免疫学基础与病原学第八章 免疫学应用

1 、外周血单个核细胞的分离 密度梯度离心法：密度为1.077的淋巴细胞分离液表面
血浆、血小板—单个核细胞(淋巴细胞、单核细胞)---红细胞、粒细胞
2 、淋巴细胞及其亚群的分离
（1）玻璃黏壁分离法：分离单核细胞、淋巴细胞 （2）尼龙毛柱分离法： 分离T、B细胞 （3）磁珠分离法：免疫磁珠（IMB）阳选、阴选 （4）流式细胞术：单细胞悬液—荧光标记----荧光计数、 液滴电荷分离。
• Ascoli试验检测炭疽
a. 取沉淀反应管3支→各加0.1ml炭疽沉淀素血清。 b. 将待检抗原→沿管壁轻轻加入其中一支,使其重叠在炭疽 沉淀素血清上，使上下两液间有一整齐界面。 c. 另二支沉淀反应管，其中一支加炭疽标准抗原;另一支加 生理盐水，作为对照，方法同上。 d. 将反应管直立静置，3-5min内判定结果。
直接凝集
红细胞
+ 抗红细胞 抗体 （IgG）
用于：ABO血型测定 细菌鉴定（肥达试验）
凝集
肥达试验（widal test）：用已知的伤寒杆菌O、H抗原和甲、乙 型副伤寒杆菌H抗原，与待测血清作试管或微孔板凝集实验,以测 定血清中有无相应抗体存在，作为伤寒、副伤寒诊断的参考。
外斐试验(Weil-Felix test)：变形杆菌属的X19,X2.Xk菌株的菌体 O抗原与斑疹伤寒立克次体和恙虫病东方体有共同抗原，故可用 这些菌株的O抗原（OX19，OX2，OXk）代替立克次体抗原与患 者血清进行交叉凝集反应，检测患者血清中相应抗体，此称外斐 试验，辅助诊断立克次体病。
（1）酶免疫测定法
将抗原抗体反应在固相上进行,通过洗涤除去游离 成分.目前是应用最广的免疫酶技术。
双抗体夹心法
间接法
E
E
冲洗
待测为抗原
待测为抗体
（3）放射免疫测定仪 放射性核素标记抗原或抗体
（4）化学发光免疫分析仪 化学发光物质标记抗原或抗体
（2）免疫荧光法
常用荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明和藻红蛋白 （PE）等
（2）凝胶内沉淀反应
1） 扩散试验 单向扩散、双向扩散
2）免疫电泳
※ 单向免疫扩散
不同浓度的标准血清
待测血清（Ag）
d’
Ab
浓
度 （对数）
c’
d’
直径
※ 双向免疫扩散
Ag
Ab
将抗原与抗体分别加入 琼脂凝胶的小孔中，抗原抗 体会自由地向四周扩散，在 它们相遇的位置形成一条沉 淀线。是一种定性检测法。
Ag1
Ag1
Ab1
Ag1
Ag2
Ab1、2
Ag1
Ag1、2
Ab1、2
2）免疫电泳
火箭电泳
3.免疫标记技术
是将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用荧光素、酶、放射 性核素等标记的抗体或抗原进行抗原-抗体反应，以检测抗原 或者抗体的技术。
（1）酶免疫测定法(enzyme immunoassay，EIA） （2）免疫荧光法 （3）放射免疫测定（radioimmunoassay ,RIA） （4）免疫印迹法（western blotting ） （5）免疫PCR （immuno-PCR， IM-PCR）
二、以细胞为基础的免疫治疗
给患者输入细胞制剂，以激活或增强机体的免疫应答。 1. 造血干细胞 2. 骨髓、胸腺移植 3. 过继免疫治疗 4. 细胞疫苗
① 肿瘤细胞疫苗 ② 基因修饰的瘤苗 ③ 树突状细胞疫苗
三、以细胞因子为基础的免疫治疗（自学）
1. 外源性细胞因子治疗： 2. 细胞因子基因疗法： 3. 细胞因子及其受体的拮抗疗法：
一、以抗体为基础的免疫治疗
作用：抗感染、抗肿瘤、抗移植排斥； 原理：抗体中和毒素、炎性因子，ADCC治疗 方式：包括多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体。
1. 多克隆抗体
用抗原免疫动物后获得的或者从机体组织中提取的免疫球蛋白。 （1）抗毒素血清：用于紧急预防和治疗细菌外毒素所致的疾病。 （2）人丙种球蛋白：人血浆丙种球蛋白、胎盘丙种球蛋白用于免疫 缺陷病或常见病毒性疾病的紧急预防。 （3）抗淋巴细胞丙种球蛋白：用人外周血淋巴细胞作为抗原，免疫 动物或获得的针对人淋巴细胞表面抗原发热抗体。溶解自身淋巴细胞。
※（一）抗原-抗体反应的特点
1. 抗原-抗体反应原理 2. 抗原-抗体反应特点 3. 抗原-抗体反应的影响因素
1. 抗原-抗体反应原理
抗原与相应抗体的可发生特异性结合。 血清学反应
※2. 抗原-抗体反应特点
1、高度特异性
课题讨论：请问抗原抗体反应的特异性又什么决定？
2、可逆性 3、可见性
可逆性
间接凝集
常用载体：绵羊红+细胞、聚苯乙烯乳胶等。
用于：激钩素端抗螺体旋体病、激血素吸分虫子病、类风湿关节不炎凝的集辅助诊断。
激素包被的 乳胶颗粒
+
激素抗体
凝集
① 正向间接凝集反应 ② 反向间接凝集反应 ③ 间接凝集抑制反应 ④ 协同凝集反应
P100
2、沉淀反应
沉淀反应 可溶性抗原（血清、细菌培养滤液、组织 浸液等）与相应抗体结合后，在一定条件下出现肉 眼可见的沉淀物或仪器可检测出的沉淀现象，称为 沉淀反应。 类型 （1）液相沉淀反应 （2）凝胶内沉淀反应
（一）人工主动免疫的生物制品
3. 亚单位疫苗: 为提取病原体有效免疫成分制备的疫苗。其 不仅提高免疫效果，又可减少接种疫苗后的副作用。 4. 合成肽疫苗: 抗原肽疫苗，抗原性多肽+载体+佐剂 5. 基因工程疫苗:
① 重组 抗原疫苗：体外转化、表达、提纯 ② 重组载体疫苗：疫苗株体内表达 ③ DNA疫苗：质粒导入后表达 ④ 转基因植物口服疫苗：植物表达，口服获得
亲和力：抗体抗原之间的结合力大小 结合力大则亲和力强，不易解离，反之亦然
可见性
抗原与抗体的结合呈现明显的肉眼可见的现象，比 如絮状沉淀等其与两者的分子比例密切相关。
3. 抗原-抗体反应的影响因素
（1）电解质：抗原和抗体结合后，亲水性减弱，易 受电解质影响。
（2）温度：适当提高温度，可以增多抗原抗体分子 碰撞的机会，可加速抗原抗体复合物的出现，但过高 的温度（超过56℃）会使抗原或抗体变性失活。 （3）酸碱度：抗原-抗体反应的最合适pH在6~8， pH过高或过低均可影响抗原抗体的理化性质。
（1）液相沉淀反应
• 絮状沉淀试验：康氏反应（梅毒）
康氏反应(KT)是使用酒精浸泡牛心粉，提取磷脂部分做为抗原， 加入胆固醇以增加灵敏度，与待测血清中抗体(反应素)，在电解质作 用下，抗原抗体形成可见的沉淀反应。（梅毒阳性）
• 环状沉淀试验：Ascoli 反应（炭疽）
环状沉淀试验是Ascoli于1902年建立的，其方法是：先将抗血清 加入内径1.5～2mm小玻管中，约装1/3高度，再用细长滴管沿管壁叠 加抗原溶液。因抗血清蛋白浓度高，比重较抗原大，所以两液交界处 可形成清晰的界面。此处抗原抗体反应生成的沉淀在一定时间内不下 沉。一般在室温放置10min至数小时，在两液交界处呈现白色环状沉 淀则为阳性反应。
⑵巨噬细胞功能的检测
1）吞噬能力： 吞噬率、 吞噬指数 2）杀菌功能试验：培养—计算菌落
第二节 免疫预防
第二节 免疫预防
概念：是指根据特异性免疫的原理，通过人 工方法刺激机体产生或直接输入免疫活性物 质，以增强机体的特异性免疫力措施。
人工主动免疫 人工被动免疫。
一、人工主动免疫
人工主动免疫（artificial active immunization)： 指给机体输入抗原物质，使免疫系统因抗原刺激而 产生类似感染时所发生的免疫过程，从而产生特异 性免疫力。
来的毒力高度减弱或基本无毒的、保留有免疫原性的
2. 减毒活疫苗 又称减毒活疫苗
是用人工定向变异的方法或直接从自然界筛选出 来的毒力高度减弱或基本无毒的、保留有免疫原性的 活微生物制成的预防制剂，如卡介苗（230传代）、 麻疹疫苗等。
优点：只需接种一次、接种剂量小、免疫力3-5年；
缺点：体内存在回复突变、不易保存、接种局限。
（1）非特异性丙种球蛋白制剂：人血浆丙种球蛋白、胎盘丙种 球蛋白。
（2）特异性免疫球蛋白制剂：由含有针对某种病原生物高效价抗 体的血浆制备。抗病毒血清、抗Rh球蛋白、 抗蛇毒血清等。
Байду номын сангаас 三、免疫规划与预防接种
计划接种：是根据某些传染病的疫情分析和人群免疫状 况分析，所制定的科学的、长期的、有计划的预防接种 程序，使人体获得对这些传染病的免疫力，从而达到控 制、消灭传染源的目的。 P107表8-1
特点： 免疫出现缓慢（通常有1~4周诱导期）；维持
持久，可从半年到数年。
（一）疫苗
1.灭活疫苗 是将病原微生物用物理或化学方法杀死后制成的
预防制剂，又称死疫苗。 接种：皮下注射； 优点：易保存且时间长； 缺点：多次接种，接种剂量大，免疫能力0.5-2年
2. 减毒活疫苗 又称减毒活疫苗 是用人工定向变异的方法或直接从自然界筛选出
（2）抗细胞因子的单抗：阻断细胞因子的作用
抗TNR-α单抗可特异性阻断TNR-α与TNR-α受体的结合，减轻炎症 反应，用于治疗慢性炎症性疾病。
（3）抗体靶向治疗：以高特异性的单抗作为载体，将细胞毒性物质
靶向性携带至肿瘤病灶局部，可特异性杀伤肿瘤细胞。 ① 放射免疫治疗 ② 抗体导向化学治疗 ③ 免疫毒素疗法
应用？
2. 单克隆抗体 用杂交瘤技术制备出的识别单一表 位的特异性抗体。
（1）抗细胞表面分子的单抗：识别免疫细胞表达的特定表 面分子，通过不同的作用机制达到治疗目的。
抗CD3单抗破坏特异性T细胞，抑制器官移植急性排斥反应； 抗CD20单抗选择性破坏B细胞，治疗B细胞瘤； 抗PD-1单抗阻断PD-1/PD-L1通路恢复T细胞的增殖活性与杀伤功能， 用于治疗某些肿瘤。
直接法
间接法
冲洗
冲洗1
冲洗2
AAggAAgAggAAggAAAgggAg
AAggAAgAggAAggAAAgggAg
可通过荧光显微镜或流式细胞仪观察荧光。
4. 蛋白质芯片技术
抗体芯片：是将抗体固定到芯片表明以 检测相应的抗原
二、免疫细胞的检测
免疫细胞的分离及鉴定 免疫细胞功能测定
※（一）免疫细胞的分离及鉴定
※（二）免疫细胞功能测定
1、淋巴细胞增殖试验 2、细胞毒试验 3、吞噬细胞功能的检测
放 1、淋巴细胞增殖试验 射 性 核 素 掺 入 法
（1）放射性核素参入法 （2）MTT比色法 （3）形态计数法
2. 细胞毒试验
3. 吞噬细胞功能的检测
⑴中性粒细胞功能的检测
① 运动情况 ② 中性粒细胞噬菌试验 ③ 硝基蓝四氮唑、化学发光试验
第三节 免疫治疗
免疫治疗
概念：是指针对疾病的发生机制，根据免疫学原 理，人为地增强或抑制机体的免疫功能以达到治 疗疾病目的的治疗方法。
作用特点：特异性和非特异性免疫治疗； 作用机制：主动和被动免疫治疗； 机体影响：免疫增加和免疫抑制疗法； 按治疗剂： 以抗体、免疫细胞、细胞因子为基础的免疫治疗。
（二）类毒素
细菌外毒素经0.3%~0.4%甲醛处理，失去 毒性，保留其免疫原性，能刺激机体产生保 护性免疫产生抗毒素的制剂称为类毒素。
二、人工被动免疫
人工被动免疫是指人工方法给机体直接输入含特异性抗 体或细胞因子的制剂，以治疗或紧急预防感染的措施。 1. 抗毒素：用细菌外毒素或类毒素免疫动物制备的免疫血清 2. 人免疫球蛋白制剂：
第八章 免疫学应用
主讲 刘文洪
教学目的及要求
1 了解免疫治疗常用方法的概念、种类。
免疫治疗和免疫预防的常用制剂。
2 熟悉免疫诊断的主要方法；免疫预防常用方法概念、种类
3 掌握免疫诊断方法的原理；人工免疫的概念与类型
第一节 免疫诊断
一、基于抗原抗体反应的检测 二、免疫细胞功能的检测
一、基于抗原抗体反应的检测
四、免疫调节剂为基础的免疫治疗
免疫增强剂和免疫抑制剂可以非特异性地增强或抑制免疫 功能，在临床上广泛用于感染、免疫缺陷、肿瘤、自身免 疫性疾病的治疗。
※（一）免疫增强剂
概念：也称为免疫激活剂，主要包括某些微生物制剂、免疫因子、化学合 成药物和中药制剂，具有免疫促进作用。
1. 微生物制剂： 能增强免疫活性的微生物制剂主要包括卡介苗（膀 胱癌等肿瘤辅助治疗）和短小棒状杆菌（黑色素瘤）。
※（二）抗原、抗体的检测方法
1、凝集反应 2、沉淀反应 3、免疫标记技术
1、凝集反应
凝集反应 细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后， 在一定 条件下出现肉眼可见的凝集现象
⑴直接凝集反应： 是颗粒性抗原与相应抗体直接结合所 出现的凝聚现象，如红细胞或者细菌凝集试验。
⑵间接凝集反应： 将可溶性抗原（或抗体）吸附于与免 疫无关的载体颗粒（如红细胞、胶乳颗粒等）表面，然 后再与相应抗体（或抗原）结合而出现的凝集现象。