1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法
控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微 生物。 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料是否符合相应的微生物限度标准 时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。 本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代 方法等效于药典规定的检查方法。 供试液制备及实验环境要求同 “非无菌产品微生物限度检查： 微生物计数法” （通则 1105） 。 如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时, 若使用了 中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物无毒性。 供试液制备时如果使用了表面活性剂， 应确认其对微生物无毒性以及与所使 用中和剂或灭活剂的相容性。 培养基适用性检查和控制菌检查方法适用性试验 供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。 供试品的控制菌检查方法应进行方法适用性试验， 以确认所采用的方法适合 于该产品的控制菌检查。 若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时， 控制菌检查方法应重新进 行适用性试验。 菌种及菌液制备 菌种 试验用菌株的传代次数不得超过 5 代 （从菌种保藏中心获得的干燥菌
种为第 0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学 特性。 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC（B）26 003〕 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC（B）10 104〕 大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC（B）44 102〕 乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)〔CMCC（B）50 094〕 白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC（F）98 001〕 生孢梭菌（Clostridium sporogenes） 〔CMCC（B）64 941〕
菌液制备
将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接
种于胰酪大豆胨液体培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上，30～35℃培养 18～24 小时；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖液体 培养基中，20～25℃培养 2～3 天；将生孢梭菌接种于梭菌增菌培养基中置厌氧 条件下 30～35℃培养 24～48 小时或接种于硫乙醇酸盐流体培养基中 30～35℃培 养 18～24 小时。上述培养物用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9%无菌氯 化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。 菌液制备后若在室温下放置，应在 2 小时内使用；若保存在 2～8℃，可在 24 小时内使用。生孢梭菌孢子悬液可替代新鲜的菌悬液，稳定的孢子悬液可保存 在 2～8℃，在验证过的贮存期内使用。 阴性对照 为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验， 阴性对照试验应无 菌生长。如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。 培养基适用性检查 控制菌检查用的成品培养基、 由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行 培养基的适用性检查。 控制菌检查用培养基的适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示特 性的检查。各培养基的检测项目及所用的菌株见表 1。 表1 控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力和指示特性 培养基 特性 试验菌株 大肠埃希菌 铜绿假单胞菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌
控制菌检查
耐胆盐革兰 肠道菌增菌液体培养 促生长能力 阴性菌 基
紫 红 胆 盐 葡 萄 糖 琼 脂 促 生 长 能 力 + 指 示 大肠埃希菌 培养基 大肠埃希菌 麦康凯液体培养基 特性 促生长能力 抑制能力 麦康凯琼脂培养基 铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌
促 生 长 能 力 + 指 示 大肠埃希菌 特性
沙门菌
RV 沙门菌增菌液体培 促生长能力 养基 抑制能力
乙型副伤寒沙门菌
金黄色葡萄球菌
木 糖 赖 氨 酸 脱 氧 胆 酸 促 生 长 能 力 + 指 示 乙型副伤寒沙门菌 盐琼脂培养基 三糖铁琼脂培养基 特性 指示能力 乙型副伤寒沙门菌 铜绿假单胞菌
铜 绿 假 单 胞 溴 化 十 六 烷 基 三 甲 铵 促生长能力 菌 琼脂培养基 抑制能力
大肠埃希菌
金 黄 色 葡 萄 甘 露 醇 氯 化 钠 琼 脂 培 促 生 长 能 力 + 指 示 金黄色葡萄球菌 球菌 养基 特性 抑制能力 梭菌 梭菌增菌培养基 哥伦比亚琼脂培养基 白色念珠菌 促生长能力 促生长能力 大肠埃希菌 生孢梭菌 生孢梭菌 白色念珠菌
沙 氏 葡 萄 糖 液 体 培 养 促生长能力 基
沙 氏 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 促 生 长 能 力 + 指 示 白色念珠菌 基 念珠菌显色培养基 特性 促 生 长 能 力 + 指 示 白色念珠菌 能力 抑制能力 液体培养基促生长能力检查 大肠埃希菌
分别接种不大于 100cfu 的试验菌（见表 1）于
被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及不长于规定的 最短培养时间下培养，与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。 固体培养基促生长能力检查 用涂布法分别接种不大于 100cfu 的试验菌 （见
表 1）于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及 不长于规定的最短培养时间下培养，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大 小、形态特征应一致。 培养基抑制能力检查 接种不少于 100cfu 的试验菌（见表 1）于被检培养基
和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及不短于规定的最长培养时 间下培养，试验菌应不得生长。 培养基指示特性检查 用涂布法分别接种不大于 100cfu 的试验菌（见表 1）
于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及不长于 规定的最短培养时间下培养，被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、 指示剂反应情况等应与对照培养基一致。 控制菌检查方法适用性试验 供试液制备 按下列“供试品检查”中的规定制备供试液。 试验菌 根据各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应试验 菌株，确认耐胆盐革兰阴性菌检查方法时,采用大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为试 验菌。 适用性试验 按控制菌检查法取规定量供试液及不大于 100cfu 的试验菌接
入规定的培养基中；采用薄膜过滤法时,取规定量供试液,过滤,冲洗,试验菌应加 在最后一次冲洗液中,过滤后,注入规定的培养基或取出滤膜接入规定的培养基 中。依相应的控制菌检查方法，在规定的温度及最短时间下培养，应能检出所加 试验菌相应的反应特征。 结果判断 上述试验若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查方法进
行供试品检查；若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性（见非无菌产品微生 物检查：微生物计数法（附录×××）中的“抗菌活性的去除或灭活” ） ，并重新 进行方法适用性试验。 如果经过试验确证供试品对试验菌的抗菌作用无法消除， 可认为受抑制的微 生物不可能存在于该供试品中， 选择抑菌成份消除相对彻底的方法进行供试品的 检查。 供试品检查 供试品的控制菌检查应按经方法适用性试验确认的方法进行。 阳性对照试验 阳性对照试验方法同供试品的控制菌检查,对照菌的加量应
不大于 100cfu。阳性对照试验应检出相应的控制菌。 阴性对照试验 以稀释剂代替供试液照相应控制菌检查法检查，阴性对照试
验应无菌生长。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。
耐胆盐革兰阴性菌(Bile-Tolerant Gram-Negative Bacteria) 供试液制备和预培养 取供试品，用胰酪大豆胨液体作为稀释剂照“非无菌
产品微生物限度检查：微生物计数法” （通则 1105）制成 1：10 供试液，混匀， 在 20～25℃培养，培养时间应使供试品中的细菌充分恢复但不增殖（约 2 小时） 。 未检出试验 除另有规定外， 取相当于 1g 或 1mL 供试品的上述预培养物接种至肠道菌增菌 液体培养基中，30～35℃培养 24～48 小时后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂 培养基平板上，30～35℃培养 18～24 小时。如果平板上无菌落生长，判供试品 未检出耐胆盐革兰阴性菌。 定量试验 选择和分离培养 取相当于 0.1g、0.01g 和 0.001g（或 0.1mL、0.01mL 和
0.001mL）供试品的预培养物或其稀释液分别接种至肠道菌增菌液体培养基中， 30～35℃培养 24～48 小时。上述每一培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼 脂培养基平板上，30～35℃培养 18～24 小时。 结果判断 若紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌落生长， 则对应培养管
为阳性，否则为阴性。根据各培养管检查结果，从表 2 查对 1g 或 1ml 供试品中 含有耐胆盐革兰阴性菌的最大可能数。 表2 耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数
各供试品量的检查结果 每 1g(或 1mL)供试品中可能的菌数（N） 0.1g 或 0.1ml ＋ ＋ ＋ － 0.01g 或 ＋ ＋ － － 0.001g 或 ＋ － － － N＞103 102＜N＜103 10＜N＜102 N＜10
注：⑴ ＋代表紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长；－代表紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上 无菌落生长。 ⑵ 若供试品量减少 10 倍 （如 0.01g 或 0.01ml， 0.001g 或 0.001ml， 0.0001g 或 0.0001ml） ， 则每 1g(或 1mL)供试品中可能的菌数（N）应相应增加 10 倍。
大肠埃希菌(Escherichia coli) 供试液制备和增菌培养 取供试品，照“非无菌产品微生物限度检查：微生
物计数法” （通则 1105）制成 1：10 供试液。取相当于 1g 或 1mL 供试品的供试 液，接种至适宜体积（经方法适用性试验确定的）的胰酪大豆胨液体培养基中， 混匀，30～35℃培养 18～24 小时。 选择和分离培养 取上述预培养物 1mL 接种至 100mL 麦康凯液体培养基中，
42～44℃培养 24～48 小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基 平板上，30～35℃培养 18～72 小时。 结果判断 若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适
宜的鉴定试验, 确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生 长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。 沙门菌（Salmonella） 供试液制备和增菌培养 取 10g 或 10mL 供试品直接或处理后接种至适宜体
积（经方法适用性试验确定的）的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培 养 18～24 小时。 选择和分离培养 取上述预培养物 0.1mL 接种至 10mL RV 沙门增菌液体培养
基中，30～35℃培养 18～24 小时。取少量 RV 沙门菌增菌液体培养物划线接种于 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，30～35℃培养 18～48 小时。 沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上生长良好，菌落为淡红色 或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。用接种针挑选疑似菌落于三糖铁琼脂 培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养 18～24 小时，或采用其它适 宜方法进一步鉴定。 结果判断 若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有疑似菌落生长，且
三糖铁琼脂培养基的斜面为红色、底层为黄色，或斜面黄色、底层黄色或黑色， 应进一步进行适宜的鉴定试验, 确证是否为沙门菌。如果平板上没有菌落生长， 或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或三糖铁琼脂培养基的斜面未见红色、底层 未见黄色；或斜面黄色、底层未见黄色黑色，判供试品未检出沙门菌。 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa） 供试液制备和增菌培养 取供试品，照“非无菌产品微生物限度检查：微生
物计数法” （通则 1105）制成 1：10 供试液。取相当于 1g 或 1mL 供试品的供试 液，接种至适宜体积（经方法适用性试验确定的）的胰酪大豆胨液体培养基中， 混匀。30～35℃培养 18～24 小时。 选择和分离培养 取上述预培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培
养基平板上，30～35℃培养 18～72 小时。 取上述平板上生长的菌落进行氧化酶试验， 或采用其它适宜方法进一步鉴定。 氧化酶试验 将洁净滤纸片置于平皿内,用无菌玻棒取上述平板上生长的菌
落涂于滤纸片上，滴加新配制的 1％二盐酸二甲基对苯二胺试液，在 30 秒内若培 养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性,否则为阴性。 结果判断 若溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上有菌落生长，且氧化酶
试验阳性，应进一步进行适宜的鉴定试验, 确证是否为铜绿假单胞菌。如果平板 上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或氧化酶试验阴性，判供 试品未检出铜绿假单胞菌。 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 供试液制备和增菌培养 取供试品，照“非无菌产品微生物限度检查：微生
物计数法” （通则 1105）制成 1：10 供试液。取相当于 1g 或 1mL 供试品的供试 液，接种至适宜体积（经方法适用性试验确定的）的胰酪大豆胨液体培养基中， 混匀。30～35℃培养 18～24 小时。 选择和分离培养 取上述预培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平
板上，30～35℃培养 18～72 小时。 结果判断 若甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上有黄色菌落或外周有黄色环
的白色菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验, 确证是否为金黄色葡萄 球菌；若平板上没有与上述形态特征相符或疑似的菌落生长，或虽有相符或疑似 的菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。 梭菌（Clostridia） 供试液制备和热处理 取供试品，照“非无菌产品微生物限度检查：微生物
计数法” （通则 1105）制成 1：10 供试液。取相当于 1g 或 1mL 供试品的供试液 2 份，其中 1 份置 80℃保温 10 分钟后迅速冷却。 选择和分离培养 将上述 2 份供试液分别接种至适宜体积（经方法适用性试
验确定的）的梭菌增菌培养基中，置厌氧条件下 30～35℃培养 48 小时。取上述 每一培养物少量，分别涂抹接种于哥伦比亚琼脂培养基平板上，置厌氧条件下 30～35℃培养 48～72 小时。 过氧化氢酶试验 取上述平板上生长的菌落，置洁净玻片上，滴加 3%过氧
化氢试液，若菌落表面有气泡产生,为过氧化氢酶试验阳性,否则为阴性。 结果判断 若哥伦比亚琼脂培养基平板上有带或不带芽孢的厌氧杆菌生长，
且过氧化氢酶反应阴性的，应进一步进行适宜的鉴定试验, 确证是否为梭菌；如 果哥伦比亚琼脂培养基平板上没有厌氧杆菌生长，或虽有相符或疑似的菌落生长 但鉴定结果为阴性，或过氧化氢酶反应阳性，判供试品未检出梭菌。 白色念珠菌（Candida albicans） 供试液制备和增菌培养 取供试品，照“非无菌产品微生物限度检查：微生
物计数法” （通则 1105）制成 1：10 供试液。取相当于 1g 或 1mL 供试品的供试 液，接种到 100mL 沙氏葡萄糖液体培养基中，混匀，30～35℃培养 3～5 天。 选择和分离 取上述预培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，
30～35℃培养 24～48 小时。 白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色，偶见淡黄色, 表面光滑有浓酵母气味,培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱 褶。挑取疑似菌落接种至念珠菌显色培养基平板上，培养 24～48 小时（必要时 延长至 72 小时） ，或采用其它适宜方法进一步鉴定。 结果判断 若沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上有疑似菌落生长，且疑似菌在念
珠菌显色培养基平板上生长的菌落阳性反应，应进一步进行适宜的鉴定试验, 确 证是否为白色念珠菌；若沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌 落生长但鉴定结果为阴性，或疑似菌在念珠菌显色培养基平板上生长的菌落呈阴 性反应，判供试品未检出白色念珠菌。 稀释液 稀释液配制后,应采用验证合格的灭菌程序灭菌。 1. pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 照无菌检查法（通则 1101)制备。
2. pH6.8 无菌磷酸盐缓冲液、pH7.2 无菌磷酸盐缓冲液 、pH7.6 无菌磷酸 盐缓冲液按缓冲液 照缓冲液（通则 8004）配制后,过滤,分装,灭菌。
如需要,可在上述稀释液灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。 3. 0.9%无菌氯化钠溶液 灭菌。 培养基及其制备方法 培养基可按以下处方制备,也可使用按该处方生产的符合要求的脱水培养 基。配制后,应按验证过的高压灭菌程序灭菌。 1.胰酪大豆胨液体培养基（TSB） 、胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)、沙氏葡萄 糖液体培养基(SDB) 照无菌检查法（通则 1101)制备。 取氯化钠 9.0g,加水溶解使成 1000ml， 过滤， 分装，
2、沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA) 照无菌检查法（通则 1101)制备。如使用含抗生素的沙氏葡萄糖琼脂培养基， 应确认培养基中所加的抗生素量不影响检品中霉菌和酵母菌的生长。 3、 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA） 马铃薯(去皮) 葡萄糖 200g 20.0g 琼脂 纯化水 14.0g 1000mL
取马铃薯，切成小块，加水 1000mL，煮沸 20-30min，用 6-8 层纱布过滤， 取滤液补水至 1000ml，调节 pH 值使灭菌后在 25℃的 pH 值为 5.6±0.2，加入琼 脂,加热溶化后, 再加入葡萄糖，摇匀，分装，灭菌。 4.玫瑰红钠琼脂培养基培养基 胨 葡萄糖 磷酸二氢钾 硫酸镁 5.0g 10.0g 1.0g 0.5g 玫瑰红钠 琼脂 纯化水 0.0133g 14.0g 1000ml
除葡萄糖、 玫瑰红钠外,取上述成分,混合,微温溶解， 加入葡萄糖、 玫瑰红钠, 摇匀，分装，灭菌。 5、硫乙醇酸盐流体培养基 6、肠道菌增菌液体培养基 明胶胰酶水解物 牛胆盐 葡萄糖 10.0g 20.0g 5.0g 二水合磷酸氢二钠 亮绿 纯化水 8.0g 15mg 1000mL 照无菌检查法（通则 1101）制备
磷酸二氢钾
2.0g
除葡萄糖、亮绿外,取上述成分,混合,微温溶解，调节 pH 值使加热后在 25℃ 的 pH 值为 7.2±0.2，加入葡萄糖、亮绿，加热至 100℃ 30 分钟，立即冷却。 7、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基 酵母浸出粉 明胶胰酶水解物 脱氧胆酸钠 葡萄糖 氯化钠 3.0g 7.0g 1.5g 10.0g 5.0g 中性红 结晶紫 琼脂 纯化水 30mg 2mg 15.0g 1000mL
除葡萄糖、中性红、结晶紫、琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解，调节 pH 使加热后在 25℃的 pH 值为 7.4±0.2。加入葡萄糖、中性红、结晶紫、琼脂，加 热煮沸（不能在高压灭菌器中加热） 。 8、麦康凯液体培养基 明胶胰酶水解物 乳糖 牛胆盐 20.0g 10.0g 5.0g 溴甲酚紫 纯化水 10mg 1000mL
除乳糖、溴甲酚紫外，取上述成分，混合，微温溶解，调节 pH 值使灭菌后在 25℃的 pH 值为 7.3±0.2，加入乳糖、溴甲酚紫，分装，灭菌。 9、麦康凯琼脂培养基 明胶胰酶水解物 胨（肉或酪蛋白） 乳糖 脱氧胆酸钠 氯化钠 17.0g 3.0g 10.0g 1.5g 5.0g 中性红 结晶紫 琼脂 纯化水 30.0mg 1mg 13.5g 1000mL
除乳糖、中性红、结晶紫、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节 pH 值使灭菌后在 25℃的 pH 值为 7.1±0.2，加入乳糖、中性红、结晶紫、琼脂，加 热煮沸 1 分钟，并不断振摇，分装，灭菌。 10、RV 沙门菌增菌液体培养基 大豆胨 4.5g 六水合氯化镁 29.0g
氯化钠 磷酸氢二钾 磷酸二氢钾
8.0g 0.4g 0.6g
孔雀绿 纯化水
36mg 1000mL
除孔雀绿外，取上述成分，混合，微温溶解，调节 pH 值使灭菌后在 25℃的 pH 值为 5.2±0.2。加入孔雀绿，分装，灭菌,灭菌温度不能超过 115℃。 11、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基 酵母浸出粉 L-赖氨酸 木糖 乳糖 蔗糖 脱氧胆酸钠 3.0g 5.0g 3.5g 7.5g 7.5g 2.5g 氯化钠 硫代硫酸钠 枸橼酸铁铵 酚红 琼脂 纯化水 5.0g 6.8g 0.8g 80mg 13.5g 1000mL
除三种糖、酚红、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解,调节 pH 值使加热 后在 25℃的 pH 值为 7.4±0.2， 加入三种糖、 酚红、 琼脂， 加热至沸腾， 冷至 50℃ 倾注平皿（不能在高压灭菌器中加热） 。 12.三糖铁琼脂培养基（TSI） 胨 牛肉浸出粉 乳糖 蔗糖 葡萄糖 氯化钠 20.0g 5.0g 10.0g 10.0g 1.0g 5.0g 硫酸亚铁 硫代硫酸钠 0.2%酚磺酞指示液 琼脂 纯化水 0.2g 0.2g 12.5ml 12.0g 1000ml
除三种糖、0.2%酚磺酞指示液、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解, 调 节 pH 值使灭菌后在 25℃的 pH 值为 7.3±0.1，加入琼脂，加热溶化后，再加入 其余各成分，摇匀，分装，灭菌，制成高底层（2～3cm）短斜面。 13、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基 明胶胰酶水解物 氯化镁 硫酸钾 20.0g 1.4g 10.0g 甘油 琼脂 溴化十六烷基三甲铵 10mL 13.6g 0.3g
无菌检查方法学验证 1. 概述 将规定量的供试品按无菌检查法中的薄膜过滤法进行操作,并接种小于100cfu 的试验菌,同时设置阳性对照,按规定温度培养3~5 天,与各相应的阳性对照管比较: 如含供试品各管中的试验菌均生长良好,则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用,可按此法进行供试品的无菌检查;如含供试品的任一管中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长,则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用,应采用增加冲洗量或使用中和剂等方法消除供试品的抑菌作用,并再重新进行验证试验。 2. 验证前提条件 供试品的选择原则:相同配方,不同规格的制品,选择其中装量最大的制品进行验证。种类相同,含量不同的制品,选择含量最高的制品进行验证。照此原则,多规格制 品按下表选择供试品进行验证。 3. 验证方法 3.1菌液制备 3.1.1细菌菌液制备程序 ①取金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌的冻干菌种管各一支，分别在无菌操作下打开,以毛细吸管加入适量营养肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后，吸出滴入营养琼脂斜面上,使均匀分布，置30~35C培养18h~24h。用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于营养琼脂培养基斜面上，于30~35C培养18h~24h o 同法操作,培养得第3代培养物。 ②取生抱梭菌的冻干菌种管一支,在无菌操作下打开,以毛细吸管加入适量营养 肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后,吸出滴入胃酶肉肝疱斜面上,使均匀分布,置30~35C培养18h~24h o用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于胃酶肉肝疱斜
面上，于30~ 35°C培养18h~24h。取生抱梭菌的第二代新鲜培养物至硫乙醇酸盐流 体培养基中,30~35C培养18h~24h,得第3代培养物。 ③分别取金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌的第3代营养琼脂斜面新鲜培养物，用5.0ml吸管吸取3.0ml~5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中,用电动混合器混合20s或在手掌上振敲80次,以使细菌悬浮均匀,得初步菌悬液。 ④取初步制成的上述菌悬液和生抱梭菌第3代新鲜培养物,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至不高于标准比浊管的浓度，即得每1ml含菌数小于100cfu验证细菌菌液。 3.1.2抱子悬液制备程序 ①取白色念珠菌和黑曲霉的冻干菌种管各一支,分别在无菌操作下打开,以毛细 吸管加入适量营养肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后,吸出滴入改良马丁琼脂斜面上，使均匀分布，置23~28C培养5~7天。用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于改良马丁琼脂斜面上,同上述条件培养得第2代培养物。取第2代培养物,同法操作,得第3代培养物。 ②用5.0ml吸管吸取3.0ml~5.0ml0.9%无菌氯化钠溶液加入上述第三代新鲜斜 面试管内,反复吹吸,洗脱抱子,用管口带有薄的无菌棉花或纱布的毛细吸管吸出抱子悬液至无菌试管内,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至不高于标准比浊管的浓度,即得每1ml含菌数小于100cfu验证抱子悬液。 3.2 薄膜过滤 3.2.1 供试品试验组 取规定量供试品,按《无菌检查标准操作细则》薄膜过滤后,如为不含防腐剂供试品，则往其中一只滤筒内接入100ml改良马丁培养基，往另一只滤筒内各接入100ml 的硫乙醇酸盐流体培养基,用5ml灭菌注射器抽取1ml验证菌液，从集菌培养器胶管处注入培养基中;如为含防腐剂供试品,则待供试品过滤完后,连续 3 次用
附录ⅩⅢJ 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法 控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料是否符合相应的微生物限度标准时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。 本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。 供试液制备及实验环境要求同“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”（附录×××）。 如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物无毒性。 供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。 培养基适用性检查和方法适用性试验 供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。 供试品的控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。 若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，控制菌检查方法应重新进行适用性试验。 菌种及菌液制备 菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC（B）26 003〕 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC（B）10 104〕 大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC（B）44 102〕 乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)〔CMCC（B）50 094〕
消毒剂除菌过滤后检验方法验证方案
目录 1.0 概述 (3) 1.1 目的 (3) 1.2 范围 (3) 1.3 职责 (3) 2.0 可接受标准 (4) 3.0 确认前条件 (4) 1.1 人员确认 (4) 1.2 文件确认 (5) 4.0 文件记录要求 (5) 5.0 程序 (5) 5.1 仪器的确认 (5) 5.2 菌株、培养基及试剂 (5) 5.3 验证步骤 (7) 5.4 验证总结 (9) 6.0 再确认 (9) 7.0 偏差 (9) 8.0 变更 (10) 9.0 术语 (10) 10.0 参考文件 (10) 11.0 修订历史 (10) 12.0 附录列表 (10)
1.0概述 1.1目的 2010版GMP附录无菌第九章第四十四条A/B级洁净区应当使用无菌的或经无菌处理的消毒剂和清洁剂。本公司在A/B级洁净区使用的消毒剂有75%乙醇、过氧乙酸消毒液PAA，清洁剂为注射用水。 按2010版GMP第七章第一百四十条规定对该除菌方式进行验证。 1.2范围 本确认方案时应用于江苏复旦复华药业有限公司消毒剂除菌过滤后检验方法验证工作。 1.3职责 1.3.1QC检验员职责 QC检验员，同时作为验证实施部门，职责如下： 1.3.1.1起草验证草案，完成验证报告； 1.3.1.2负责对相关人员进行培训，确保验证工作按方案进行； 1.3.1.3负责本方案的实施，验证数据的收集及数据分析； 1.3.1.4协调进行验证中可能出现的偏差的调查、完成变更的书面记 录、完成验证报告； 1.3.1.5负责向QC部门经理及时报告验证中出现的问题。 1.3.2QC部门经理职责 1.3. 2.1QC经理审核本验证方案与验证报告； 1.3. 2.2负责指导验证中发生的偏差的调查及审核验证期间发生的 偏差； 1.3. 2.3负责安排具有资格的操作人员开展验证工作； 1.3. 2.4负责验证过程中的监督与指导等其它工作。 1.3.3QA职责 1.3.3.1负责确认工作实施的监督； 1.3.3.2协调进行验证中可能出现的偏差的调查、完成变更的书面记 录； 1.3.3.3为制定和实施本验证方案提供相关程序等必要文件、技术支 持；
浙江红雨医药用品有限公司 无菌检验方法 验证方案 验证方案申请人: 日期: 年月日验证方案审核人: 日期: 年月日验证方案审批人: 日期: 年月日
1. 概述： 无菌检查法是为了检查药典要求无菌的医疗器械产品是否无菌而建立的检查法，是作为批准无菌产品放行的检验或监督部门对无菌产品质量监督中的一个重要项目。它是根据用于实验的培养基中是否有微生物生长来判定样品的无菌性，液体培养基变浑浊一般表明样品受微生物的污染。基于微生物污染的不均匀性，使无菌检查法结果的可信度受许多因素制约，如抑菌因素、检查法、检验量、检查用的培养基质量、操作环境、无菌技术等。检验方法的验证是现代质量保证体系中关系到质控技术、方法、手段的科学性、准确性的重要组成部分，是保证检验结果的公正、科学、准确的基础。 2. 验证目的： 验证所采用的方法和条件是否适合于供试品的无菌检查。即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不计。 3. 验证范围： 适用于创可贴无菌检查法的验证。 4.验证人员及职责 5. 文件准备和培训 检查验证所需的各类文件资料，应齐全；相关的文件草案是否已具备。 6. 验证条件 6.1. 仪表量器经过校验合格，且在有效期内。 6.2. 供试品：随机抽取浙江红雨医药有司生产的3个批次医用无菌创可贴
6.3. 培养基及试剂： 6.3.1. 试剂试液： 0.9%氯化钠、氯化钠—蛋白胨缓冲液，配制记录见附件1 6.3.2. 培养基 硫乙醇酸盐流体培养基生产厂家：杭州微生物试剂有限公司批号：20140221-00 改良马丁培养基生产厂家：杭州微生物试剂有限公司批号：20131118-00 营养琼脂培养基生产厂家：杭州微生物试剂有限公司批号：20150428-03 改良马丁琼脂培养基生产厂家：杭州微生物试剂有限公司批号：20140322-00 蛋白胨生产厂家：杭州微生物试剂有限公司批号：20140417-00 培养基配制记录见附件2。 6.4. 验证用菌株： 金黄色葡萄球菌【CMCC（B）26003】 铜绿假单胞菌【CMCC（B）10104】 枯草芽孢杆菌【CMCC（B）63501】 生孢梭菌【CMCC（B）64941】 白色念珠菌【CMCC（F）98001】 黑曲霉【CMCC（F）98003】 标准菌株购自：浙江省食品药品检验研究中心 各验证用菌种传代记录见附件3。 6.5. 无菌检验仪器及相关设备： 压力蒸汽灭菌器 型号：YXQ-LS-50S11 生产厂家：上海博讯仪器有限公司 校验日期：2015-05-25 有效期：2016-05-24 生化培养箱（细菌培养） 型号：SPX-250 生产厂家：金坛市富华仪器有限公司 校验日期：2015-05-25 有效期：2016-05-24 生化培养箱（霉菌培养） 型号：SPX-250B 生产厂家：金坛市富华仪器有限公司 校验日期：2015-05-25 有效期：2016-05-24
类别：编号: 部门：页码: 无菌检验方法验证 版次：□新订口替代: ________________ 制定人: ___________________ ____________ H H 日审批会签: _____________________________________________
1.1 确认所用的检查方法适用于一次性活检钳的无菌检查。 1.2 确认检查结果的准确性、可靠性、重复性和可操作性及检查方法的完整 性。 2. 验证范围 适用于我公司生产的一次性活检钳无菌检验。 3. 检验依据 《中国药典》附录无菌检查法 ISO11737-2: 医疗器械的灭菌微生物学方法第一部分: 确认灭菌过程的无菌试验 GB/T14233.2- 医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分: 生物学试验方法 4. 验证器材 4.1 检验环境: 无菌检查应在环境洁净度10000 级下的局部100 级的单向流空气 区域内进行操作。 4.2 设备: 医用净化工作台、生物安全柜、无菌检查膜过滤器、电动吸引器、 电热干燥箱、霉菌培养箱、数显生化培养箱、压力蒸汽灭菌器、电子天平、pH 计、冰箱、恒温水浴锅、显微镜等。 4.3 培养基及稀释液: 硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、pH7.0 氯化钠- 蛋白胨缓冲液、0.1% 蛋白胨水溶液、营养琼脂。 4.4其它实验材料：微孔滤膜（孔径w 0.45um,直径约50mm）、无菌过滤杯、无 菌剪刀、无菌镊子、无菌钳子、无菌手套、吸管（1ml和10ml）、酒精灯、三角烧瓶、接种环、培养皿。
5.1 原理: 活检钳的形状为不溶物, 为微生物转移更彻底, 特选用无菌检查法中的 薄膜过滤法。 5.2 设备器材: 验证中所用器材、设备已经过国家计量单位鉴定合格并有鉴定证书。 5.3 培养基: 验证中所用培养基以经过培养基灵敏度实验检测合格。 5.4 操作步骤: 5.4.1 供试品的取样按照GB/T 2828.1- 相关规定进行逐批取样。 5.4.2 将所需物品, 供试品表面消毒, 经过传递窗, 紫外线照射半小时. 无菌室紫 外线消毒半小时。 5.4.3 操作人员用洗手液、自来水清洗双手, 关闭紫外灯, 换拖鞋, 脱外衣放入衣 柜, 穿洁净白大衣, 进入缓冲间, 再用洗手液、纯化水清洗双手, 用75% 乙醇对手进行消毒, 穿戴无菌衣、帽、口罩、手套等。 5.4.4 进入菌检室, 打开医用洁净工作台风机, 运行至少15分钟以上。 5.4.5 将所需物品由传递窗取出, 两只消毒液桶分别放置于菌检洁净工作台一侧, 其余物品放置于传递窗一侧的方形桌上, 剥去牛皮纸外包装。 5.4.6 医用洁净工作台内点燃酒精灯。打开3个养琼脂平板, 置于医用洁净工作 台的不同位置。 5.4.7 取供试品, 在医用洁净工作台内, 打开包装袋, 小心将供试品取出, 将其剪成 约10cm的小段，浸入500ml 0.1%无菌蛋白胨水溶液中，充分振摇作为供 试液。 5.4.8 将供试液平均转入三个薄膜过滤器的滤杯中, 开启电动吸引器开关进 行过滤，用pH7.0蛋白胨-氯化钠缓冲液每次100ml冲洗滤膜三次，用平口镊子夹取滤膜（过程保持滤膜的完整性） , 一张转移到100ml 改
控制菌检查 控制菌检查用的培养基应进行培养基的适应性检查，成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配置的培养基均应检查。 菌种试验用菌种的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102或CVCC1570] 金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）[CMCC(B)26003或CVCC1882] 乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphiB）[CMCC(B)50094] 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104] 生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(B)64941] 白色念珠球菌（canidia albicans）[CMCC(F)98001] 菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基上，生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18～24小时；接种白色念珠球菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，培养18～24小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu的菌悬液。 菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。 适应性检查控制菌检查用培养基的适应性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示能力的检查。
液体培养基促生长能力检查分别接种不大于100cfu的试验菌（表1）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。 固体培养基促生长能力检查取试验菌各0.1ml（含菌数50～100cfu）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。被检培养基和对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。 培养基抑制能力检查接种不少于100cfu的试验菌（表1）于被检培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度计最长时间下培养，试验菌应不得生长。 固体培养基指示能力检查取试验菌各0.1ml（含菌数50～100cfu）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度培养时间下培养。被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。 液体培养基指示能力检查分别接种不大于100cfu的试验菌（表1）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌生长情况、指示剂反应等应与对照培养基一致。 控制菌检查方法的验证 当建立兽药的微生物限度检查法时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该兽药的控制菌检查。若兽药的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检查方法应重新验证。 验证时，依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株，验证大肠菌群检查
控制菌检查培养基适用性检查记录 一、菌液制备（需要的菌种在□内划“√”）： □（1）大肠埃希菌新鲜肉汤培养物1ml ，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（2）金黄色葡萄球菌新鲜肉汤培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（3）乙型副伤寒沙门菌新鲜肉汤培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（4）铜绿假单胞菌新鲜肉汤培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（5）生孢梭菌新鲜硫乙醇酸盐流体培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； 二、每ml菌液含菌量的计数测定。 测定方法：取稀释后的菌液1ml（剩余的菌液冷藏保存）,置直径90mm的无菌平皿中，注入15-20ml已经过适用性检查确正的温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基（细菌类别计数选用该培养基）或玫瑰红钠琼脂培养基（霉菌、酵母菌类别计数选用该培养基），混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。细菌类别培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌类别培养温度为23℃～28℃。细菌类别培养3天，霉菌、酵母菌类别培养5天。 三、检查结果：需做的检查在□内划“√”。 □ 1. 增菌培养基促生长能力检查
分别接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌。 检验标准：与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。 结论： □ 2. 固体培养基促生长能力检查 检验标准：被检培养基的菌落数与对照培养基菌落数相比大于70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。判该培养基的适用性检查符合规定。 结论： □ 3. 培养基抑制能力检查 分别接种试验菌于被检培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养，试验菌。 检验标准：试验菌应不得生长。 结论： □ 4. 培养基指示能力检查 分别接种少量试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养。被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等。 检验标准：被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。 结论： 结论： 检验人：复核人：
GMP管理文件 一、目的：为使控制菌检查的操作规范化、制度化，故建立此规程 二、适用范围：控制菌检查必须按本规程执行。 三、责任者：微生物限度检查化验员，质量检测中心主任。 四、正文： 1、控制菌检查方法适应性试验 1、1 供试液的制备 取样品10g，用胰酪大豆胨液体培养基（TSB），作为稀释液制成1：10供试液，混匀，在20～25℃培养 ,培养时间应使供试品中的细菌充分恢复但不增殖（约2小时）。 试验菌 大肠埃希菌和铜绿假单胞菌 适用性试验 取相当于1mL供试品的上述预培养物及不大于100cfu的大肠埃希菌和铜绿假单胞菌分别接种至适宜体积肠道菌增菌液体培养基中，30～35℃培养24小时后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，30～35℃培养18小时。应能分别检出所加大肠埃希菌和铜绿假单胞菌相应的反应特征. 结果判断 上述试验若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查；若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性，并重新进行 方法适用性试验。
耐胆盐革兰氏阴性菌的检查 供试液的制备和预培养：取样品10g，用胰酪大豆胨肉汤琼培养基（TSB），作为稀释液制成1：10供试液，混匀，在20～25℃培养 ,培养时间应使供试品中的细菌充分恢复但不增殖（约2小时） 定性试验： 除另有规定外，取相当于1g或ml供试品的预培养物接种至适应体积（经方法适用性试验确定）肠道增菌液培养基中，30～35℃培养24～48小时后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基的平板上，30～35℃培养18～24小时。 判断结果：如果平板上无菌生长，判供试品未检出耐胆盐革兰氏阴性菌。 定量检查： 选择和分离培养：取相当于、和（或、、）供试品的预培养物或其稀释剂分别接种至适应体积（经方法适用性试验确定）肠道增菌液体培养基中，30～35℃培养24～48小时后，上述每一培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基的平板上，30～35℃培养18～24小时。 判断结果：若紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌落生长，则对应培养管为阳性，否则为阴性。
微生物限度检查方法验证方案 1.目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2.范围： 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3.规范性引用文件： 根据《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ J 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4.验证实施： 4.4.1 试验前的准备: 4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3天内使用。 4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。 4.4.2 试验菌的制备和稀释：
微生物控制菌检查方法(薄膜过滤法) 验证方案
微生物控制菌检查方法(薄膜过滤法) 验证方案 编码：表 一、验证方案的起草与批准 1.验证方案起草 起草人：起草时期：年月日 2.验证小组成员： 3.验证方案审核 4.验证方案批准 批准人：批准日期： 二、验证方案 1.验证目的和原理 1.1验证目的 本实验是关于的微生物控制菌检查试验的验证。验证结果应显示的微生物控制菌试验方法，对检品中可能存在的微生物没有抑制作用，符合验证要求。 1.2原理 按照已建立的药品微生物控制菌检查方法，通过已知菌数试液的对照菌的培训对照，验证其操作方法适合该药品的微生物控制菌的检测的正确性。 2.验证方法步骤 2.1验证前的准备：将所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。试验菌应选择相应的阴性对照菌。 2.2验证试验的操作计划：用3个不同批号产品按照微生物控制菌检测方法进行平行试验，通过观测是
否长菌来判断。 2.3试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物控制菌检查试验对检品中微生物的抑菌性。试验结果应显示；阴性菌对照组不得检出阴性对照菌，试验组应检出试验菌。 3.试验实施 3.1试验前的准备 3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。 3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于5pa。 3.1.3试验样品： 批号：批号：批号： 3.1.4培养基： 3.1.5稀释液：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。 3.1.6验证用微生物名称及其编号 实验菌株的来源： 编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。 3.1.7器具：无菌薄膜过滤器：（孔径0.45um直径50mm）、无菌培养皿（直径90mm）、无菌移液管（5ml） 4.验证方法 4.1试验菌种的制备和稀释 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至相应的营养肉汤或BL增菌液10ml中,30～35℃培养18～24小时。用无菌0.9%氯化钠溶液将上述培养物进行倍比递增稀释，制成每1ml含菌落数为50～100cfu的菌悬液。
一次性使用无菌医疗器械无菌试验 方法验证方案 编制：日期： 审核：日期： 批准：日期：
1.验证目的 通过实验验证检测方法的适用性及培养基的适用性、无菌性、灵敏度。 2.样品信息 3.实验设备及器材 3.1使用仪器及器具：大试管、灭菌锅、洁净工作台、生物安全柜、电子天平、电热恒温培养箱、霉菌培养箱。 3.2使用材料及菌种：硫乙醇酸盐液体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌、生饱梭菌、白色念珠菌、大肠埃希菌。 4.验证组成员及职责 姓名部门职责 品质部组长：负责验证方案的审核、核准并负责验证报告的核准 品质部负责验证方案、验证报告的起草并组织实施 品质部负责验证过程中现场的监控及验证实施和试验过程的操作 5.验证依据 《中国药典》2015版和GB/14233.2-2005 6.验证步骤 6.1检测设备计量有效性验证 确认以下设备经过校量并在有效期内 设备名称是否校验是否在有效期内备注 灭菌锅 洁净工作台 生物安全柜 电子天平
电热恒温箱 霉菌培养箱 确认人/日期：审核/日期： 6.2培养基适用性检查 6.2.1无菌性检查：取每种每批培养基5支（瓶），培养14天，应无菌生长。检查结果见表1。 表1
6.2.2灵敏度检查 6.2.2.1菌液制备方法描述 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体或者胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生胞梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃-35℃培养18-24小时，接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基或者沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20℃-25℃培养24-48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20℃-25℃培养5-7天，加入3-5ml含0.5%（ml/ml）聚山梨酯80无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。 菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2℃-8℃，可在24小时内使用。 6.2.2.2培养基接种 取每管将量为12ml的硫乙醇酸盐液体培养基7支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生饱梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的胰酪大豆胨液体培养基7支，分别接种小于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。 6.2.2.3结果判断，空白对照应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该批培养基的灵敏度检查符合规定。 6.2.2.4试验结果见表2 表2 培养基试验液是否长菌菌生长情况培养条件判定 硫乙醇酸盐流体培养基金黄色葡萄球 菌1ml 1. 30℃-35℃培 养3天 2. 铜绿假单胞菌 1ml 1. 2. 生饱杆菌1ml 1. 2. 空白对照 胰酪大豆胨枯草芽孢杆菌 1.20℃-25℃培
非无菌药品微生物限度检查中控制菌检查及原理 一、大肠埃希菌 1.菌体特性 大肠埃希菌属于肠杆菌科埃希菌属，菌体细胞 两端钝圆，为革兰染色阴性无芽孢杆菌，细胞大小为 1.1～1.5×2～6.0 μm。 周身鞭毛、运动或不运动。能形成荚膜和微荚膜。 最适生长温度37℃，可在15～46℃生长。最适pH 为7.4～7.6。在营养肉汤培养基中，37℃培养24 小时后，形成菌膜，管底粘液状沉淀，培养物有粪臭 味。 在伊红美兰琼脂（EMB）平板上，典型的菌落 呈紫黑色，有金属光泽，菌落扁平，低度凸起，光 滑湿润。也有呈粉红色、无金属光泽、中心紫色的 菌落。 在麦康凯琼脂（MaCC）平板上，菌落扁平、圆形、光滑湿润。呈桃红色、微红色或菌落中 心桃红色。 2. 生化实验原理 （1）MUG试验 97％的大肠埃希菌含有β—葡萄糖醛苷酶，可分解4 —甲基伞形酮β－D－葡萄糖苷酸，生成的4—甲基伞形 酮在366nm紫外灯下产生蓝白色荧光。
（2）靛基质试验（I实验) 有些细菌具有色氨酸酶，在蛋白胨水培养基中生长时，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛 基质（吲哚）。靛基质无色，不能直接观察，加入靛基质试 液（对二甲氨基苯甲醛试液），产成红色的玫瑰靛基质。 色氨酸酶活性的最适pH为7.4～7.8。pH降低，靛基质产生减少，可能出现假阴性或弱阳性反应，故培养基pH应为7.4～7.6 。因产生靛基质的细菌都能发酵糖类而产酸，增加培养基的酸度，不宜用含葡萄糖的培养基进行此试验。 （3）甲基红试验（M） 肠杆菌科细菌均可发酵葡萄糖产生酸性代谢产物，使培养基pH值下降，最初可使甲基红指示液［变色域pH4.5－5.4（红→黄）］变色而呈现阳性反应。但继续培养后，产气杆菌能将两分子的丙酮酸脱羧生成一分子的中性乙酰甲基甲醇而使培养基pH值上升至5.4以上，使甲基红指示液变为桔黄色（甲基红试验阴性）。而大肠埃希菌则继续产生大量的酸，如甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸等，保持高氢离子浓度，故甲基红试验为阳性反应。 2CH3COCOOH→2CO2+CH3CO〃CHOHCH3 丙酮酸乙酰甲基甲醇 （4）乙酰甲基甲醇生成试验(V－P) 此项实验主要用于鉴别大肠埃希菌和产气杆菌这两种细菌在分解葡萄糖后的进一步反应。大肠埃希菌于产生丙酮酸后，丙酮酸进一步分解形成甲酸、乙酸、乳酸等。产气杆菌可使丙酮酸脱羧变为中性的乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性环境下被空气中的氧气氧化成二乙酰（丁二
XXX无菌检验方法学验证方案 编号：VP.SV.039.00
目录 验证方案的审批 验证小组名单 验证实施进度 技术性文件 引言 1．概述 2．验证目的 3．职责 无菌检查方法学的确认 再验证周期
验证方案审批
验证小组名单 验证实施进度 技术性文件
引言 1.概述 1.1根据2010版《中华人民共和国药典》二部附录ⅪH规定，当建立药品的无菌检查方 法时，需进行方法学的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的检测。当药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检测方法应重新验证。 2.验证目的： 2.1根据2010版《中华人民共和国药典》二部附录ⅪH无菌检查方法要求，通过试验， 寻找合适的材料、条件和方法，最终确定氧氟沙星滴眼液的检验方法，并将其定为日常检测的正式方法。 3.职责 3.1验证办 3.1.1负责验证方案的审批。 3.1.2负责验证的协调工作，以保证验证方案规定项目的顺利实施。 3.1.3负责验证数据及结果的审核。 3.1.4负责验证报告的审核。 3.1.5负责再验证周期的确认。 3.2质量监控部 3.2.1负责验证所需的标准品、样品、试剂、试液等的准备。 3.2.2负责仪器、仪表、量具的校正。 3.2.3负责取样及样品检验。 3.2.4负责收集各项验证、试验记录，对结果进行分析，起草验证报告，报验证办。 3.2.5负责拟订验证方案。 3.2.6负责组织试验所需设备。 3.2.7负责按照验证方案里各项操作步骤进行操作。 3.2.8负责保证设备的正常运转。
无菌检查方法学的确认 1.验证环境、设备及实验前准备： 1.1无菌室内（无菌检查应在环境洁净度B级下的局部洁净度A级的单向流空气区域或 隔离操作器内完成。由QA人员定期按国家相关要求进行环境监控。 1.2仪器和设备：①GSP-9080MBE型隔水式电热恒温培养箱（上海博迅实业有限公司医疗 设备厂）；②生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；③AL204型电子天（梅 特勒—托利多仪器有限公司）；④GZX-9070MBE型电热恒温鼓风干燥箱（上海博迅实 业有限公司医疗设备厂）；⑤YXQ-LS-50SI型高压蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公 司医疗设备厂）；⑥HTY-2000A集菌仪、全封闭集菌培养器可重复使用集菌培养器（杭 州高得·泰林医疗器械有限公司）；⑦超净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备 厂)；。⑧微孔滤膜（孔径0.45μm直径50mm）… 1.3供试品： 1.4所需培养基： 1.4.1硫乙醇酸盐流体培养基（细菌培养）；批号：050104；灵敏度：应符合定 厂家：北京三药科技开发公司； 改良马丁培养基（真菌培养）；批号：050106 ；灵敏度：应符合规定 厂家：北京三药科技开发公司； 营养琼脂培养基（分离单个菌落及传菌种）；厂家：北京三药科技开发公司； 改良马丁琼脂培养基（培养真菌及传菌种）；厂家：北京三药科技开发公司； 1.5稀释液、缓冲液： 0.9%氯化钠溶液；PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 (配制方法参照chp2005附录—90页) 1.6验证用菌种：金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]；大肠埃希菌[CMCC（B）44 102] 生孢梭菌[CMCC（B）64 941]；枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]；黑曲霉[CMCC（F） 98 003]；白色念珠菌[CMCC（F）98 001]。（以上菌种均由湖北省药品检验所提供）1.7培养基的无菌检查：培养基配制好并采取验证合格的灭菌程序灭菌后随机取 5瓶 (管)，培养 14 天，结果应无菌生长。 2.方法学验证: 2.1简要方法说明：本品为喹诺酮类抗生素，通过抑制细菌的DNA旋转酶和DNA复制而发
无菌检查方法的验证 无菌检查方法是为了检查药典要求无菌的制剂及其他制品是否无菌而建立的试验方法，是作为无菌产品批放行的重要依据及药监部门对无菌产品质量监管的一个重要项目。因此如何确保无菌检查方法的准确可靠至关重要，而检查方法的验证是保证检查结果的公正、科学和准确的基础，因此各个主要国家的GMP或药典都对无菌检查方法的验证提出了严格的要求，2010版中国药典对分析方法验证和检查的要求也有大幅度的提高，同时也是GMP检查中检查的重点和容易发现问题的区域。 验证要求与方法 无菌检查方法验证一般分为前验证和再验证两种。 前验证，也称预验证，指在无菌分析方法正式使用前，按照预定验证方案进行的验证。如果没有充分的理由，任何检查方法必须进行前验证。 再验证，指某一检查方法经过验证并在使用一段时间后进行的，旨在证实已验证状态没有发生飘移而进行的重新验证及对检查方法进行修订、改变时进行的验证。 通常一个无菌产品的检查流程为：首先基于产品的剂型、溶解度等性质，按照药典的要求确定是否需要进行前处理;然后根据产品的特性是否有抑菌性，确定是否需要增加去除产品抑菌性的方法;最后验证整个检查方法中用到的一切及试验过程中的每一个环节包括样品的预处理方式、检查过程、培养条件等均不影响样品中微生物的生长。 这里，验证的重点环节包括： 前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应是验证的重点。 供试品中抑菌活性的去除是当前验证工作的重点，尤其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。 具体的验证方法如下： 菌种的选择 无菌检查方法验证中通常选择以下6种试验中常用的控制菌的标准菌株，它们分别代表不同类型的菌种：枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501]代表药品中常见的污染菌——芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]代表革兰阳性菌、生孢梭菌[CMCC(B)64 941]代表厌氧菌、大肠埃希菌[CMCC(B)44 102]代表革兰阴性菌、白色念珠菌[CMCC(F)98 001]代表酵母菌、黑曲霉菌[CMCC(F)98 003]代表霉菌。 菌液的制备 接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35 ℃培养18~24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，
人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 下表用于记录修订/变更主要内容及历史。
目录 1. 概述 2. 验证目的和范围 3. 组织及职责 4. 验证进度计划表 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认 7.验证项目和验证方法 7.1试验菌株 7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备 7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 8.偏差与漏项控制 9.验证报告会审
1. 概述 我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照《中国药典》2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。 人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。 本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。 2. 验证目的和范围 验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。 3.组织及职责 3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准 验证方案由质量部QC组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。验证方案实施完成后，由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负责人批准报告。 3.2验证方案的培训 验证方案在经质量负责人批准后，，由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作，并将该次的培训记录归档。 3.3验证方案实施过程中的变更和偏差 验证方案实施过程中如有变更和偏差，质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施。 3.4 验证工作小组成员表 4. 验证进度计划表 本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是2015年12月至2016年1月。 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 5.1.主要检验仪器设备确认表
编号：FAL-YZ-003.1 无菌检查方法 验证报告 科技发展
目录
无菌检查方法验证报告 1.目的 通过对培养基无菌性检查、灵敏度检查，对产品的无菌检查方法适用性进行试验，证明该方法适用于产品无菌检查日常检测。 2.围 适用于本公司产品的无菌检查方法的建立和确认。 3．依据 中国药典（2015年版） GB/T14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学实验方法 4. 职责权限 5. 验证方法 实验前的准备 a仪器设备
b操作环境 微生物限度检查应在环境洁净度10000 级下的局部洁净度100 级的单向流空气区域进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。 c稀释液和试剂： PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 d器具无菌注射器仪液器 YT－603集菌仪 5.1培养基的适用性检查 无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及胰胳大豆胨肉汤培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。 培养基：硫乙醇酸盐批号20140408 生产厂家：日水生物技术 胰胳大豆胨肉汤培养基批号20151023 生产厂家：尼赛欣合生物技术
5.1.1无菌性检查：每批培养基随机取不少于 5 支（瓶），培养 14 天，应无菌生长。 5.1.2灵敏度检查 菌种：培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过 5 代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第 0 代），试验用菌种应采用适宜的菌种保存技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 〔CMCC(B) 10 104〕 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕 生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕 白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕 黑曲霉(Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98 003〕 5.1.3菌液制备 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉微生物培养基质控品,使用前注入1.1ml稀释液充分溶解后,在漩涡混合器上震荡混匀,制成10-100 cfu/0.1ml菌悬液,3-5天用完。 5.1.4培养基接种取每管装量为12ml 的硫乙醇酸盐流体培养基7支，分别接种小于100 cfu 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2 支，另1支不接种作为空白对照，培养3 天；取每管装量为9ml的胰胳大豆胨肉汤培养基7支,分别接种小于100 cfu 的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2 支，另1 支不接种作为空白对照，培养5 天。逐日观察结果。 5.1.5结果判定空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该