利用高效CaCl2转化法实现质粒的共转化

利用高效 K3K%- 转化法实现质粒的共转化
李刚! ， 程度! ， 李宝健! ， 唐清泉- ， 陆阳（! " 中山大学基因工程教育部重点实验室， 广东 广州 #!)-(#； - " Y,WN3U+>$ H+RW=6B,R%R>J KRNIRN3W+R,， ;R6FV+%%=， 1? -).#-， Z[5） 摘要： 为了提高共转化的效率， 对 《分子克隆》 中感受态制备和 K3K%- 转化法加以改良， 发展了 K3K%- 和 1>K%- 介导的高效的感 ， 完全可以满足各种转化实验 （包括共转化） 的要求。使用该法， 我 受态制备和转化方法， 转化效率高达 !). 7 !)9 转化子 \! > ?25 们成功地将一个受体质粒和供体质粒共转化入 %&! 菌株中， 酶切结果证明供体质粒上的 ’()* 7 （ 基因 ! 人胰岛素样生长因子 7 !） 已经通过 %&! 酶介导的位点特异性重组连接到受体质粒的特定位点上。 关键词： 高效； 感受态制备； 共转化 K3K%- 转化法；
团小心缓慢地转移到 ! " #$% 的 &’ 管中， 用一次 ()* 乙醇和两 次无水乙醇浸泡沉淀各 ) " #$+,， 小心倒掉液体后， 让沉淀自然 干燥。 （视量多少而定） 。溶 ! " # " - " . 将沉淀溶解于 (#) % 或更多 /& ! ， 混匀后即可保存于 冰柜。 解后， 加入 (# % 01 23456 7 -)8 ! 氯仿 ! " # " - " 9 将上述溶液用等体积的酚 7 氯仿抽提 - : 0 次， 抽提一次， 用室温的异丙醇沉淀后， 自然干燥， 再溶于 /&， 经 于 7 -)8 冰柜长期保存。 ;253<= 消化后， 机械打断 ?25 的程度。 毒性很强和具有一定挥发性的有机 0 " - 氯化苄是刺激性大、 物， 在操作过程中可对操作者的呼吸道、 眼睛造成强烈的刺 激， 甚至损害。因此在使用氯化苄时， 应戴好手套和口罩， 最 好的通风橱里进行操作， 尽量缩短氯化苄暴露在空气中的时 间， 做好自我保护。 操作 0 " 0 中性裂解法提取黑曲霉细胞基因组 ?25 步骤较少， 简单， 但用酚、 氯仿等直接抽提裂解液， 药品浪费大， 得率不 高， 且蛋白质没有有效去除， 需经多次抽提后才适合于分子生 物学研究。 在异丙醇 0 " C 对于二次沉淀法提取黑曲霉细胞基因组 ?25， 与提取液混合后就获得了大量丝状沉淀， 提示 ?25 产量可能 较高， 但离心后沉淀在 /& 中溶解不全， 溶解部分再经二次沉 淀后， 得率较低。通过摸索和比较， 本实验作了如下改进： 5" 用异丙醇进行第一次沉淀后， 不用离心， 而采取静置 #$+, 的方 以利于 ?25 在 /& 中 法集中沉淀， ?25 沉淀之间呈松散状态， 的溶解； H" 第一次沉淀的 ?25 再经一次 ()* 乙醇和两次无水 乙醇浸泡处理， 以除去更多的杂质， 并使 ?25 一定程度脱水， 以缩短干燥时间。经改进后的二次沉淀法提取黑曲霉细胞基 因组 ?25， 虽然步骤较多， 时间稍长， 但操作简单， 经过两次沉 淀、 酚 7 氯仿抽提、 获得的 /& 溶解及其引起的 ?25 损失后， （ 5-@) A5-.) D ! " 9 ） ， 而且产量较高 ?25 不 仅 蛋 白 质 含 量 低 ， 是提取用于分子生物学研究黑曲霉细胞基 （!0) >A> 菌丝体） ! 因组 ?25 的理想方法。采用本方法获取的黑曲霉 2-# 的基因 已经成功地用于植酸酶 IBJ5 全基因和表达片段的 组 ?25， ［ ］ 本实验室也已使用此法成功地提取了其 ’K; 扩增 C 。此外， 并有效地用于分子遗传分析及基 他多种真菌的基因组 ?25， 因克隆等研究。 综上所述， 上述三种提取黑曲霉细胞基因组 ?25 的方法 提取的 ?25 质量最好， 产量 中， 改良二次沉淀法耗时 # 7 @B， 其次为中性裂解法， 耗时 ! 7 -B， 产量约 高达 !0) >A> 菌丝体； ! 再次为氯化苄法， 耗时 0 7 CB， 蛋白质含量高， !0 >A> 菌丝体； ! 菌丝体。 产量约 0 >A> !
中性裂解法 二次沉淀法
由表 ! 可知， 三种黑曲霉细胞基因组 ?25 提取方法中， 以 二次沉淀法用时最长， 但 ?25 产量最高， !> 菌丝体可获得多 达 !0) 而且蛋白质去除较完全， > 的基因组 ?25， 5-@) A5-.) D ! " ! 9。中性裂解法用时最短， ?25 纯度不高， 5-@) A5-.) E ! " (#， ?25 产量为 !0 菌丝体。氯化苄法用时较长， 纯度最低， 蛋 >A> ?25 ! 白质含量较高， 5-@) A5-.) E ! " #)， ?25 产量为 0 >A> 菌丝体。上 ! 述三种方法提取的 ?25， 经相同倍数稀释后， 各取 % 电泳检 ! （见图 !） ， 以二次沉淀法 测， 均可观察到 -0FG 左右的 ?25 片段 的泳道最亮， 其次为中性裂解法的泳道， 氯化苄法的泳道最 弱。
ห้องสมุดไป่ตู้
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讨论和结论
其菌丝体的细胞壁富含多糖。要 0 " ! 黑曲霉属于丝状真菌， 获取细胞内的 ?25， 首要的问题就是要破坏细胞壁， 使细胞内 并 有 效 溶 解 于 提 取 缓 冲 液 中。朱 衡 的 ?25 充分释放出来， ［!］ 等 发现， 在碱性条件下， 氯化苄可与细胞壁多糖上的羟基作 用生成醚， 从而破坏真菌细胞壁糖链， 胞内 ?25 因细胞壁破裂 而得以释放。本试验结果表明， 氯化苄法提取的黑曲霉细胞 （ 5-@) A5-.) E ! " #)） 、 产量较少 （0 基因组 ?25 蛋白质含量高 >A> ! 菌丝体） ， 说明氯化苄对黑曲霉细胞壁的破坏作用有限， 并不 能充分释放胞内的 ?25， 或者是释放的 ?25 未能有效溶于提 取缓冲液中而损失到沉淀中。用液氮冷冻过的菌丝体进行研 磨， 可以充分破坏细胞壁， 而且不会引入杂质， ?25 可以充分 和有效溶解在提取缓冲液中。但在液氮研磨时， 特别是在同 时使用石英沙时， 容易将 ?25 打断。如果将菌丝体真空抽干 为蓬松的状态， 不使用石英沙， 并注意研磨的手法， 可以减轻
参考文献： 朱衡， 瞿峰， 朱立煌 " 利用氯化苄提取适于分子生物学分析的真菌 ［!］ ［ L］ （!） ： ?25 " 真菌学报， !99C， !0 0C 7 C)M ［-］ 姚斌， 张春义， 王建华， 等 " 产植酸酶的黑曲霉菌株筛选及其植酸酶 基因克隆 ［ L］ （ ： " 农业生物技术学报， !99.， @ !） ! 7 @M ［0］ &BN%+6B O K， P=%%J Q ;， KR,,==%J 4 1， !" #$ " 1R%=6S%3N 6%R,+,>，=TIN=<<+R, ［ L］ 3,U =V3%S3W+R, RX IBR<IBRBJUNR%3<=< XRN IBJW3<= 7 U=>N3U+,> 36W+V+WJ " ! " "#$ " %&’()*&)+， !99#， !C： 09@ 7 C)-M ［C］ 王红宁， 吴琦， 刘世贵， 等 " 黑曲霉 2-# 植酸酶 IBJ5 基因的克隆及序 列分析 ［ L］ （@） ： " 微生物学报， -))!， C! 0!) 7 0!CM
生 物 技 术 第 %; 卷第 J 期 ;$ ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 特定位点上。但在应用这种技术的过程中， 必须把受体质粒 和供体质粒共同转入受体菌中。由于共转化的效率很低， 而 常规的 !"!#$ 转化法其转化效率最大只能达到 %&’ ( %&) 转化 ［ ］ 这种转化效率很多时侯无法满足共转化的要 子 *! + ,-. $ ， 求， 因此使用电激转化法进行共转化是最常见的选择。虽然 ［ ］ 但需要 电激法的转化效率可达到 %&/ ( %&%& 转化子 *! + ,-. $ ， 使用比较昂贵的电激仪。 而且转化前需要对电激参数进行探索， 以找出最佳的电 激参数， 否则也无法得到满意的转化效率。本文对分子克隆 发展了一种 中常规的感受态制备法和 !"!#$ 转化法加以改良， 稳定、 高效的感受态制备和转化方法， 转化效率高达 %&) ( %&/ 转化子 *! 完全可以满足各种转化实验 （包括共转化） 的 + ,-.， 要求， 可作为电激法的一种替代方法。使用该法， 我们成功地 并通过 !01 酶介 将受体质粒和供体质粒共转化入 !01 菌株中， 导的位点特异性重组将供体质粒上的 2345 ( % （ 人胰岛素样生 长因子 ( %） 基因连接到受体质粒的特定位点上。 % 6 % 材料 % 6 % 6 % 菌种和质粒 0 分子生物学实验中常用的一种大肠杆菌转化 ,78 "( 9% ： 菌株， 本实验室储存。 含有 BCDE 位点的受体 ： :--%;$（ <=%&’ >?） !01 菌株， @"A0 ， # 质粒和供体质粒共转化进入该菌体后， 可以发生 !"# 酶介导 的特异性体内重组。该菌株由美国 3AF0"GH+I 公司惠赠。 该质粒为供体质粒， 长度为 K 6 ;>O， M,-N ( 2345 ( %： .IM0 ， 具有两个 BCDE 位点， 两个 BCDE 位点之间为待克隆的目的基因 该基因长度为 K;&OM。该质粒由本室程度博士构建。 2345 ( %， 该 质 粒 为 受 体 质 粒， 长 度 为 J>O， 经过与 M3AFPM"9： .IM0 ， 载体将从供体质粒上 !01 * BCDE 系统介导的供体质粒重组后， 获得目的 基 因 2345 ( %， 并且原来沉默的四环素抗性基因 也会恢复表达， 据此可以筛选出共转化的重组子。该质 （!I0 ） 粒由美国 3AF0"GH+I 公司惠赠。 以上试剂中， 氯化镁、 硫酸镁、 葡萄糖、 氯化钙、 甘油、 氯化 钠、 氯化钾购自上海生工生物技术有限公司， 为分析纯级试 剂。W1"RF 1DF0"?F 和 90UFCA1 购自 .I01R?C 公司。 % 6 $ 方法 % 6 $ 6 % 感受态制备： 接种 $IB 过夜培养的菌液到 $&&IB B: 培养基中。 ;’Z 转移培养液到离心管中， 立 $8&0VIHA 振荡培养至 X,88& [ & 6 8； 即放 入 冰 浴 中， 轻 轻 旋 转 至 完 全 冷 却。 KZ 8&&&0VIHA 离 心 冰 %&IHA。菌体沉淀重悬于 %&&IB 用冰预冷的氯化镁溶液中； 浴中放置 8IHA， KZ K&&&0VIHA 离心 %&IHA。然后重悬于 %&&IB 用冰预 冷 的 氯 化 钙 溶 液 中， 冰 浴 $&IHA。 KZ K&&&0VIHA 离 心 %&IHA。重悬于 $&IB 氯化钙 * 甘油溶液。最后将感受态细胞分 装并储藏于 ( ’&Z 。 % 6 $ 6 $ 共转化程序 取 8& ( %&& 加入 % ( 8 # 感受态细胞， B ,-. 连接液或以 ! ! 适当比例混合的两种质粒， 轻轻混匀。冰浴 ;&IHA 后， K$Z 水 浴热激 ;&R。加入 8&& ! B ;’Z 预热的 PX! 溶液， ;’Z 、 $8&0VIHA 振荡培养 K8IHA。取 %&& ( $&& ! # 转化液涂含有筛选抗生素的 B: 平板。;’Z 倒置培养过夜。 转化效率的确定 利用本文所述的方法， 将受体质粒 M3AFPM"9 转化到大肠杆 0 菌菌株 ,78 经多次实验统计， 转化效率约为 %&) ( "( 9% 中， / 转化子 之间。 *! + ,-. %& $ 6 $ 共转化转化子的获得 将供体质粒 M,-N ( 2345 ( % 和受体质粒 M3AFPM"9 按照 %： 共转化 :--%;$ 感受态细胞， 取 %&& % 比例混合， B 涂含有 8& + ! ! 上转化子的数目约为 %&& ( * IB !I 的 B: 平板。过夜培养后， （转化子数目为多次实验的结果） 。随机挑取几个转化 8&& 个 子提取质粒后进行酶切鉴定。 $ 6 ; 共转化转化子的酶切鉴定 提取转化子质粒后， 获得了 J 6 K>O 长度的重组质粒。对该 重组质粒进行 Q?CN3 酶切分析， 电泳结果如图 % 所示。 由于酶切位点的原因， 无法直接将目的基因 2345 ( % 从重 组载体上切下来。只能采用间接的方法鉴定 2345 ( % 是否被 重组到受体质粒 M3AFPM"9 上。受体质粒上原来只有一个 Q?CN3 单酶切位点， 而目的基因 2345 ( % 上具有一个 Q?CN3 位点。从 理论上分析， 如果重组质粒 2345 ( % 被位点特异性地重组到受 体质粒 M3AFPM"9 上， 用 Q?CN3 酶切将会从重组质粒上切下来一 段 %>O 大小的片段， 剩余的片段大小约为 8 6 K>O。从上图可以 看出， 重组质粒用 Q?CN3 酶切后， 切成两条片段， 大小约为 %>O 和 8 6 K>O， 实际的酶切分析结果与理论分析相符， 从而证明了 转化子中的重组质粒为 !01 * BCDE 系统介导的含有 2345 ( % 基 因的重组质粒。因此本文所建立的高效感受态制备和 !"!#$ 转化法用于共转化实验是完全可行的。 $ 6 K 讨论 本方法 $ 6K 6 % 与分子克隆中的感受态制备和转化方法相比， 的改进之处主要有三点： 第一， 在制备感受态细胞时， 增加了一步用氯化镁溶液重 悬菌体细胞的操作， 这是得到高转化率的感受态细胞的关键。 第二， 第二次重悬菌体细胞时用含有 90HR ・!# 的氯化钙溶 液而不是单纯用氯化钙溶液， 进一步促进了细胞感受态的形 成。 第三， 制备好的感受态细胞进行转化时， 热激时间缩短为 而不是 《分子克隆》 中推荐的 /&R。据作者研究， 虽然 K8R、 K8R， J&R、 /&R 的热激时间对于上述方法制备的感受态细胞都可以实 现外源质粒的转化， 但转化子的数目明显不同， K8R 热激处理 的转化子数目最多。 上述改进， 有利于细胞感受态的形成， 增加了处于感受态 的细胞的数目， 有利于外源基因的进入， 使得转化效率比常规 的氯化钙转化法提高了 %& ( %&& 倍。 ［$］ 上的感受态制备和转化方法进行 $ 6K 6 $ 作者曾使用文献 上述质粒的共转化， 实验结果或者没有转化子， 或者转化子只 有几个至十几个， 转化效率比作者建立的方法低 %& 倍以上， 而且其中往往相当一部分是假阳性转化子。共转化转化效率 低所带来的困难是往往筛选不到所需的转化子。 结果稳定。作者先后使用该法进行 $ 6 K 6 ; 本方法重复性好， 过几十次共转化或单一转化实验， 每次转化效率都很高， 单质 ) / 共转化转化子 粒转化效率介于 %& ( %& 转化子 *! + ,-. 之间， 每个平板则有几百甚至上千个之多， 完全可以满足各种转化 试验。 综合上述几点， 本方法操作简单、 迅速， 转化效率高， 结果 稳定。既可以应用于两个或多个质粒的共转化， 也可以直接 应用于一些连接效率比较低 （如平端连接等） 的连接反应的转 化， 而且不需要特殊的仪器和设备， 值得推广。 $6%
第 !0 卷第 @ 期： 0! -))0 年 !- 月
生 物 技 术 HY4/&KP24_4‘c
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中图分类号： ](.# 文献标识码： 5 文章编号： （-))0） !))C 7 0!!^ )@ 7 ))0! 7 )0
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-
结果
三种方法分别从 !> 菌丝体中提取出的 ?25 溶液， 经 -#) 被稀释后测定其 -@),$ 和 -.),$ 的 4? 值， 计算 5-@) A5-.) 值、 （见表 !） 。 ?25 浓度及总产量
表 ! 三种黑曲霉细胞基因组 ?25 提取方法的比较 方法 提取时间 （B） 5-@) A5-.) 总产量 （! >） 氯化苄法 07C ! " #) 0 !7#7@ ! " (# - " !!0 !0)