Pre-S蛋白N-糖基化对细胞MHC-I和CD80表达影响研究

申请代码：
受理部门： 收件日期： 受理编号：
C03011402
国家自然科学基金
申请书
资助类别：面上项目 亚类说明：自由申请项目 附注说明：
项目名称：Pre-S 蛋白 N-糖基化对细胞 MHC-I 和 CD80 表达影响研究
申 请 者：周吉军
电话： 023-68754289
依托单位：中国人民解放军第三军医大学
关 键 词(用分号分开，最多 5 个) HBV；糖基化；Pre-S；MHC-I；CD80
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版本 1.004.937
国家自然科学基金申请书
项目组主要成 员 ( 杰 出 青 年 科 学 基 金 不 填 此 栏 )
编号
姓名
1 李俊刚 2 汤勃 3 王洪 4 王方 5 蒋黎 6 刘俊
7
出生年月 1975-6-10 1973-4-16 1967-8-17 1969-09-09 1974-06-18 1973-10-21
HBV 包含 L、M 和 S 三种表面抗原糖蛋白（天然或全表面抗原基因重组表达均如此），其中绝大部 分是 S，M 和 L 只占 2~5%。Pre-S 抗原所占比例很小，但却是非常重要的 HBV 抗原。研究（动物和人 体实验）发现 Pre-S 抗原免疫原性却比 S 抗原强得多，抗体产生也快于 S（提前 2 周）；接种仅含 S 抗原 的疫苗出现的无应答者，接种含 Pre-S 的疫苗却是有效的；研究发现病毒感染时 Pre-S 蛋白首先接触肝细 胞，因此可能是 HBV 感染配体[2]。HBV 表面抗原上，S 区有 1 个 N-糖基化(glycosylation)位点 （Asn-X-Ser/Thr）， Pre-S 区有 2 个 N-糖基化位点，分别位于 Pre-S1 区（Asn15）和 Pre-S2（Asn123）。
图 1。项目立题思路示意图。Pre-S 真核表达载体转染后，翻译、合成 Pre-S 蛋白，在内质网、高 尔基器进行 N-糖基化修饰，增加了内质网压力，引起细胞合成 MHC-I、CD80 等分子 N-糖基化修饰 改变，导致不能正常折叠，无法表达到细胞表面，影响到特异性 CTL 的免疫识别。同时未 N-糖基化 修饰的 MHC-I、CD80 分子因无法表达，在胞内聚积。
病毒抗原糖基化修饰对免疫应答有重要影响[3]，该方面研究进展包括： ⑴N-糖基化对抗体应答有重要影响，已公认 HIV gp120 的 N-糖基化与免疫逃避密切相关，其 N-糖基 化位点数量与耐受抗体中能力密切相关，gp120 上含有超过 20 个的宿主细胞特异性 N-连接聚糖。利用 酵母表达的 HBV Pre-S 抗原，研究发现 Asn15 和 Asn123 上的 N-连接聚糖，干扰了针对 Pre-S 的 B 细胞 应答，导致 Pre-S 中和性抗体产生降低[2]。 ⑵糖基化可在不改变病毒遗传水平情况下，导致抗原表位结构改变，引起抗原变异或生成新表位 （neo-epitope）[3]。供树突状细胞（dendritic cells，DCs）等 APCs 摄取、加工和呈递的天然抗原（如病 毒抗原、肿瘤抗原）大多呈糖基化（糖蛋白）或其他翻译后修饰状态[4]。糖基化可通过改变肽表位的三 维结构，影响短肽表位与 MHC-Ⅰ类分子的结合及与 TCR 的交互作用。研究表明 CTL 所识别表位部分 靠小的糖基结构确定。糖基化可阻断肽与 MHC-Ⅰ类分子结合，也可通过糖基直接与 MHC 分子交互作 用，恢复结合。申请者也已证实了 HBV 糖肽特异性的 CTL 存在（详见工作基础）。 由于病毒蛋白糖基化的复杂多样性和难以操控性，目前相关研究存在一些局限性，病毒抗原修饰后 引起表位改变影响免疫应答是引起免疫逃避的一个重要因素，另一方面病毒感染细胞表面的重要免疫识 别相关分子表达也对免疫识别产生重要影响，其中下列值得重视的问题有待解决： ⑴虽然研究发现病毒抗原糖基化修饰对免疫应答有重要影响，但病毒蛋白糖基化修饰对宿主细胞重 要免疫识别相关分子修饰、表达影响尚不清楚。无论宿主细胞自身糖蛋白还是感染病毒表达糖蛋白，糖
（5）其它
0.5000 评审、鉴定费
2.实验材料费
14.0000
（1）原材料/试剂/药品购置费 （2）其它
14.0000 购买试剂、耗材 0.0000
3.仪器设备费
0.0000
（1）购置
0.0000
（2）试制 4.实验室改装费 5.协作费
0.0000 1.0000 试验室简单装修、维修费 0.0000
0.0000 0.0000 0.0000
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报告正文
（一）立项依据与研究内容（4000-8000 字）：
1、 项目的立项依据（附主要的参考文献目录）。
乙型肝炎病毒（HBV）感染过程中，细胞免疫，特别是细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）在清除感染 HBV 过程中起关键作用，HBV 表面抗体作为一种保护性抗体，产生则呈 T 细胞依赖过程[1]，其出现通 常反映感染病毒已被有效清除。CTL 能识别感染肝细胞表面 MHC-I类糖蛋白分子呈递的 HBV 抗原表位， 引发抗原特异性和 MHC-I 限制性抗病毒效应 [2]，这是免疫识别的第一信号。同时感染细胞表面的以 CD80 （B7-1）为代表的糖蛋白分子与 CTL 表面的 CD28 交互作用，产生共刺激信号，称为识别的第二信号。 抗原呈递细胞（APCs）对 HBV 抗原的加工、MHC-I 分子对抗原的呈递是 CTL 特异性识别的关键。慢性 HBV 感染时，病毒感染细胞可逃避宿主的免疫应答，机制尚未研究清楚。
称 中国人民解放军第三军医大学
代 码 63003801
单
位 信
联 系 人 杨勇
电子邮件 yy4243@163.net
息 电
话 023-68752193
网站地址 www.tmmu.edu.cn
合
作
单位名称
单
位
信
息
代码
项目名称
Pre-S蛋白N-糖基化对细胞MHC-I和CD80表达影响研究
项
目
资助类别 面上项目
⑶HBV 感染细胞逃避宿主抗病毒免疫机制尚不清楚，HCV 复制子抑制宿主细胞 MHC-I 分子正常表 达这一发现还是为研究 HBV 慢性感染提供了重要研究线索，特别是通过研究病毒抗原蛋白糖基化对宿 主细胞 MHC-I、CD80 等重要免疫识别相关分子糖基化修饰及表达的影响，对研究 HBV 免疫逃避有重要 意义。
亚 类 说 明 自由申请项目
基
附注说明
本
申请代码
C03011402:传染病的发病机理 研究
信
基地类别
息
预计研究年限 2005 年 1 月 — 2007 年 12 月
研究属性 基础研究
申请经费 24.0000 万元
项目研究内容和意义简介（限 400 字）：细胞免疫在清除 HBV 感染中起关键作用，其中特异 性 CTL 的 TCR 对感染细胞表面 MHC-I 糖蛋白分子呈递 HBV 抗原表位识别是免疫识别的第一 摘 信号，细胞表面糖蛋白分子 CD80 与 CTL 表面的 CD28 交互作用为免疫识别第二信号。HBV 表面糖蛋白中，Pre-S 蛋白具有重要生物学和免疫学意义。已知病毒抗原糖基化对免疫应答 有重要影响，但病毒蛋白糖基化修饰对宿主细胞自身免疫识别相关分子修饰及表达影响尚 不清楚。已发现 HCV 复制子通过增加内质网压力抑制宿主细胞自身合成蛋白的糖基化修饰， 影响到 MHC-I 正常表达。本研究拟在 pIL20-HBVS 质粒基础上，通过构建新的不同 N-糖基化 要 Pre-S 真核表达载体，转染人源 Huh7 细胞株，观察 HBV Pre-S 抗原表达及 N-糖基化修饰对 转染细胞 MHC-I、CD80 等重要免疫识别相关分子 N-糖基化修饰、细胞表面表达及特异性 CTL 识别的影响，为进一步研究 HBV 免疫逃避机制提供线索。
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国家自然科学基金申请书
研究病毒抗原蛋白糖基化的技术难点是如何
控制糖基化修饰的发生，以往研究 HBV 等病毒
抗原糖基化，主要依赖糖肽合成技术，该方法合
成的糖肽糖基只能是寡糖，不能反映宿主细胞内
病毒抗原糖基化的全貌，只适用局部表位修饰研
究，不适用于连有 N-聚糖的完整糖蛋白的研究。
性别 职 称 学 位
男
助理研究 员
硕士
男 博士后 博士
男 博士生 硕士
女 讲师
ຫໍສະໝຸດ Baidu
博士
女 讲师
硕士
男 技师
学士
单位名称
电话
中国人民解放军第三军医大 学 中国人民解放军第三军医大 学 中国人民解放军第三军医大 学 中国人民解放军第三军医大 学 中国人民解放军第三军医大 学 中国人民解放军第三军医大 学
0236875428 9 0236875447 5-8044 0236875428 9 0236875428 9 0236875428 9-8007 0236875428 9
通讯地址：重庆市沙坪坝区高滩岩正街 30 号
邮政编码：400038
单位电话：023-68752193
电子邮件：zjjcrk@mail.tmmu.com.cn
申报日期：
2004年3月15日
国家自然科学基金委员会
国家自然科学基金申请书
基本信息 yoKWT/OQ
申姓
名 周吉军
性别 男
出生 年月
1967 年 11 月
电子邮件
ljg579@mail.tmmu.com .cn tobei@mail.tmmu.com. cn wanghong@mail.tmmu.c om.cn helon919@163.com
jll3008@sina.com liujun731021@sohu.co m
项目分工 载体构建
每年工 作时间 （月）
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基化修饰均发生在细胞内质网和高尔基器（Golgi），即病毒抗原糖基化修饰利用了宿主细胞自身的翻译 后修饰（posttranslational modification）机制。宿主细胞表面 MHC-I、CD80 等重要免疫识别相关分子均 为糖蛋白，糖基化修饰对其正常表达有重要影响，如 MHC-I 重链糖基化是 MHC-I 分子正常折叠和装配 所必需的（见图 1）。
二.国际合作与交流费
0.0000
1.项目组成员出国合作交流
0.0000
2.境外专家来华合作交流 三.劳务费
0.0000 2.3000 临时工工资
四.管理费
1.2000 按照《国家自然科学基金经费管理办法》
合计
24.0000
与本项目相关的 其他经费来源
国家其他计划资助经费 其他经费资助（含部门匹配）
其他经费来源合计
⑵已发现胞内感染病毒的复制表达对宿主细胞自身合成蛋白糖基化修饰有重大影响，利用 HCV 复 制子（replicon）研究发现 HCV 复制子可通过抑制宿主细胞 MHC-I 分子呈递抗原给 CTL 而逃避免疫， 这主要因为 HCV 复制表达增加了内质网的压力，胞内蛋白糖基化修饰受到抑制，糖基化改变干扰了蛋 白的正常折叠，导致 MHC-I 分子装配障碍，不能表达到细胞表面[5]，病毒复制引起内质网压力增加的机 制尚不清楚。HBV 是否存在类似情况，特别是病毒蛋白糖基化修饰是否引起内质网压力增加而影响宿主 细胞蛋白糖基化修饰值得研究。
最近 Lee 等[5]成功构建了包含信号肽、合成前序
列和内肽酶 KEX2 切除位点（-Lys-Arg-）的 Pre-S 重组表达载体质粒 pIL20-HBVS（见
4
细胞转染
4
流式细胞检 测
4
SDS-PAGE
4
免疫沉淀
3
细胞培养
5
8
9
总人数
高级
中级
初级
博士后
博士生
硕士生
7
1
3
1
1
1
说明: 1. 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报，总人数自动生成。 说明: 2. 项目组主要成员不包括项目申请者。
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版本 1.004.937
国家自然科学基金申请书
民 族 汉族
请学
位 博士
职称 副教授
主要研究领域 传染病学
者电
话 023-68754289
电子邮件 zjjcrk@mail.tmmu.com.cn
信传
真 023-65397072
个人网页
息 工 作 单 位 中国人民解放军第三军医大学 /西南医院全军感染病研究所
在研项目批准号 30200242
依 托名
经费申请表
（金额单位：万元）
科目 一.研究经费
申请经费
20.5000
备注（计算依据与说明）
1.科研业务费
5.5000
（1）测试/计算/分析费
2.0000 流式细胞仪使用等
（2）能源/动力费 （3）会议费/差旅费 （4）出版物/文献/信息传播费
0.5000 水、电费 1.0000 学术会议、差旅费 1.5000 论文发表费、网络费