸光系数 •较短的激发态寿命10-7~10-9s •串越至三重态几率小
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（2）具有大的共轭π键结构 共轭度越大，荧光越强。 原因 ：共轭体系越大，离域大π键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易
产生。
化合物
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3 溶液荧光的猝灭 荧光物质分子其它物质分子相互作用引起荧光强度降低的
现象
1） 碰撞猝灭：荧光分子与淬灭剂分子碰撞
2）静态猝灭：荧光分子与淬灭剂分子生成非荧 光配合物 3） 转入三重态猝灭：引入溴、碘、溶解氧 4） 发生电荷转移反应的猝灭：甲基蓝与Fe2+ 5）荧光物质自猝灭
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2. 吸收池的形状：紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光 荧光分光光度计的样品池四面透光
3. 使用注意事项
波长范围
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容易破碎
沾污问题
3.3 分子荧光分析法的应用
3.3.1 荧光分析法分类
一、直接荧光法 芳香族有机化合物分析 衍生化法或荧光探针法 待测物与衍生化试剂发生化学反应 三、荧光分析法特点 1)灵敏度高（1-100 ppb)：有的可达0.01ppb；2)选择性强； 3)方法简单快速，用样量少; 4)提供比较多的物理参数。 3.3.2 荧光定性分析
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3.1 荧光分析的基本原理 3.1.1分子发光的产生 分子能级=电子能级 (Ee)+振动能
级(Ev)+转动能级(Er)。
电子激发的多重度：M=2s+1 Pauli不相容原理：分子中同一轨 道所占据的两个电子必须具有相 反的自旋方向，即自旋配对。 单重态: 如果分子中全部轨道里的 电子都是自旋配对的, s=0, M=1 三重态：电子在跃迁过程中还伴 随着自旋方向的改变，s=1,M=3
I f 2.3 f I 0lc Kc
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2 影响荧光强度的环境因素 1）溶剂对荧光强度的影响 一般溶剂效应 特殊溶剂效应 介电常数、折射率 溶剂与荧光物质间的特殊作用
巯基喹啉在不同溶剂中的荧光峰和荧光效率
溶剂 乙腈 丙酮 氯仿 四氯化碳
相对介电常数 38.8 21.5 5.2 2.24