关于植物组培的本科论文

湖南农业大学
全日制普通本科生毕业论文
湖南·长沙
提交日期：2017年5月
湖南农业大学全日制普通本科生毕业论文
诚信声明
本人郑重声明：所呈交的本科毕业论文是本人在指导老师的指导下，进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议。

除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。

对本文的研究做出重要贡献的个人和集体在文中均作了明确的说明并表示了谢意。

本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。

毕业论文（设计）作者签名：
年月日
目录
摘要 (1)
关键词 (1)
1 前言 (1)
1.1 研究目的和意义 (1)
1.2油菜遗传转化的研究现状 (1)
1.3CRISPR/Cas9技术的研究进展 (2)
1.3.1CRISPR/Cas9技术的简介 (2)
1.3.2CRISPR/Cas9技术的应用 (3)
1.3.3 CRISPR/Cas9技术的优势及缺点 (3)
1.4SSH文库简介 (3)
1.5BnaA09的研究进展 (4)
2材料与方法 (4)
2.1实验材料 (4)
2.1.1转化受体 (4)
2.1.2转化载体 (4)
2.2实验地点 (4)
2.3培养基 (5)
2.4实验仪器及用具 (5)
2.5其他材料 (6)
2.6实验设计 (6)
2.6.1划平板 (6)
2.6.2甘蓝型油菜“湘油15”的播种 (6)
2.6.3摇菌 (6)
2.6.4外植体的制备和侵染 (6)
2.6.5下胚轴与农杆菌共培养 (7)
2.6.6初步诱导筛选 (7)
2.6.7愈伤组织再生 (7)
2.6.8生根培养及炼苗 (7)
2.6.9提取DNA (7)
2.6.10 PCR扩增 (8)
2.6.11 琼脂糖凝胶电泳 (9)
3 实验结果与分析 (9)
3.1油菜遗传转化体系 (9)
3.2抗性苗PCR检测结果 (10)
3.3 油菜遗传转化效率统计 (10)
4 结论与讨论 (11)
参考文献 (11)
致谢 (13)
摘要：为了探索甘蓝型油菜的脂肪酸代谢调控机制，发掘出新的油脂代谢调控因子，本实验室从构建的甘蓝型油菜种子不同发育时期特异性，筛选得到一个功能未知基因，命名为BnaA09。

本研究在构建pCAMBIA1300-psg-Cas9-A09沉默质粒的基础上，通过农杆菌介导转化甘蓝型油菜湘油15号，获得转基因植株, 并且对转基因植株BnaA09的表达情况进行检测,本研究对进一步揭示BnaA09基因的功能奠定很好的基础。

关键词：BnaA09基因；沉默质粒构建；农杆菌介导；油菜遗传转化
Abstract: In order to explore the regulatory mechanism of fatty acid metabolism in B.napus and investigate new indicator of lipid metabolism. In this study, we isolated a function unknown gene from the SSH library of the specific expression gene of B.napus seeds at different developmental stages, named BnaA09. Based on the construction of pCAMBIA1300-psg-Cas9-A09silencing plasmid, transgenic plants were obtained by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Brassica napus XY15. The expression level of BnaA09 gene and the content of seed oil in the transgenic plants were both analized. Our research performed a good foundation for further revealing the function of BnaA09 gene.
Key words: BnaA09 gene; Construction of silencing plasmid; Genetic transformation of Brassica napus; Agrobacterium-mediated
1 前言
1.1 研究目的和意义
本研究在构建pCAMBIA 1300-psg-Cas9-A09沉默质粒的基础上，利用农杆菌介导方法，对甘蓝型油菜湘油15号进行遗传转化，获得转基因植株[1]，对BnaA09基因进行沉默之后，推测BnaA09基因在种子油脂代谢途径中的功能，了解BnaA09基因在种子油脂代谢调控中
的作用机理，为将来更深层次的研究种子油脂代谢途径与调控机理奠定基础。

1.2油菜遗传转化的研究现状
我国油料作物种植历史悠久，最早可追溯到秦汉时期[2]，油菜作为重要油料作物，也是我国优势油料作物，在我国的种植面积广阔，其种植面积和产量约占世界30%[3]，但目
前我国多种油料作物产量达到瓶颈，需求主要依赖进口[4]，自给自足困难，既然产量难提
高，那就应该注重食用菜籽油的质量，因此，提高油菜种子的油脂含量和改善菜籽油的品质一直是我国油菜育种的首要任务。

培育优良油菜品种，满足社会各方面生产要求，具有重大意义。

迄今为止,通过常规育种技术的运用，油菜作物品种的改良虽取得一定的成效，但同时还存在着育种年限长、工作量大、及亲本材料缺乏等问题,为理想品种的选育增加了很大的困难[5]。

近年来，现代分子生物技术迅猛发展，转基因技术更是发展飞快，已有多达十种方法成功运用于植物中。

油菜是最早一批从中受益的作物，自1986年人类获得第一例转基因油菜，油菜的转基因研究飞速发展，人们也越来越重视植物转基因工程技术[6]。

利用基因技术对油菜进行转化，使得油菜在抗逆性、品质和产量等方面均得到了明显改善。

在世界各地，已有多种转基因油菜品种大面积的投入农业生产实践。

转基因技术的迅速发展为油菜遗传改良开辟了新的路径。

目前应用较广泛的植物遗传转化方法主要有农杆菌介导转化法、电击法、花粉管通道法、显微注射法、基因枪法、PEG 介导法、离子束介导法、激光微刺穿孔法等方法[7]。

其中农杆菌介导法以其成本低、拷贝数低、重复性好、易操作、基因沉默现象少，且转育周期短等优点而深受科研工作者的喜爱，是最受欢迎的转化方法[8]。

农杆菌介导法主要以植物的分生组织为受体,导入外源基因，通过真空渗透法或农杆菌浸泡，使农杆菌与受体材料接触完成可遗传细胞的转化，并通过加入抗生素进行转化体的筛选，使转化细胞再生为植株，分子检测鉴定转基因植株后代[9]。

但目前油菜转化效率普遍较低，不利于转基因技术在油菜育种上的普遍使用，所以提高转化效率仍旧是油菜遗传转化工作的重点。

对于油菜，下胚轴和子叶柄容易再生，所以是转化受体的最佳选择[10]。

其中，下胚轴具有更多的优点，像取材容易、分化频率较高、
不受时间限制和易被农杆菌感染等，而成为最理想的再生和遗传转化外植体[11]。

1.3CRISPR/Cas9技术的研究进展
1.3.1CRISPR/Cas9技术的简介
CRISPR /Cas系统是一种适应性免疫防御系统，广泛存在于细菌与古细菌中，用来抵御外来质粒DNA或噬菌体的入侵[12]，大约40%的细菌和90%的古细菌体内存在CRISPR基因座[13]。

CRISPR /Cas系统类型多样，根据Cas蛋白组分及氨基酸序列不同，CRISPR/Cas 系统可以分为3种类型，Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型[14]。

Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas 系统较为复杂，而Ⅱ型的组成较简单，以Cas9蛋白及导向RNA 为核心组份，即为目前广
泛应用于基因组定向编辑的CRISPR/Cas9系统。

CRISPR/Cas9系统是目前在基因组编辑范
围内最受欢迎的新方法，该系统通过人工设计特异性向导RNA序列与靶序列进行碱基配对，引导Cas9蛋白结合到靶序列处，对DNA 进行定点切割，然后利用细胞的同源重组
修复机制或非同源性末端连接对断裂的DNA 进行插入、修复、缺失或替换[15]。

1.3.2CRISPR/Cas9技术的应用
CRISPR/Cas9 技术体系首先是在人类与动物细胞系中建立，随后经过人工改造的CRISPR/Cas9 系统快速应用于拟南芥、小麦、水稻、烟草、玉米等不同植物基因组的定向编辑研究中[16]。

除了在动植物基因组方面的研究，CRISPR/Cas9系统介导的基因组定向编辑技术在生物医学和生物工程方面也有广泛的应用[17]。

例如：快速建立基因突变的动物或细胞模型、作为新的作物育种技术、利用基因组编辑功能改造细菌细胞工厂[18]。

此外，CRISPR/Cas9 系统除了用于基因组定向编辑外，还可应用于基因组规模的功能筛选、特
定染色体位点的标记以及内源基因的转录与表观遗传调控等[17]。

1.3.3 CRISPR/Cas9技术的优势及缺点
CRISPR/Cas9系统被称为第三代基因组定向编辑技术，与ZFNs和TALENs系统相比，它有一个很大的优势，即可以实现同时对基因组中多个靶基因进行编辑，从而可以用来修饰编辑同一代谢途径中的不同调控基因或同一基因家族中的不同成员[16]。

相比之下，还有其他优点：更简便的操作性，成本低廉，基因编辑效率更高[19]。

尽管CRISPR/Cas9系统被看做是一种高效的基因编辑技术，但也无法改变和其他基因编辑技术一样有着明显缺陷的事实，脱靶效应。

研究发现，设计的导向RNA 会与非靶点DNA 序列错配，引入非预期的基因突变，即脱靶效应[20]，脱靶效应会引起基因突变，基因重排或者基因删除，重则导致细胞死亡[21]，这个缺点严重制约了CRISPR/Cas9基因编
辑技术的广泛使用。

所以在实际的应用中，脱靶效应必须能够可控。

1.4SSH文库简介
本实验利用抑制消减杂交技术构建了甘蓝型油菜湘油15种子特异表达基因的SSH文库，SSH技术又叫抑制消减杂交技术，是一种简单、快速分离差异基因的方法，该方法的基本原理是将消减杂交技术与抑制PCR相结合，以抑制PCR为基础，利用链内退火优于链间退火，使非目的序列片段两端的长反向重复序列在退火时产生“锅柄样”结构，无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目的序列片段的扩增[22]，消减杂交技术则是根据杂交二级动力学原理，丰度高的单链cDNA退火时产生的同源杂交速度快于丰度低的单链cDNA，保证丰度低的cDNA不会丢失，丰度高的cDNA不会过度分离，从而使丰度上有差别的单
链cDNA相对含量基本一致，使得杂交后基本消除目的基因间的丰度差异,同时也富集了差
异表达基因，这样既利用了消减杂交技术的消减富集，又利用了抑制PCR技术进行高效的动力学富集[23]。

目前，用于分离基因表达差异的方法包括mRNA差异显示PCR、抑制消减杂交技术（SSH）、基因表达系列分析( SAGE)、杂交和基因芯片技术等。

其中SSH技术在动植物及
微生物领域中有广泛的应用[24]。

SSH技术的最大优点是降低了假阳性率，具有高度敏感的特点，能使低丰表达的度cDNA也有可能被检出，还具有背景低、重复性强等优点。

同时SSH也存在许多不足，需要起始材料较多，过多依赖PCR技术，并且SSH技术得到的cDNA是限制酶消化的cDNA，不是全长cDNA。

而且材料间差异不能过大，不能同时对多个材料之间进行比较，材料之间存在过多的差异及小片段缺失也不能有效被检测[25]。

在植物领域内,SSH技术特别适合于研究发育阶段转型前后,个体内不同器官之间,以及受环境影响较大的差异表达基因和克隆。

1.5BnaA09的研究进展
本研究从本实验室前期研究所构建的甘蓝型油菜“湘油15”种子不同发育时期特异性表达基因的SSH文库[26]当中，筛选得到一个功能未知基因，命名为BnaA09。

研究证实，BnaA09在开花后25天至30天的种子中有表达，这个阶段是种子胚发育与油脂积累的关键时期，说明BnaA09很有可能会对甘蓝型油菜种子的油脂代谢有影响。

但是其具体功能还不明确，所以构建沉默质粒对其进行转化再进一步研究该基因表达与否会不会影响油菜的油脂含量。

故实验室构建了pCAMBIA1300-psg-Cas9-A09沉默质粒，希望通过油菜转化获得该质粒的转基因株系，对BnaA09基因进行沉默，为进一步研究BnaA09基因的具体功能奠定基础。

2材料与方法
2.1实验材料
2.1.1转化受体
实验材料甘蓝型油菜品种（品系）湘油15号。

由表观遗传与脂肪酸代谢调控实验室提供。

2.1.2转化载体
以植物双元表达载体pCAMBIA 1300 为基础构建pCAMBIA 1300-psg-Cas9-A09质粒
2.2实验地点
湖南农业大学生命科学楼，油菜种植在组培室中进行，保证油菜光，温，水等生长条
件。

2.3培养基
YEB培养基、M0培养基（种子萌芽）、DM悬菌培养基、M1培养基（共培养）、M2培养基（诱导愈伤组织）、M3培养基（愈伤组织再分化）、M4培养基（诱导生根）
表1 YEB培养基配方
Table 1 Medium components of YEB medium
培养基成分质量
蛋白胨5g
酵母提取物1g
牛肉浸膏5g
MgSO4·7H2O 0.493 g
琼脂粉(固体培养基）15g
表2 遗传转化各阶段培养基配方
Table 2 Components of medium used by different stages of transformation 培养基培养基简称配方pH 种子萌发培养基M0培养基1/2MS +12g/L agar 5.8 悬菌培养液DM 培养基MS+30g/L sucrose+100μm AS 5.8
共培培养基M1培养基MS+30g/Lsucrose+18g/LManitol+2,4-D+Kinetin+100
μm AS +10g/L agar 5.8
筛选培养基M2培养基MS+30g/Lsucrose+18g/LManitol+2,4-D+Kinetin
+10g/Lagar+ Hyg+ Cb+AgNO3 5.8
分化培养基M3培养基MS+10g/LGlucose+0.25g/LXylose+0.6g/LMES +IAA+10g/LAgar+ Hyg+Cb+Zeatin
生根培养基M4培养基MS+10g/Lsucrose +Cb+12g/Lagar
5.8
2.4实验仪器及用具
磁力搅拌器、干燥箱、无菌操作台、组织培养室、生物安全柜、摇床、平板、三角瓶、
酒精灯、烧杯、镊子、刀、玻璃棒、移液枪、EP管、离心机、水浴锅、研磨棒、PCR仪、
高压灭菌锅、电泳仪、分析天平等
2.5其他材料
75%酒精、0.1%升汞、吐温、超纯水、乙酰丁香酮、蛭石、CTAB、氯仿异戊醇、冰乙
醇、琼脂糖、EDTA、TAE、溴化乙锭（EB）等
2.6实验设计
2.6.1划平板
在无菌操作台中，用接种环挑取农杆菌在YEB固体培养基平板划线，胶带密封，放入
冰箱保存。

2.6.2甘蓝型油菜“湘油15”的播种
(1)取适量种子于灭过菌的三角瓶中，加入75%酒精，没过种子即可，摇晃30s，时间不宜超过一分钟，弃液。

(2)加入适量0.1%HgCl2(约20ml)和1-2滴吐温，摇晃起泡后静置20min。

完毕后倒入弃液瓶。

(3)用灭菌纯水将种子清洗4-5次，洗至无泡沫后，加适量灭菌纯水静置60min，弃液。

(4)用无菌镊子将种子平铺于M0培养基表面，每瓶25粒左右，均匀分散。

(5)将铺好种子的三角瓶放入240C暗室培养6d。

不宜超过六天。

（等苗长到1cm时开始
摇菌）
2.6.3摇菌
(1)小摇：取10mlYEB培养基至三角瓶中，再加入10µl卡那霉素（K50）、10µl链霉素（Str）、20µl利福平（Rif，棕色），用牙签挑取单个菌落放入三角瓶中，将三角瓶放入280C摇床培养两天。

(2)大摇：扩大培养，按比例将YEB培养基加至50ml，小摇时加入的三种抗生素依次
按比例扩大加入，摇床培养12h左右。

2.6.4外植体的制备和侵染
(1) 用无菌镊子将暗培养6d的幼苗取出放入灭好菌的大培养皿中，倒入适量DM培养基保湿。

(2) 用无菌镊子和解剖刀切取下胚轴，每个长度为0.8-1cm，这期间注意下胚轴需浸泡在DM培养基中，然后将切好的下胚轴转入三角瓶中。

(3) 在切取下胚轴时，将培养好的菌株4000rpm离心15min，弃上清液。

用少于50ml （30-35ml）的DM培养基重悬，将重悬后的菌在放入280C摇床培养30min-1h。

然后将准备好的菌液倒入装有下胚轴的三角瓶，侵染30min。

(4) 侵染完毕后，将下胚轴转至放有灭菌滤纸的空培养皿中，滤干，在超净工作台吹
5-10min，以除去多余农杆菌。

2.6.5下胚轴与农杆菌共培养
将沥干的下胚轴转到M1培养基中，注意保持外植体与培养基充分接触，胶带密封。

放入240C培养室暗培养40-48h（灵活处理，根据菌的生长情况和外植体的状况而定，如果
在外植体周围看到很明显的白色（菌），立即将外植体转出）。

2.6.6初步诱导筛选
共培48h后，将M1培养基上的外植体转到诱导培养基M2中，置于组织培养室（240C，
长日照光照（16/8h）），培养三周。

2.6.7愈伤组织再生
三周后将外植体转入M3培养基中，每2周继代一次，前面两次继代时不要轻易放弃外植体，如继代到三至四次时还没有分化出愈伤组织的下胚轴就丢弃，出现绿芽的下胚轴就
可以进行下一步的培养，转入生根培养基。

2.6.8生根培养及炼苗
在M3培养基上生长出来的分化芽，切取长出两片叶的芽点，放入M4培养基中，培养
一个月，待长出4-5片叶子，且长出根后即可移入小花钵中练苗生长。

2.6.9提取DNA
(1)取少量抗性苗最新长出的嫩叶组织（＜500mg）放入EP管中，将EP管放入液氮速冻1min，使用研磨棒将幼叶组织快速磨碎。

加入600µl已加热的CTAB[27]缓冲液并用研磨棒研磨使磨碎的组织和缓冲液充分混合。

(2)把EP管插入漂浮板，在65℃水浴锅中水浴15min左右，其中注意颠倒混匀1-2次，使混合液受热均匀。

(3)水浴完成后向EP管中再加入600µl氯仿异戊醇，振荡至混合液发白。

(2)将EP管放入离心机，在16℃下12000rpm离心10min。

(3)取上清液500µl于EP管中，加入800µl-20℃保存的冰乙醇，上下摇匀。

(4)放入-20℃的冰箱内,20min后取出重复步骤(2)。

(5)弃上清液，加入500µl75%的乙醇，振荡摇匀。

(6)将EP管放入离心机，在16℃下12000rpm离心5min。

(7)弃上清液，风干后加入30µl超纯水溶解DNA，轻弹混匀。

2.6.10 PCR扩增
采用PCR[28]法进行DNA扩增，必须有DNA模板、DNA聚合酶、DNA引物、4种NTP混合物和Mg2+。

抗性苗幼叶DNA作为模板，pCAMBIA 1300-psg-Cas9-A09的抗性苗
以35S作正向引物，BnaA09基因的反向引物为检测的反向引物进行PCR。

PCR反应体系及反应参数见表3和表4，反应循环数为28。

表3 PCR的反应体系
Table 3 System of colony PCR
试剂用量
Tag DNA聚合酶7.5μL
上游引物0.5μL
下游引物0.5μL
DNA模板1μL
无菌水5.5μL
总体积15μL
表4 PCR的反应参数
Table 4 Reaction parameters of PCR
反应步骤温度时间
预变性94℃4min
变性94℃40s
褪火58℃40s
延伸72℃30s
终延伸72℃7min
2.6.11 琼脂糖凝胶电泳
(1)在分析天平上称取0.6g琼脂糖，溶解于40mlTAE缓冲液中，放入微波炉中加热至完全溶化，取出摇匀。

(2)再冷却到约60℃，加入1µl溴化乙锭（EB），摇匀。

(3)用胶带封好制胶板两端，插入适当梳子，再将溶解的琼脂糖倒入，室温冷却凝固，大约30min。

(4)把凝固的琼脂糖胶放入电泳槽中，将DNA样品与加样缓冲液按4：1混匀后，用微量
移液枪将混合液加到样品槽中，每孔5µl。

(5)开始电泳，大约1小时结束。

(6)取出凝胶，置于凝胶成像仪上观察、照相。

3 实验结果与分析
3.1油菜遗传转化体系
如下图1为油菜遗传转化过程各主要阶段的状态特征。

首先将种子铺在M0培养基上，即进行种子的萌发培养，期间多观察种子发芽率，待幼苗生长至一定阶段进行摇菌，大约六天过后，开始进行下胚轴的切取及农杆菌侵染，侵染沥干之后放入M1培养基（不加抗生素）进行下胚轴和农杆菌的共培，两天后转入M2培养基，诱导愈伤组织，三周后对下胚轴进行继代培养，转入M3培养基中，进行愈伤组织的再分化，每两周继代一次，直至在M3培养基中生长出分化芽，切取芽点，放入M4培养基中进行生根培养，一个月后，将即有叶子又有根的外植体移入小花钵中炼苗。

图1 甘蓝型油菜遗传转化的不同时期
加图注，可以吧每张图命名如图1a：种子在MS培养基上发芽,图1b：。

Fig 1 Different periods of genetic transformation of B.napus
3.2抗性苗PCR检测结果
本实验“湘油15号”甘蓝型油菜共得到119株抗性苗，取抗性苗的叶片，用CTAB法提取DNA，并进行PCR检测和凝胶电泳，凝胶成像仪上观察、照相。

如图2所示，以pCAMBIA1300-psg-Cas9-A09质粒为阳性对照，湘油15号DNA为阴性对照，2-8号泳道的PCR 产物和阳性对照大小一致，表明这些植株是抗性苗，成功转入了pCAMBIA1300-psg-Cas9-A09
质粒，这些抗性苗中具体有多少是真正的转基因植株还需要进一步观察检测。

图2抗性苗PCR检测结果
Fig 2 PCR detection of resistant seedlings
注：M：DL500 ；1-8：抗性苗；+：阳性对照，—：XY15阴性对照。

Note: M: 100bp plus Ladder DNA ; 2-8 :PCR results of Transformed Brassica Napus DNA ;+: positive control;
—: negative control.
3.3 油菜遗传转化效率统计
本实验得到的外植体、抗性苗和转基因植株的数量如表3，但由于本实验实验数据不够庞大，实验结果存在偶然性。

表5 外植体的转化效率
Table 5 Transformation efficiency of explants
甘蓝型油菜品种外植体总数抗性苗转基因植株转化率（%）湘油15号约2000 119 1 0.05
4 结论与讨论
近年来，油菜转基因研究发展迅速，利用转基因技术已经得到多种品质优良的转基因材料。

农杆菌介导法因其优点较多而成为目前最常用的转化方法，但目前油菜转化效率较低，阻碍了油菜育种上转基因技术的普遍使用。

本实验的油菜转化率低，仅0.05%，除去本人实验操作经验不足以及甘蓝型油菜本身为异源四倍体很难转化之外，还有很多因素的影响，比如抗生素，抗生素的主要作用是抑制农杆菌的过度生长，避免农杆菌的过度生长而影响外植体的生长，抗生素种类的选择与浓度的大小对转化频率均有影响，在油菜的遗传转化过程中,常用的抗生素有羧苄青霉素、头孢霉素等。

本实验所用抗生素为羧苄青霉
素,但研究表明,Cb对下胚轴外植体的芽分化具有很大抑制作用[29],由于本人在试验中外植体上的农杆菌容易抑制不住,会出现农杆菌大量生长的现象,这也导致影响了整个实验的进程。

此外，农杆菌侵染外植体的浓度和时间也是影响遗传转化的重要因素，浓度过高，时间过短，受体材料可能未被充分感染，造成转化率低；浓度太低，时间过长，又会使受体材料侵染过度褐化甚至死亡。

本人实验经验不足，在农杆菌的浓度上把握不好，容易出现差错。

此外，在实验过程中发现，有些抗性植株在成苗初期PCR检测呈阳性，但培养一段时间后，检测呈阴性，出现假阳性的情况，可能的解释有前期农杆菌液处理外植体时浓度过高或者时间过长，导致外植体直至分化成苗还残留含有目标质粒的农杆菌。

为避免出现假阳性的情况，对于检测呈阳性的植株，以后应该多次检测，且尽量选取新生叶片进行PCR检测。

以上的这些情况都会导致油菜转化的效率低下，针对这些问题，科研工作者们也正在摸索解决之道，比如在培养基中加入适当浓度的AgNO3或者植酸（PA），能够有效缓解外植体褐化的现象[30]，避免外植体因为乙烯积累过量死亡；在生根培养基中加入适当吲哚丁酸（IBA）促进分化苗生根，缩短生根培养的时间。

参考文献
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