湖南农业大学
全日制普通本科生毕业论文
湖南·长沙
提交日期：2017年5月
湖南农业大学全日制普通本科生毕业论文
诚信声明
本人郑重声明：所呈交的本科毕业论文是本人在指导老师的指导下，进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体在文中均作了明确的说明并表示了谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。
毕业论文（设计）作者签名：
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目录
摘要 (1)
关键词 (1)
1 前言 (1)
1.1 研究目的和意义 (1)
1.2油菜遗传转化的研究现状 (1)
1.3CRISPR/Cas9技术的研究进展 (2)
1.3.1CRISPR/Cas9技术的简介 (2)
1.3.2CRISPR/Cas9技术的应用 (3)
1.3.3 CRISPR/Cas9技术的优势及缺点 (3)
1.4SSH文库简介 (3)
1.5BnaA09的研究进展 (4)
2材料与方法 (4)
2.1实验材料 (4)
2.1.1转化受体 (4)
2.1.2转化载体 (4)
2.2实验地点 (4)
2.3培养基 (5)
2.4实验仪器及用具 (5)
2.5其他材料 (6)
2.6实验设计 (6)
2.6.1划平板 (6)
2.6.2甘蓝型油菜“湘油15”的播种 (6)
2.6.3摇菌 (6)
2.6.4外植体的制备和侵染 (6)
2.6.5下胚轴与农杆菌共培养 (7)
2.6.6初步诱导筛选 (7)
2.6.7愈伤组织再生 (7)
2.6.8生根培养及炼苗 (7)
2.6.9提取DNA (7)
2.6.10 PCR扩增 (8)
2.6.11 琼脂糖凝胶电泳 (9)
3 实验结果与分析 (9)
3.1油菜遗传转化体系 (9)
3.2抗性苗PCR检测结果 (10)
3.3 油菜遗传转化效率统计 (10)
4 结论与讨论 (11)
参考文献 (11)
致谢 (13)
摘要：为了探索甘蓝型油菜的脂肪酸代谢调控机制，发掘出新的油脂代谢调控因子，本实验室从构建的甘蓝型油菜种子不同发育时期特异性，筛选得到一个功能未知基因，命名为BnaA09。本研究在构建pCAMBIA1300-psg-Cas9-A09沉默质粒的基础上，通过农杆菌介导转化甘蓝型油菜湘油15号，获得转基因植株, 并且对转基因植株BnaA09的表达情况进行检测,本研究对进一步揭示BnaA09基因的功能奠定很好的基础。
关键词：BnaA09基因；沉默质粒构建；农杆菌介导；油菜遗传转化
Abstract: In order to explore the regulatory mechanism of fatty acid metabolism in B.napus and investigate new indicator of lipid metabolism. In this study, we isolated a function unknown gene from the SSH library of the specific expression gene of B.napus seeds at different developmental stages, named BnaA09. Based on the construction of pCAMBIA1300-psg-Cas9-A09silencing plasmid, transgenic plants were obtained by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Brassica napus XY15. The expression level of BnaA09 gene and the content of seed oil in the transgenic plants were both analized. Our research performed a good foundation for further revealing the function of BnaA09 gene.
Key words: BnaA09 gene; Construction of silencing plasmid; Genetic transformation of Brassica napus; Agrobacterium-mediated
1 前言
1.1 研究目的和意义
本研究在构建pCAMBIA 1300-psg-Cas9-A09沉默质粒的基础上，利用农杆菌介导方法，对甘蓝型油菜湘油15号进行遗传转化，获得转基因植株[1]，对BnaA09基因进行沉默之后，推测BnaA09基因在种子油脂代谢途径中的功能，了解BnaA09基因在种子油脂代谢调控中
的作用机理，为将来更深层次的研究种子油脂代谢途径与调控机理奠定基础。
1.2油菜遗传转化的研究现状
我国油料作物种植历史悠久，最早可追溯到秦汉时期[2]，油菜作为重要油料作物，也是我国优势油料作物，在我国的种植面积广阔，其种植面积和产量约占世界30%[3]，但目
前我国多种油料作物产量达到瓶颈，需求主要依赖进口[4]，自给自足困难，既然产量难提
高，那就应该注重食用菜籽油的质量，因此，提高油菜种子的油脂含量和改善菜籽油的品质一直是我国油菜育种的首要任务。
培育优良油菜品种，满足社会各方面生产要求，具有重大意义。迄今为止,通过常规育种技术的运用，油菜作物品种的改良虽取得一定的成效，但同时还存在着育种年限长、工作量大、及亲本材料缺乏等问题,为理想品种的选育增加了很大的困难[5]。近年来，现代分子生物技术迅猛发展，转基因技术更是发展飞快，已有多达十种方法成功运用于植物中。油菜是最早一批从中受益的作物，自1986年人类获得第一例转基因油菜，油菜的转基因研究飞速发展，人们也越来越重视植物转基因工程技术[6]。利用基因技术对油菜进行转化，使得油菜在抗逆性、品质和产量等方面均得到了明显改善。在世界各地，已有多种转基因油菜品种大面积的投入农业生产实践。
转基因技术的迅速发展为油菜遗传改良开辟了新的路径。目前应用较广泛的植物遗传转化方法主要有农杆菌介导转化法、电击法、花粉管通道法、显微注射法、基因枪法、PEG 介导法、离子束介导法、激光微刺穿孔法等方法[7]。其中农杆菌介导法以其成本低、拷贝数低、重复性好、易操作、基因沉默现象少，且转育周期短等优点而深受科研工作者的喜爱，是最受欢迎的转化方法[8]。农杆菌介导法主要以植物的分生组织为受体,导入外源基因，通过真空渗透法或农杆菌浸泡，使农杆菌与受体材料接触完成可遗传细胞的转化，并通过加入抗生素进行转化体的筛选，使转化细胞再生为植株，分子检测鉴定转基因植株后代[9]。但目前油菜转化效率普遍较低，不利于转基因技术在油菜育种上的普遍使用，所以提高转化效率仍旧是油菜遗传转化工作的重点。对于油菜，下胚轴和子叶柄容易再生，所以是转化受体的最佳选择[10]。其中，下胚轴具有更多的优点，像取材容易、分化频率较高、
不受时间限制和易被农杆菌感染等，而成为最理想的再生和遗传转化外植体[11]。
1.3CRISPR/Cas9技术的研究进展
1.3.1CRISPR/Cas9技术的简介
CRISPR /Cas系统是一种适应性免疫防御系统，广泛存在于细菌与古细菌中，用来抵御外来质粒DNA或噬菌体的入侵[12]，大约40%的细菌和90%的古细菌体内存在CRISPR基因座[13]。CRISPR /Cas系统类型多样，根据Cas蛋白组分及氨基酸序列不同，CRISPR/Cas 系统可以分为3种类型，Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型[14]。Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas 系统较为复杂，而Ⅱ型的组成较简单，以Cas9蛋白及导向RNA 为核心组份，即为目前广
