植物生理学通讯 第43卷 第2期，2007年4月283
拟南芥干旱诱导型启动子RD29A 驱动花生AhNCED1基因双元表达载体的构建
万小荣1，李玲2,*
1
仲恺农业技术学院生命科学学院，广州510225；2华南师范大学生命科学学院，广州510631
提要：从拟南芥基因组中克隆RD29A 基因5'-侧翼520 bp 启动子区域序列，生物信息学分析表明，该启动子片段中存在脱水胁迫响应元件(DRE)、ABA 响应元件(ABRE)、TATA-box 、CAAT-box 等顺式作用元件。构建了干旱诱导型启动子AtRD29Ap 驱动花生AhNCED1基因的植物双元表达载体pAtRD29Ap::AhNCED1。关键词：RD29A 基因启动子；NCED 基因；双元载体构建
Construction of Binary Vector Harboring Peanut AhNCED1 Gene Driven by Drought-inducible Promoter of RD29A Gene from Arabidopsis
WAN Xiao-Rong 1, LI Ling 2,*
1
College of Life Sciences, Zhongkai University of Agriculture and Technology, Guangzhou 510225, China; 2College of Life Science,
South China Normal University, Guangzhou 510631, China
Abstract: In this paper we report the cloning of 5'-flanking promoter sequence of drought-inducible RD29A gene from Arabidopsis and its fusion with peanut AhNCED1 gene. The 520-bp promoter sequence was ana-lyzed bioinformatically in the database of plant cis -acting regulatory element (PlantCARE). The result showed that there were several important cis -acting elements, including TATA-box, CAAT-box, DRE (response to dehydration), ABRE (response to ABA), in the 520-bp promoter region. The binary vector harboring AhNCED1gene driven by AtRD29A promoter was further constructed to be used in coming plant transgene.
Key words: RD29A gene promoter; nine-cis -epoxycarotenoid dioxygenase (NCED) gene; binary vector con-struction
收稿2007-01-08
修定 2007-03-16
资助
广东省自然科学基金(06301202)、仲恺农业技术学院博士启动基金(G 2360225)和广东省自然科学基金(06025049)。
*通讯作者(E-m a il ：lil a b@scn https://www.doczj.com/doc/da2408518.html, ；T e l ：020-********)。
生物化学和遗传学实验的结果证明，9-顺式紫黄质或9-顺式新黄质裂解形成黄质醛是高等植物脱落酸(abscisic acid ，ABA)生物合成的限速步骤，催化该反应的9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(nine-cis -epoxycarotenoid dioxygenase ，NCED)则是调控ABA 生物合成的关键酶(Nambar a 和Marion-Poll 2005；Taylor 等2005)。自从玉米突变体vp14 (Tan 等1997)中克隆ZmVP14基因(即NCED 基因)以来，已相继在番茄、菜豆(Qin 和Zeevaart 1999)、豇豆(Iuchi 等2000)、美国鳄梨、拟南芥(Iuchi 等2001)、葡萄(Soar 等2004)、柑橘(Rodrigo 等2006)、龙胆(Zhu 等2007)中克隆了NCED 基因。干旱胁迫诱导植物叶片中NCED 基因表达与ABA 累积水平相一致(Qin 和Zeevaart 1999；Iuchi 等2000)。烟草中异位表达(ectopic expression)番茄LeNCED1基因可提高转基因植物ABA 水平(Thompson 等2000)，过表达AtNCED3
基因则提高转基因拟南芥的内源ABA 水平和抗旱性(Iuchi 等2001)。我们从花生叶中克隆了ABA 生物合成关键酶基因——AhNCED1基因(GenBank Accession No. AJ574819)，发现其表达受干旱胁迫诱导，在拟南芥中异位表达AhNCED1基因可提高转基因植物的ABA 含量和抗旱性(Wa n 和Li 2005，2006)。早期的研究已查明，不同花生品种的抗旱性与其体内ABA 水平呈正相关，因此综合适时地调控花生体内ABA 水平对提高植株抗旱性有一定意义(Li 和Pan 1996)。
本文报道从拟南芥中克隆干旱诱导基因
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RD29A启动子片段，将此序列在国际植物顺式作用元件数据库中进行生物信息学分析鉴定，并构建RD29A启动子驱动花生AhNCED1基因的植物双元表达载体，为尔后用植物基因工程技术综合适时地调控花生体内ABA水平和为花生品种改良及抗旱育种累积了基础资料。
材料与方法
按W a n和L i(2006)的方法培养拟南芥(Arabidopsis thaliana L. ecotype Columbia，Col-0)。RD29A基因启动子片段克隆时，采用修改的SDS (十二烷基磺酸钠)法提取拟南芥叶片基因组DNA (Wan和Li 2006)。根据Yamaguchi-Shinoza-ki和Shinozaki (1993，1994)报道的拟南芥RD29A 基因序列(GenBank Accession No. D13044)设计一对特异引物(P1：5' GAATTCATTCAATTT-TAATTTTAC GTAT 3'；P2：5' AG ATC T-GTTTGATCCATTTTCCAAAGA 3')，用于从拟南芥基因组中P C R扩增干旱诱导型启动子片段AtRD29Ap，将PCR产物克隆到pMD 18-T载体(TaKaRa)上，通过PCR和酶切检测获得阳性克隆(含pMD 18-AtRD29Ap载体)后，送上海生工生物技术有限公司测序，获得AtRD29Ap的序列。构建AtRD29Ap::AhNCED1融合基因时，以来源于pCAMBIA1301的p35S::ORF为基本植物双元表达载体，p35S::ORF载体含CaMV 35S启动子驱动的花生AhNCED1基因完整编码框(Wan和Li 2006)。以引入的Eco RI和Bgl II两个限制性内切酶酶切
图1 RD29A基因启动子驱动花生AhNCED1基因的双元表达载体的构建
Fig.1 Construction of binary vector harboring peanut AhNCED1 gene fusioned with Arabidopsis RD29A gene promoter
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pMD 18-AtRD29Ap载体，获取RD29A基因启动子片段并克隆到p35S::ORF载体AhNCED1基因上游以替换CaMV 35S启动子，构建成含AtRD29Ap:: A h N C E D1融合基因的植物双元表达载体pAtRD29Ap::AhNCED1 (图1)。
实验结果
1 RD29A基因启动子片段克隆与序列分析
以拟南芥基因组DNA为模板，P1和P2为引物，进行PCR扩增，结果扩增出一约500 bp的DNA片段(图2)。将此片段回收后克隆到pMD 18-T载体上，通过PCR (以P1和P2为引物)和酶切(Eco RI和Bgl II双酶切)检测(图2)，筛选并获取含pMD 18-AtRD29Ap载体的阳性克隆，送上海生工生物技术有限公司测序。测序结果表明PCR产物为一532 bp的DNA序列，BLAST分析(http://www. https://www.doczj.com/doc/da2408518.html,/BLAST/)表明，该序列中520 bp 的启动子片段(含11 bp RD29A基因编码区序列)与Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki (1993)报道的序列完全吻合。将这520 bp序列在国际植物顺式作用元件数据库PlantCARE (Lescot等2002)中进行生物信息学分析，搜寻结果表明(图3)，在该启动子序列-114~-109 (RD29A基因ATG上游)处有一典型的TATA-box (Kurkela和Franck 1990)；-144~ -137处有ABA响应元件(ABA response element，ABRE)，核心序列为TACGTGTC；-252~-225处为一C-repeat/DRE元件，响应低温、脱水胁迫(Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki 1993) ；-305~ -297处有一典型的水分胁迫诱导RD29A基因表达所必需的脱水响应元件(dehydration-responsive el ement，DR E)，核心序列为TACC GACAT (Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki 1994) ；-367~ -363处为一推测的C AAT-box，核心序列为CCAAT (Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki 1993)。
图2 拟南芥RD29A基因启动子片段的克隆
Fig.2 Cloning of RD29A gene promoter
fragment from Arabidopsis
M：D L2000D N A ma r k er；1：以拟南芥基因组D N A 为模板的PCR扩增RD29A基因启动子片段；2：PCR检测pMD 18-AtRD29Ap载体；3：pMD 18-AtRD29Ap质粒(酶切负对照)；4：Eco RI和Bgl II双酶切检测
pMD 18-AtRD29Ap
载体。
图3 PlantCARE数据库中搜寻的拟南芥RD29A基因启动子片段
Fig.3 The 520-bp sequence of Arabidopsis RD29A gene promoter submitted to the database of plant cis-acting regulatory element (PlantCARE)
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由此表明，所克隆的RD29A基因上游5'端序列为
包含各种顺式作用元件的启动子片段(AtRD29Ap)。
2 AtRD29Ap::AhNCED1融合基因构建
用Eco RI和Bgl II双酶切pMD 18-AtRD29Ap
载体，回收酶切得到的AtRD29Ap启动子片段，
连接于同样经Eco RI和Bgl II双酶切的植物双元表
达载体p35S::ORF上，替换p35S::ORF载体上驱
动AhNCED1基因的CaMV 35S启动子，得到含
AtRD29Ap::AhNCED1融合基因的植物双元表达载
体pAtRD29Ap::AhNCED1 (图1)。对pAtRD29Ap::
AhNCED1载体AtRD29Ap与AhNCED1基因结合区
(junction area)测序，结果表明，在AhNCED1基
因起始密码子ATG之前插入了一18b p序列
(A T G G A T C A A A C A G A T C T C，其中
ATGGATCAAAC 11 bp序列为RD29A基因编码区序
列，AGATCTC序列是根据p35S::ORF载体设计
的)，不会改变A h N C E D1基因的读码框；
AhNCED1基因的功能保守区域在3'端，5'端插入
18 bp序列后没影响到AhNCED1基因的功能结构域。
对构建的pAtRD29Ap::AhNCED1载体进行PCR和酶切检测，结果以P1和P2为引物可特异地扩增出532 bp的PCR产物；Eco RI和Bgl II双酶切pAtRD29Ap::AhNCED1载体可切下相应大小的DNA片段(图4)。说明已构建了干旱诱导型启动子AtRD29Ap驱动花生AhNCED1基因的植物双元表达载体。
讨 论
NCED催化9-顺式环氧类胡萝卜素裂解成为黄质醛是高等植物ABA生物合成的关键步骤。AhNCED1是干旱胁迫下花生叶片中调控ABA生物合成的关键基因，在拟南芥中异位表达AhNCED1基因提高了转基因植物的ABA含量和抗旱性(Wan 和Li 2005，2006)。许多研究(刘吉升和李玲2006；万小荣和李玲2006)表明，不同花生品种的抗旱性与其体内ABA水平呈正相关，干旱胁迫下，抗旱性强的花生品种中AhNCED1基因表达水平高于抗旱性相对弱的品种，与ABA累积水平一致。因而综合适时地调控花生体内ABA水平对提高植株抗旱性有作用。
选择适宜的启动子来驱动目的基因在转基因植物中表达已成为植物基因工程研究的热点问题之一。针对不同的目的基因，人们选用不同的启动子，从而使靶基因在特定组织或条件下表达，以利转基因植物的正常生长发育(赵恢武等2000；刘强等2000)。拟南芥RD29A基因的启动子被认为是干旱、高盐和低温诱导型启动子，具DRE及ABRE，在逆境时可驱动靶基因大量表达，从而提高转基因植物的抗逆性，因此，它已成为植物抗逆基因工程中首选的启动子。本文克隆了拟南芥RD29A基因上游5'侧翼520 bp序列，此种启动子片段的生物信息学分析表明，其中包括分别对脱水胁迫、ABA响应的DRE、ABRE等顺式作用元件(图3)。进一步构建了RD29A基因启动子驱动花生Ah NC ED1基因的植物双元表达载体pAtRD29Ap::AhNCED1 (图1和图4)。干旱虽能诱导AhNCED1基因表达，但在抗旱性弱的品种中诱导表达量低，故我们选用拟南芥RD29A基因启动子，构建AtRD29Ap::AhNCED1融合基因，使转基因植物仅在干旱条件下大量表达目的基因，以利转基因植物的正常生长发育。我们将本文构建的pAtRD29Ap::AhNCED1载体转入抗旱性较弱花生品种后的结果表明，干旱胁迫下转基因花生植图4 pAtRD29Ap::AhNCED1载体的PCR和酶切检测
Fig.4 PCR and double digestion check of the binary
vector of pAtRD29Ap::AhNCED1
M：D L2000D N A ma r k er；1：PC R系统负对照；2：PCR检测pAtRD29Ap::AhNCED1载体；3：Eco RI和Bgl II双酶切检测pAtRD29Ap::AhN CED1载体；4：pAtR D29Ap:: AhN C ED1质粒(酶切负对照)
。
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株中内源ABA累积水平明显高于野生型，抗旱性增强；正常生长条件下，两者无显著区别(资料未列出)。这些为采用植物基因工程综合适时地调控花生体内ABA水平、改良花生品种和抗旱育种奠定了基础。
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“基因表达载体的构建”教学设计
专题1 1.2基因工程的基本操作程序之基因表达载体的构建 一、目的基因和运载体的连接 二、利用标记基因筛选含目的基因的受体细胞 三、目的基因和启动子的相对位置关系 附件1： 附件2：
【教学反思】 基因表达载体的构建是基因工程的关键步骤，空间想象难度大，科学理论和技术实践密切联系，思维跨度也大。福州屏东中学学生程度一般，正因如此，处理不好会提高学习难度，令学生视高科技为畏途，导致教学流于形式。本节课用微课和模型成功地化解了难点。 一方面基于学生课前微课的“先学”，学生对表达载体的构建有个整体的认识，然后以此为支架在课堂上填充和拓展内容，当学生在课堂上遇到相关问题时，能尽快到达“最近发展区”，获得进一步的发展，使学生逐渐对细节有更丰富更具体的理解，这种先整体后局部的处理符合学生的认知规律。基于微课的先学后教模式实质上是利用微课为学生创设一个情境，使学生带着思考和疑惑走进课堂，节省课堂的热身时间，从而使高效率大容量的课堂教学目标得以实现。 另一方面高二学生具有抽象思维，但是仍然需要感性知识，形象知识作为支持，所以教师精心设计纸质模型，基于教材原有的学习完“DNA重组的基本工具”后的纸圈模拟活动，再设计了双酶切的活动，化微观为直观，一系列问题的发生都源自学生自己亲手构建的模型，从模型中发现问题，进而逐步由浅入深。学生像科学家一样思考问题、解决问题，获得成功的体验。由于是带着问题的探究模拟活动，使学生的课堂参与是形式之上思维的积极参与。学生获得的体验是：基因工程这么高深的原理原来我也能想得到。学生的纸质模型立体、科学、易操作，但不好展示，而教师利用不同颜色的磁贴，随着课程的逐步推进，简洁明了地逐步在黑板上呈现，让整个环节衔接自然，师生互动流畅。直观的教学手段——模型构建，减轻了学生掌握这些知识的阻力，激发了学习积极性，使学生在轻松愉快的氛围中突破了重难点，强化了学生交流合作意识。 总之，作为教师，应该想学生之所难，积极探索有效途径，一堂成功的课不是展示教师的才智、形象、语言，更要通过学生的成功来反映。
拟南芥基因的图位克隆技术 浙江大学生命科学学院徐冰 浙江杭州310029 1 国内外研究现状 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国ZF的重视。 从遗传学的观点来看，基因克隆的途径可概括为正向遗传学和反向遗传学两种。正向遗传学途径指的是通过被克隆基因的产物或表现型突变去进行；反向遗传学途径则指的是依据被克隆基因在染色体上的位置来实现。虽然一些模式生物（如拟南芥）的基因组测序已经完成，但还有40%的基因（在拟南芥中）的功能还是未知的。 图1 图位克隆所需努力的比较（1995年和2002年）（Jander等，2002） 图位克隆（map-based cloning）又称定位克隆（positional cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出（Coulson等，1986），用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。 目前完成整个拟南芥的图位克隆过程大约需要一年时间。在这个过程中，我们从筛选突变体开始，逐渐找到和表型相关的基因。这和反向遗传学的方法正好相反。图位克隆能实现，关键在于全基因组测序计划的完成和各种分子标记的发现。这些数据被储存在专门的数据库中
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法） 一、基因克隆 ★事前三问 a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？ b.这个基因在哪种材料中扩增？ c.材料需要怎么处理？ ◎实验前准备工作 a.设计引物，准备材料， b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试 剂盒 c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准 备 ※基本流程 提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序 1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成 1.1叶片、根总RNA的提取 Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。 1）实验前准备 预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。 2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下： （1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，
移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。 （2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。 （3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。（4）在≤12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。 （5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。 （6）在≤12000g，4℃离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。 （7）用≥1 ml的75%乙醇洗RNA，涡旋振荡样品，在≤7500g，4℃离心5 min，弃上清。（8）室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加无RNase的水100μl用枪头吸几次，55～60℃温育10 min使RNA溶解。 （9）配制以下体系： 10×DNase buffer 5 μl DNase I （RNase-free）（40 μg/μl） 1 μl RNasin Inhibitor（40 μg/μl） 1 μl Total RNA 70 μg 加去RNase水至总体积为50 μl （10）37 ℃水浴1h，加DEPC处理的水至总体积为100 μl，加入等体积氯仿抽提一次。（11）取上清，加入10 μl的3 mol/L NaAC溶液，200 μl的无水乙醇，-80 ℃沉淀30 min。 （12）2～8 ℃，12000g离心10 min，弃清液，干燥后取50μl无RNase的水溶解RNA。3）RNA的质量及纯度检测 （1）电泳检测取2ul RNA 与1 ul 10×Loading buffer上样缓冲液混合均匀在1% 的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察RNA 条带并记录实验结果。 （2）分光光度计RNA纯度检测 取1ul RNA液，以DEPC水为空白对照，测定A260/ A280 比值，估测RNA质 量。 4）cDNA第一条链的合成 按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA： 1）在Eppendorf管中配制下列混合液：
基因图位克隆的策略与途 径拟南芥 Ting Bao was revised on January 6, 20021
拟南芥基因克隆的策略与途径 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植 物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是 十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物 学及各国政府的重视。 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的 功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆 的几种常用方法介绍如下。 1、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms.图位（map-based clonig）又称克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或将基因伫到染色体的1 个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和生化。 用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。
模式植物拟南芥遗传应用综述 摘要：拟南芥作为一种比较经典的“模式植物”，在研究相关的其他生物的生命活动规律中，因其结构简单，相似性高，而表现出其他生物无法比拟的优越性，成为了科学家们最理想的研究对象。本文分别从问题的提出、历史的发展、现状的分析和前景的预测四个方面对拟南芥在科学界的地位及作用进行了综合性的总结和叙述。 关键词：拟南芥；模式植物；遗传；应用 一、前言 纵观过去和现在，科学界对拟南芥的重视程度以及拟南芥在生物遗传学的地位有着巨大的差异。尤其是近几年来，科学界对拟南芥的热衷程度日渐加深，完全不同于90年代以前的冷淡。而且现在的科学家们对于拟南芥的研究方向是各种各样的，越来越广泛。本文就是对拟南芥在不同研究课题下所起的作用、在遗传应用上所表现的优越性进行一个总结性的综述，探讨产生此种现象的原因，从而得出此种作物在生物学上的大致研究方向，并作出相应的前景预测，让我们对它的研究潜力进行进一步的挖掘，让它的贡献更大化。此外，也希望通过本文，让大家对拟南芥在过去和现在的发展有一个更加清楚的了解，把握住大致的脉络，并对今后的研究提供相应的指导和帮助。 二、历史的发展： 虽然孟德尔以豌豆为实验材料开创了现代遗传学, 后来麦克林托克又研究了玉米, 发现了惊人的“跳跃基因”, 但总的来说, 这些植物都不是研究分子遗传学的良好材料。高等植物通常需要较大的种植面积, 特殊的条件, 而且繁殖周期长。更糟的是, 植物的基因组通常都很大（例如, 玉米的基因组比果蝇的大两个数量级）, 使人们难以分离到特定的基因[1]。因此, 虽然K’Roberts早就认为植物是研究发育的良好系统,但迄今为止, 在研究植物的细胞分化和形态发生等方面一直进展迟缓。长期以来, 分子生物学家们一直希望能在植物中找到象动物中的黑腹果蝇(Drosophila me-lanogaster)那样繁殖快, 易于在实验室中培养,并能用分子生物学和遗传学技术进行广泛研究的实验材料,以便从根本上改变植物遗传学研究的长期落后状况。1985年4月13-19日在美国科罗拉多州召开的植物遗传学UCLA上, 科学家们宣布, 他们终于确定了植物王国中的“果蝇”—拟南芥，而这也奠定了拟南芥在将来时期的地位。 2.1拟南芥的研究进度以及介绍 拟南芥(Arabidopsis thaliana) 是一种极普通的草本植物，常用俗名鼠耳芥，是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的“模式”植物。近年来，植物科学中许多有价值的发现几乎都是以拟南芥为实验材料取得的，因此它被誉为植物界的“果蝇”。拟南芥具有以下主要特点:(1)形态个体小，高度只有30 cm左右;(2)生长周期快，从播种到收获种子一般只需6周左右;(3)种子多，每株每代可产生数千粒种子;(4)形态特征简单;(5)基因组小，只有5对染色体。早在1907年，Strasburger就利用拟南芥研究了染色体的连续性。他的学生Laibach于同年发现拟南芥间期核中的异染色质体的数目与其中期染色体数相同，这种现象在植物界中是比较少见的。拟南芥的染色体数目为2n=10，其
拟南芥基因克隆的策略与途径 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序 已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物 的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字 花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各 国政府的重视。 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功 能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的 几种常用方法介绍如下。 1、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms. 图位克隆（map-based clonig）又称定位克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因伫到染色体的1个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和生化机制。 用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。
拟南芥基因组测序工作圆满完成 在“人类基因组计划”(HGP)进行得如火如荼的同时，在植物科学领域也进行着－场类似的革命，并且取得了大的成功。2000年12月4日出版的《自然》杂志(Nature)报道了拟南芥完整基因组测序工作完成并首次发表了其完整基因组序列。这成为植物科学史上的一个重要里程碑。已经绘制出拟南芥的基本基因图谱，其中包含11600万个碱基对，编码大约26000个基因。通过向这张基本网谱上添加细节，人们可以对其基因结构进行更为详尽的研究，同时也可以增加对于其他遗传上更为复杂的植物的认识和理解，其中包括许多重要的农作物。这项工作的重要性在某种意义上甚至要超过人类基因组计划，因为即使是生活极其贫困的人们也将从中受益。目前的实验工作仅涉及整个基因组中不到10％的基因，仍有大量新的基因有待继续研究。通过这些工作，人类能够更详尽的了解植物独特的代谢过程，它们与环境的相互作用以及它们的抗病和抗虫能力。另外，拟南芥基因与众多其他有机体的基因密切相关，在不同植物之间，植物与动物之间，许多生理生化过程是十分保守的。通过基因及基因功能比较，使跨种甚至跨界的揭示生命活动的基本规律成为可能。这种保守性为我们提供了将不同有机体的研究联系到一起的基础，从而大大拓展了我们的生物学视野。对拟南芥基因组的分析有助于理解DNA的复制和染色体的分离过程，并为基因工程设计提供新的途径，同时也揭示了生物基因组进化的重要机制。拟南芥基因序列研究工作不仅对于基础科学研究具有重要的贡献，而且有着突出的实际利用价值。拟南芥基因组中的基因通常也存在于其他作物中，而且相同基因在不同作物中也表达出相似的功能。人们可以从拟南芥基因组中选调控制优良性状的基因，利用基因修饰技术(GM)将其转入作物中，当然，也可以利用拟南芥基图谱来确定其它植物的有价值基因，调出后通过标记辅助育种技术转入作物。基于拟南芥基因组和其他植物基因组的同源性，通过对拟南芥基因组的深入研究和分析，有助于人们对整个植物界的认识，改善农作物的品质，提高农作物的抗逆性以及降低农业生产对环境的影响。(赵镝徐春晖)
一、拟南芥的一般生物学特性 1. 形态学描述 拟南芥（Arabidopsis thaliana）为十字花科拟南芥属。一年生细弱草本植物（图21-1 A）。 株高15至30厘米，随生长环境或培养条件变化。基生叶多数，长圆形或椭圆形，呈莲座状排列。茎生叶具短柄或无柄。总状花序顶生，花瓣白色；雄蕊6枚，花药黄色；雌蕊圆柱状。长角果线形，长约10至16毫米，成熟时开裂。种子呈卵形，长约1毫米，成熟时红褐色。有关拟南芥的各种形态特征、形态发生及个体发育的过程等在许多文献中已有很详尽的描述，为研究人员利用拟南芥为实验材料提供了很好的基础和方便。 2. 个体小、易于栽培管理 与其它大多数高等植物相比，拟南芥的个体较小。成熟个体株高在15至30厘米之间。 由于个体小，很容易在面积有限的温室或人工气候室内大批量地种植。特别是对于一些有特殊要求的研究工作，甚至可以在培养器皿中完成生活史（如有时需要在无菌条件下进行培养等）。而且，拟南芥对生长条件的要求并不十分严格，这一特点使得在实验工作中很容易实现拟南芥的栽培管理。 3. 生长周期较短 在一般的温室或人工气候室条件下，从拟南芥种子的春化至第一批角果成熟大约需8周左右时间。当然，也可以通过改变生长条件以达到使拟南芥提前或推后开花结实的目的。如延长每天的光照时间，可使拟南芥明显地提前开花结实，利用每天接近24小时的光照条件培养，甚至在6周左右即可收获第一批成熟角果。拟南芥的这一特性使实验工作周期大大缩短，特别是对于许多遗传分析工作，比利用一般的高等植物材料（如麦类、豆类作物）可以成倍地节约时间。 二、拟南芥的普通遗传学特性 1. 既可自交、又可人工杂交 在自然条件下，拟南芥是典型的自交繁殖植物，这使得拟南芥在种植繁种过程中得以保持其遗传上的稳定性。同时在实验过程中，根据研究目的又可方便地实施人工杂交，使得遗传分析工作很容易完成。 2. 种子结实量大 虽然拟南芥植物个体较小，但其种子结实量非常之大。一个角果可结实数十至上百粒种子；在生长良好的情况下，单株结实量可达上万粒之多！这使得很容易进行后代的遗传分析工作，也很容易扩增所需突变体的种子库。 3. 容易被诱变产生所需突变体 拟南芥在正常条件下通过自交产生后代，在遗传上表现出较高的稳定性。但拟南芥在特殊条件处理后较易发生突变，如利用物理的（如辐射处理）、化学的（如EMS处理）、及遗传转化（如T-DNA插入）等方法进行人工诱变处理，可获得具有各种不同表型性状的突变体。利用这些人工诱变方法产生的突变是随机的，可进一步通过对突变体库的有目的筛选而获得所需的突变体。 4. 染色体结构 通过对细胞周期的中期（metaphase）染色体观察，可以清晰地辨认单倍体拟南芥有5条染色单体（2倍体为10条染色体）。对拟南芥遗传图谱的连锁关系分析，也证实了单倍体拟南芥包含5个遗传连锁群。除去着丝粒、端粒等区域及一些重复序列，目前已经完成测序的第一条至第五条染色体的DNA序列长度依次为29.1 Mb、19.6 Mb、23.2 Mb、 17.5 Mb、26.0 Mb（总长为115.4 Mb），而包括所有序列在内的拟南芥单倍体基因组总 长约为125 Mb（注：此数据为2000年12月14日《自然》杂志公布的数据，随着拟南
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。 表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。 （RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字，命名为Shine-Dalgarno序列，简称S-D序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3’端一部分序列互补，因此S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境，避免ribosome出现leaky scan） 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。 1.载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 2. 载体的分类 按功能分成：（1）克隆载体: 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体:具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。 按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）. 克隆载体顾名思义就是质粒拷贝数比较高,在做上游克隆时比较方便, 其重点在于质粒的复制.
表达载体的构建方法及步骤 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 （4）P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。 如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活
如何构建载体 1 启动子的选用和改造 外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。 目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达，由于该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导，通过喷酒廉价、无公害的化学物质，诱导抗虫基因在虫害重发生季节表达，显然是一个十分有效的途径。 在植物转基因研究中，使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果，尤其是在进行特异表达和诱导表达时，表达水平大多不够理想。对现有启动子进行改造，构建复合式启动子将是十分重要的途径。例如，Ni等人将章鱼碱合成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子构成了复合启动子，GUS表达结果表示：改造后的启动子活性比35S启动子明显提高。吴瑞等人将操作诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合，新型启动子的表达活性提高了近10倍（专利）。在植物基因工程研究中，这些人工组建的启动子发挥了重要作用。 2 增强翻译效率 为了增强外源基因的翻译效率，构建载体时一般要对基因进行修饰，主要考虑三方面内容： 2.1添加5｀-3｀-非翻译序列 许多实验已经发现，真核基因的5｀-3｀-非翻译序列（UTR）对基因的正常表达是非常必要的，该区段的缺失常会导致mRNA的稳定性和翻译水平显著下降。例如，在烟草花叶病毒（TMV）的126kDa 蛋白基因翻译起始位点上游，有一个由68bp核苷酸组成的Ω元件，这一元件为核糖体提供了新的结合位点，能使Gus基因的翻译活性提高数十倍。目前已有许多载体中外源基因的5｀-端添加了Ω翻译增强序列。Ingelbrecht等曾对多种基因的 3｀-端序列进行过研究，发现章鱼碱合成酶基因的3｀-端序列能使NPTII基因的瞬间表达提高20倍以上。另外，不同基因的3｀-端序列增进基因表达的效率有所不同，例如，rbcS3｀-端序列对基因表达的促进作用比查尔酮合酶基因的3｀-端序列高60倍。 2.2 优化起始密码周边序列 虽然起始密码子在生物界是通用的，然而，从不同生物来源的基因各有其特殊的起始密码周边序列。例如，植物起始密码子周边序列的典型特征是AACCAUGC,动物起始密码子周边序列为CACCAUG，原核生物的则与二者差别较大。Kozak详细研究过起始密码子ATG周边碱基定点突变后对转录和翻译所造成的影响，并总结出在真核生物中，起始密码子周边序列为ACCATGG时转录和翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。该序列被后人称为Kozak序列，并被应用于表达载体的构建中。例如，有一个细菌的几丁质酶基因，原来的起始密码周边序列为UUUAUGG，当被修饰为ACCAUGG，其在烟草中的表达水平提高了8倍。因此，利用非植物来源的基因构建表达载体时，应根据植物起始密码子周边序列的特征加以修饰改造。 2.3对基因编码区加以改造
基因克隆的质粒载体 在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。 ①F质粒又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。 ②R质粒通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。 ③Col质粒即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。 第一节质粒的一般生物学特性一．质粒DNA 细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子（图4-1）。 质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型： 1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型； 2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型； 3．若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子（IDNA），通称L构型（见图4-2）。 在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA（图4-3）。 凡经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必定包括如下三种共同的组成部分，即复制基因（replicator）、选择性记和克隆位点。 二．质粒DNA编码的表型 质粒DNA仅占细胞染色体组的1%～3%左右，但却编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。其中对抗菌素的抗性最质粒的最重要的编码特性之一。
模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 摘要当农杆菌侵染植物细胞时，土壤农杆菌的天然质粒—Ti质粒上T-DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入染色体DNA中。拟南芥的T-DNA插入变异是反向遗传学进行植物生物学研究的重要手段之一，在获得的Ti质粒转化植物细胞后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型，在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。本实验以拟南芥植株的特定基因突变体作为实验材料，提取DNA，并通过PCR扩增及SDS-PAGE电泳分离检测鉴定，检测该拟南芥是否为转基因的拟南芥，并判断其是纯合突变还是杂合突变。本次实验目的在于了解拟南芥T-DNA插入突变体鉴定的原理，掌握DNA提取技术、PCR技术以及电泳鉴定技术，对拟南芥的基因型做出判断。 关键词T-DNA插入突变体拟南芥 PCR 琼脂糖凝胶电泳 1.引言 1.1遗传研究途径 （1）正向遗传学研究 杂交或诱变→表型观察→遗传规律→确定存在的基因及数目→基因的功能及作用性质。 （2）反向遗传学研究 在已知DNA序列的基础上，通过DNA重组、定点突变、插入/缺失等遗传修饰手段创造突变体并研究突变所造成的表型效应，从而研究基因的生物学功能，阐明生命的本质现象与规律。拟南芥的T-DNA插入变异是反向遗传学进行植物生物学研究的重要手段之一。 1.2模式生物——拟南芥 拟南芥广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，其原因主要基于该植物具有以下特点： ①植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵； ②生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需6周左右； ③种子多，每株每代可产生数千粒种子； ④形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养； ⑤基因组小，只有5对染色体； ⑥拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种 代谢功能的缺陷型。 拟南芥全部基因组测序已经完成，每个单倍染色 体组（n=5）的总长只有7000万个碱基对（只有小麦 染色体组长的1/80），预测共有29,454个基因。这样 科学家就可以准确定位插入DNA的位置。 1.3 Ti质粒和T-DNA插入突变技术 Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一 段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA 区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。所以Ti质粒上的这一段能转移的
拟南芥（Arabidopsis thaliana），是一种广泛分布于亚洲、欧洲以及北非地区的小型开花植物。从分类地位上讲，它属于十字花科(Brassicaceae) 鼠耳芥属(Arabidopsis)。作为近年来最为广泛应用的模式植物，拟南芥在分子遗传学、植物学以及农业科学的研究中发挥了重要的作用，被称为植物中的果蝇，是目前公认的五大模式生物之一。拟南芥基因组测序已于2000年由国际合作完成，也是第一种完成全基因组测序和分析的植物。 拟南芥是二年生草本植物，高7～40厘米。基生叶有柄呈莲座状，叶片倒卵形或匙形；茎生叶较小，无柄，披针形或线形。叶片表面覆盖有单细胞表皮毛。总状花序顶生，花朵直径约3mm，花瓣4片，白色，匙形。长角果线形，长0.5～2厘米，每个含20～30粒种子。根分为主根和侧根，可容土壤细菌共生。春型拟南芥萌发后3周左右就可开花，能在6周内完成一个世代。严格自花传粉（图1）。 拟南芥生活史与一般的开花植物无异：减速分裂形成的大小孢子分别形成雌雄配子体，即胚囊和花粉。胚囊经过双受精的过程，受精卵与受精极核分别发育成胚和胚乳。 2拟南芥研究的主要策略 在拟南芥研究中，使用最多的是遗传学研究策略，包括正向遗传学和反向遗传学。正向遗传学遵循的是从突变体表型分析到基因功能认识的思维方式，它首先关注的是具有某种缺陷的突变体。譬如，如果要研究与植物抗旱机理有关的基因调控过程，可以先用化学、物理或者生物的方法将野生型拟南芥诱变，然后在干旱胁迫的条件下进行突变体的筛选。如果在诱变群体后代中出现了对干旱条件反应不同于野生型的个体(例如比野生型更加抗旱或者不抗旱的植物)，这种个体就是突变体。这种植物对干旱的不同反应可能就是因为突变体中某一个基因遭破坏后所造成，而这个基因必定与植物的抗旱机制有关。 在得到了这样的一个突变体之后，可以对其中的突变基因进行定位和克隆。在获得了基因序列后，可以更深入地了解这个基因的功能，并分析它是以何种形式影响了植物的抗旱途径以及与抗旱途径中其他相关基因的关系。 对正向遗传学来说，突变表型是所有研究工作的起点。如果一个基因突变之后没有显著的表型改变，那它的突变体也就很难在筛选过程中被发现。因此，正向遗传学不适用于研究这类基因。事实上，拟南芥中有许多基因都存在功能上的冗余性，即某些基因在功能上可以部分互相替代，其中一个基因的突变往往不会产生十分明显的表型变化。这些基因在蛋白质序列上也往往会存在着很高的同源性，通常把它们称为一个基因家族。据估计，拟南芥有65% 的基因可以归并到某个家族中[9]，这意味着相当一部分基因可能无法通过正向遗传学来揭示它们的主要功能，需要反向遗传学的介入。 反向遗传学是在已知某个特定基因序列的前提下去探索这个基因的功能。例如，可以利用已知的基因序列构建该基因的反义RNA或者双链RNA结构，用这样的构建去转化野生型植物。这种构建在植物中有可能干扰其内源基因的表达，甚至干扰该基因所在的家族基因的表达。根据一些基因受到干扰后出现的表型，可以推测这个基因或者与其同源的基因的功能。此外，反向遗传学研究还可以用在不同时空表达的启动子来驱动已知序列基因的表达，研究该基因过量表达或者时空异位表达时的植物表型，推测该研究基因的功能。 3拟南芥研究的一些重要发现 鉴于拟南芥在遗传操作上所具有的优势，它广泛应用于植物整个生命活动各个过程的研究，取得了一系列重要发现。在植物形态建成研究中，经典的例子是花发育的ABC 模型[10~12](图1)。在结构上，拟南芥的花与大多数开花植物相似，由四轮基本的花器官组成：从外向里分别为花萼、花瓣、雄蕊及雌蕊。ABC 模型中的A、B、C 分别指的是控制不同花器官发育的三大类基因，其中A类基因决定了花萼的特征；A类+B类基因共同作用决定了花瓣特征；B 类+C 类基因共同作用决定了雄蕊特征； C 类基因单