金线莲组织培养方法 一种药用金线莲组织培养快速繁殖方法，其特征在于包括如下步骤：１）培养基准备该步骤包括配制，分装，灭菌三步，其中配制：以１／２ＭＳ为基本培养基，每升添加６－苄氨基嘌呤２ｍｇ、α－萘乙酸１．０～１．５ｍｇ、芸苔素内酯０．０５ｍｇ、香蕉１００ｇ、琼脂６．５ｇ和蔗糖２５ｇ，混合后的培养基的ｐＨ值调节至５．６；分装：将配制后的培养基加热至琼脂完全溶解，趁热均匀地分装于干净的培养瓶中，稍凉后加盖；灭菌：将加入培养基的培养瓶及时放入高压灭菌锅内灭菌，灭菌条件为：１２１℃、１０５ｋＰａ下灭菌１５分钟，灭菌后及时取出培养瓶，冷却备用；２）外植体处理和接种该步骤分为两种情形，当采用自然生长的植株作为外植体时包括清洗，消毒，接种三步，其中清洗：选择自然生长、无病虫害的健壮植株，用加入少许肥皂粉的水清洗植株，后用流水冲洗２小时；消毒：在无菌条件下，去除叶片，将植株茎段在７５％的酒精中浸润１０秒后，放入１０％的次氯酸钠消毒１５分钟，用无菌水清洗６遍，沥干水分，放入无菌的培养皿中备用；接种：将消毒后备用的茎在无菌条件下切成长约１ｃｍ、含一个茎节的若干茎段，接种于准备好的培养基上，每瓶接１个茎段；当采用组培无菌苗时直接进行无菌接种，即在无菌条件下将组培无菌苗去叶，将茎切成长约１ｃｍ、含一个茎节的若干茎段，接种于准备好的培养基上，每瓶接１个茎段；３）培养该步骤将接好种的培养瓶移入培养室进行幼苗的诱导与培养，培养条件为：温度２５±２℃，光照时间每天１２小时，光照强度１５００～２０００ｌｘ，培养时间四个月左右，培养期间要勤检查，发现污染的要及时去除；４）移栽选苗高约６～８ｃｍ、具叶３张以上、茎基直径约２ｍｍ、发根２～３条的试管苗，炼苗４天后，洗净附着在植株上的培养基，并晾干洗涤水后移栽至１份菜园土＋２份粗砂＋１份木屑，或１份菜园土＋１份粗砂＋２份木屑的基质中。 2一种菌根真菌在金线莲栽培中的应用技术，采用小菇属4种真菌：石斛小菇(Mycena dendrobii)、紫萁小菇(Mycenaosmundicola)、兰小菇(Mycena orchidicola)、开唇兰小菇(Mycena anoectochila)中的任选一种或由其中任意两种或两种以上组成，其主要步骤及条件如下(所述比例均为重量百分比)：(1)菌根真菌的培养将上述的菌根真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后，分别转接于PDA平皿中，于25℃恒温培养12-20d，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基进行培养和发酵或接入固体培养基进行培养；(2)金线莲苗的培养芽增殖培养基：MS(Murashige and Skoog 1968)培养基，附加6-BA(6-苄基嘌呤1.2mg/L、NAA(萘乙酸)0.6mg/L；丛芽增殖培养基：MS为基本培养基，附加6-苄基嘌呤(BA)1.5mg/L，吲哚丁酸(IBA)0.6mg/L，玉米素(ZT)0.15mg/L；苗继代培养基：1/2MS，200g/L马铃薯提取液，25g/L蔗糖，琼脂9g/L，pH5.8；(3)菌根真菌与金线莲苗共生栽培(a)金线莲栽培基质蛭石∶砂子＝4∶1或森林腐殖土∶砂子＝6∶1或泥炭土∶砂子＝5∶1或泥炭土∶砂子∶蛭石＝4∶1∶2；(b)金线莲菌根共生栽培在硬质材料的托盘或盆中立体栽培，其容器的基部平铺一层金线莲栽培基质，其上按株行距栽培一株或一丛的金线莲苗，在苗根的基部放置少量粉碎的湿栎树(山毛榉科Fagaceae)树叶，其上再放以上备好的液体菌根真菌2ml或固体菌根真菌1-2g，使金线莲的根与菌接触，用栽培基质将苗覆盖2-3厘米厚，浇放置至室温的水；(c)栽培条件采用塑料薄膜温室、玻璃温室、露天栽培遮阳网遮阴，环境温度为18-25℃，光照量为正常日光量的1/3，照度2000Lx；(d)金线莲的收获收获时可剪取地上部分，也可一次性连根取出洗净栽培基质；阴干或60℃以下烘干；其中所述的菌根真菌的液体培养为：培养基的配制：葡萄糖2.5％；KH2PO4 0.15％；K2HPO4 0.1％；MgSO4 0.15％；天然物：麦麸3％(煮汁)，高压灭菌后分别接入上述真菌；培养条件：培养基pH5.6；三角瓶摇床培养瓶装
一嘌呤霉素 (一)确定最优筛选浓度 当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时，需进行滴定，或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。 一般而言，嘌呤霉素浓度范围在2-10微克/毫升时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。 1.培养待转染（而不是转染后）的细胞。（筛选的目的是杀灭未转染的细胞） 2.取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血清的培养基制成 1.5×105个/ml的细胞悬液。 3.向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在 1.5×104个），然后向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养过夜。（这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。） 4.第二天用嘌呤霉素浓度分别为0, 2, 4, 6, 8, 10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基溶液替换各孔中的旧的培养基。（每个浓度可用两个复孔，相当于每个浓度测定三次）。（注意： 对于多数细胞种类而言，过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的反应。） 5.每日检查细胞活力，根据细胞活力，每三天(即每隔两天)更换含嘌呤霉素的新鲜无抗无血清培养基溶液一次。如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。 6.在正常的实验操作规程时，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一般生存时间而定，大概需3到14天。在所需时间之后，嘌呤霉素的导
致所有细胞死亡的最小浓度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。最优浓度为在3-5天内杀死所有细胞的浓度。 (二)转染细胞 1.第一天： 在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到70%-80%的密度，CO2孵箱过夜培养。 2.第二天： 准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene使其终浓度为8μg/ml。将已经制备的病毒颗粒 0.5ml加至上述培养基，轻吹混匀。去除60mm培养皿内的旧的培养基，加入含病毒培养基。（Polybrene能够增加病毒感染的效率，然而，有时候Polybrene对细胞有毒性。这时，可以用ProtamineSulfate代替Polybrene） (三)筛选细胞 1.病毒感染后24小时，可以换用含最优浓度puromycin的培养基。 2.如果病毒对细胞有毒性，可以减少感染时间至4-6小时，然后换用新鲜培养基，24-48小时后换加含最优浓度puromycin的培养基。最好设立一个对照皿，不加病毒液，加入Ploybrene，观察Polybrene是否对细胞有毒性；如果Polybrene没有毒性，还可以加入puromycin，作为puromycin是否有效的对照。 3.以后每隔一天换用新鲜含puromycin的无抗生素无血清培养基，以替换含大量死细胞的培养基。直到抗性群落能被识别出（一般是在筛选后10到12天）。 4.待抗性细胞长满以后，细胞转入10cm培养皿，同时，留一部分细胞在原来的60mm平皿内。
植物组培培养基的成分 培养基是人工配制的，满足不同材料生长，繁殖或积累代谢产物的营养物质。在离体培养条件下，不同种类植物对营养的要求不同，甚至同一种植物不同部位的组织以及不同培养阶段对营养要求也不相同。筛选合适的培养基是植物组织培养极其重要的内容，是决定成败的关键因素之一。 大多数植物组织培养基的主要成分是无机营养物质（大量营养元素和微量营养元素）、碳源、有机添加物、植物生长调节剂和凝胶剂。一些组织可以生长在简单的培养基上，这些培养基只含无机盐和可利用的碳源（蔗糖），但大多数组织必须在培养基中添加维生素、氨基酸和生长物质，而且经常还将一些复合的营养物质加入到培养基中，这种由“化学定义”的化合物组成的培养基称为“合成”培养基。 人们已设计了许多培养基用于特殊组织和器官的培养。 怀特培养基是最早的植物组织培养基之一，最初作为根培养的培养基。为了诱导培养组织器官发生和再生植株，广泛使用含有大量无机盐成分的MS（Murashige和Skoog，1962）和LS(Linsmaier 和Skoog，1965)培养基。原本为细胞悬液或愈伤组织培养而设计的B5培养基，经过改良后，被证实有利于原生质体培养。同时，B5培养基也被用于诱导原生质体再生植株。尽管Nitshch(1969)为花药培养设计的培养基仍然使用频繁，但另一个称为N6的培养基，专门用于禾谷类花药培养和其他组织培养。类似的，N6培养基越来越多地
用于大豆、红三叶草和其他豆科植物的培养。该培养基营养成分促进胚性细胞和原生质体再生细胞快速生长。使用这些培养基成功的原因很可能是营养元素的比例和浓度基本上满足不同培养体系中细胞或组织生长和分化的最适需要。 植物组织培养基中无机和有机成分的浓度用质量浓度（mg/L 或ppm，但现在习惯用mg/L）或物质的量浓度(mol/L)表示。按照国际植物生理学协会的推荐，应该用mol/L表示大量营养元素和有机营养成分浓度，用μmol/L表示微量营养元素、激素、维生素和有机成分浓度。用物质的量浓度的优点是，每一种化合物每一摩尔的分子数是常数，所以按照特定培养基配方配制培养基时，无论无机盐化合物的水分子数为多少，原物质的量浓度都可以使用。但是，用质量浓度来表示浓度的话，就不能不考虑无机盐化合物的水分子数目了。 1、水分 水分是植物体的主要组成部分，也是一切代谢过程的介质和溶媒，在植物生命活动过程中不可缺少。配制培养基母液时要用蒸馏水或纯水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止储藏过程中发霉变质。研究培养基配方时尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。而在大规模工厂化生产时，为了降低生产成本，常用自来水代替蒸馏水。如自来水中含有大量的钙、镁、氯和其他离子，最好将自来水煮沸，经过冷却沉淀后再使用。
植物组织培养技术 植物组织培养是指将植物体的一部分接种在合成培养基上，使其按照预定目标生 长发育成新植株。近年来，花卉组织培养及快繁脱毒技术越来越多地应用于花卉种苗 繁殖生产中。 一、组织培养在花卉产业中的应用 1.快速、大量繁殖优良品种组织培养技术已成为种苗生产的主要技术之一。经组织 培养，可增加繁殖系数，加快繁殖速度，可生产出种性纯、品质好、产花量高的生产 性用苗。在花卉育种过程中，不断的杂交、选种极大地扩展了花卉的花形与颜色，使 得花卉在各方面都越来越接近人们的需求。但在同时，也造成了花卉基因类型的高度 异质化———子代不易有均一表现。而组培苗是在母株器官、组织或细胞的基础上发展起来的，可以保持母株的全部特性（花形、花色、株形、开花习性、抗逆性等）， 因而可以根据需要来选择集多种优良性状于一体的植株加以分生，从而得到大量与母 株一模一样的植株。 2.培育脱毒苗木采用组织培养技术，利用植株的分生组织不易感染病毒的原理，可 以对花卉植株的分生组织进行组织培养来繁殖苗木，防止亲代植株的病害传递给子代，从而达到脱毒的目的。 病毒病对长期应用营养繁殖（分株、扦插等）的观赏植物及其生产的危害相当严重。由于观赏植物多采用营养繁殖，如嫁接、分株、压条等方法繁殖时，病毒（及类 病毒）则通过营养体及刀具、土壤传递给后代，大大加速了病毒病的传播与积累，导 致病毒病的危害越来越严重。据统计，观赏植物的病毒已多达100多种，并且逐年有 新增病毒的报道。观赏植物因病毒病大大影响其观赏价值，表现在康乃馨、菊花、百合、风信子等的鳞茎、球茎与宿根类花卉及兰科植物等严重退化，花少且小，花朵畸形、变色，大大影响观赏价值，严重者甚至导致某些品种的灭绝，严重制约观赏植物 生产的发展，这也是我国切花品种跨不出国门的原因之一。组培快繁技术已应用到蝴蝶兰的栽培中非洲菊也可以通过组培快繁技术进行繁殖 植物组织培养脱毒的原理主要是利用茎尖分生组织不带毒或少带毒。感病植株体内的病毒分布不均匀，其数量随植株部位和年龄而异，越靠近茎尖顶端的区域，病毒 的浓度也越低。分生区域无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞不断分 裂和活跃的生长速度，因此生长点含有病毒的数量极少，几乎检测不出病毒。因此， 茎尖培养时，切取茎尖的大小对脱毒效果有很大影响，茎尖越小效果越佳，但太小时 不易成活，过大则不能保证完全除去病毒。不同种类的植物和不同种类的病毒在茎尖
金线莲组织培养及栽培技术研究 吴艺东 (南靖国有林场,福建漳州 363600) 摘 要:金线莲属名贵中草药,野生数量极少,通过人工栽培形成规模生产,才能满足市场需要。试验研究了金线莲组培育苗、大棚栽植等过程中应注意的有关影响因素。 关键词:金线莲;外植体;组培;移栽;基质;消毒;温度;湿度 中图分类号 S567 23+9 文献标识码 A 文章编号 1007-7731(2009)15-46-01 金线莲又称金线兰、金不换、金钱草、鸟人参等,为兰科化叶开唇属的多年生草本植物,是珍稀民间草药,全草入药,味平、甘,常用于治疗小儿惊风高热、糖尿病、高血压、肝炎、风湿性关节肿瘤及其他疑难杂症。 金线莲属植物有30多种,一般分布在海拔300~ 1200m的丘陵地;我国福建、广东、广西、海南、四川、贵州、云南均有野生金丝莲。它性喜阴凉、潮湿,尤其喜欢生长在有常绿阔叶树木的沟边、石壁、土质松散的潮湿地带,要求温度18~20 ,光照约为正常日照的1/3,最忌阳光直射。其株高8~20c m,根茎细软,茎圆筒形,先端直立,基部成匍匐状,茎节明显;叶互生具柄,呈椭圆形,叶面有光泽、墨绿色中有金黄脉网,叶背淡紫红色;花为完全花,总状花序具有1~6朵松散的花,花序梗长8~13c m,被柔毛,花苞片淡紫色,卵状披针形。金线莲除药用外,还是一种极具观赏价值的室内观叶珍品。由于其对生态环境要求严格,加之近年自然环境遭受严重破坏,野生金线莲越来越少,因而商品价格居高不下,鲜草价达400元/kg以上,干草价达2000~3000元/kg。因此,国内相关部门经过研究实践,目前人工栽培技术已进入推广阶段。本文就金线莲的组织培养与人工栽植的过程进行试验分析。 1 外植体的建立 1 1 取材 于2007年5~10月在南靖县山城镇和南坑镇高山坑沟采集长势良好、无病虫害的野生金线莲植体,取回后置于南靖国有林场小山城工区搭建的阴凉大棚内培养7d左右,以减少其所带的杂菌。 1 2 预处理 将金线莲从大棚中取出,用流水将植株洗净后去掉根、叶,再用小刀把叶鞘及顶芽外叶削掉,整个过程不要伤及腋芽。用棉花沾肥皂水擦洗植株并浸泡10m in后用纱布包起,移至超净工作台上。 1 3 消毒 用75%酒精振荡10~15s后,再用0 1%升汞水灭菌3m in,无菌水冲洗2遍。最后用12%漂白粉澄清液灭菌10m i n,无菌水冲洗5遍后即可进行接种。 1 4 接种 将消毒好的材料切成带1~2个腋芽的茎段,接到诱导培养基上。诱导培养基为1/2M S(即大量元素减半,其他成分不变)+6-BA5m g/L+NAA1m g/L+琼脂粉0 65%+3%蔗糖,p H5 8。培养温度(25 3) ,诱导过程中无光照或低光照(500~600l x) 2 继代增殖培养 接种15d后开始萌动。观察发现,顶芽较腋芽更容易萌动,腋芽以丛生生长为主,顶芽则以伸长生长为主。再培养30d后将诱导出的芽切成带1~2个腋芽的茎段,接到增殖培养基M S+6-BA3m g/L+KT2mg/L+NAA0 3 m g/L+0 65%琼脂+3%蔗糖。继代培养前期低光照,随后可适当增强光照(1000~1200l x)。 3 生根培养 取茎段粗壮,长势好的金线莲接到生根培养基M S+ I BA1m g/L+KT0 2m g/L+NAA4m g/L+0 65%琼脂+ 3%蔗糖+0 3%活性炭,每天光照10h,光照度1500~ 1200l x。培养10d后开始生根,根不从切口处而从靠近培养基的每个节上长出1~2条,呈肉质状。根比较短且不分支,其上有细密、乳白色后径根毛。培养50d左右,植株长至8c m时可进行室外移栽。 4 大棚搭建和组培苗移栽 大棚用毛竹和水管搭成,顶部先覆盖一层薄膜,再在上面用80%遮阳网覆盖,顶高大约3m左右,棚内搭3层盆架,第一层离地面10c m,上两层各离70c m,棚内地面铺15c m高的河沙(上沙下土),用于保湿。移栽一般选择在气温较低的秋冬季节,将促根后的金线莲移至室外进行适应性炼苗后,将苗从瓶中拔出、洗净,种植于阴凉大棚内。栽培基质采用A 腐殖土 椰康 细沙=1 1;B 松木树皮粉碎加工 泥炭土=2 1(每100kg基质加0 5kg进口复合肥)。移植前基质进行日晒消毒,移植后用1 5000倍绿佳喷淋消毒,整个移栽过程要做好喷水工作。 5 移栽后管理 把金线莲移至阴凉大棚内专用花盆内,每盆栽植20株左右,大棚内温度控制在20~28 ,使空气相对湿度保持在70%~80%;以后每7d喷1次1/4M S或氨基酸800倍左右喷施来补充养分,以够湿为准;如遇有猝倒病则喷施多茵灵或托布津1000倍液,3个月培养期后出苗,选择根壮叶繁的15c m高优质苗。采后用清水(下转211页) 46安徽农学通报,Anhu iAgri Sci Bu ll 2009,15(15) 作者简介:吴艺东(1971-),男,福建南靖人,林业工程师,主要从事林业资源培育和林木种苗培育工作。 收稿日期:2009-06-08
金线莲组培快繁技术研究 【摘要】目的建立金线莲快繁体系。方法以茎段为外植体，开展了茎段不同部位、培养基、激素、有机物和活性炭对不定芽增殖、幼苗生长的影响研究，并进行了移栽试验。结果外植体以不含顶芽和长根的中间段茎节为好；不定芽增殖最佳培养基配方为MS（或B5）+BA3.0 mg/L +NAA0.5～1.0 mg/L，两个月增殖倍数达5.0以上；壮苗最适培养基为1/2MS＋NAA3.0 mg/L＋6-BA 0.5 mg/L＋香蕉提取物20%（或椰子汁20%）；试管苗移栽适宜的基质为菜园土1份＋2～3 mm粗砂2份（或1份）＋木屑1份（或2份），3个月成活率均达100%，且生长良好。结论采用上述方法，能实现金线莲幼苗的快速繁殖。 【关键词】金线莲；快速繁殖；增殖；生长；移栽金线莲Anoectochilus roxburghii（wall.）lindl为兰科开唇兰属多年生草本，别名金蚕、金线兰、金线虎头蕉等，是我国传统珍贵药材，素有“金草”“神药”“乌人参”等美称，在民间应用范围较广，广泛应用于风湿性关节炎、高血压病、糖尿病、肾病等疑难杂症的治疗和强身健体、病后体虚恢复等方面，在浙江、福建、台湾等省和东南亚地区被视为珍稀名贵药材，特别在台湾省更是备受青睐，被称为“药中之王”［1，2］。 金线莲种子微小，由未成熟的胚及数层种皮细胞构成，自然萌发率和繁殖率低，目前市场上货源主要来自于野生采挖，产品一直处
于供不应求的状况。近年来，随着对其药效学和临床应用研究的深入，对金线莲药用价值的认识进一步提高，其市场货源紧缺的状况更为严峻，野生资源也不断遭到破坏性采挖，以致于处于濒临灭绝之地。本研究旨在采用组织培养技术，解决金线莲种苗来源，加快人工栽培，以保护金线莲野生资源、稳定市场供应。现将有关实验结果如下。 1 材料与方法 1.1 材料无菌繁殖体系的建立为浙江金线莲野生种源，其它实验为继代培养的不定芽及无根幼苗茎段。 1.2 无菌繁殖体系的建立取生长健壮、无病虫害的植株，去叶后放入低浓度的洗衣粉水中漂洗3～5 min，然后用流水冲洗30 min。在超静工作台前，用75% 酒精湿润5～6 s，放入0.1%的HgCl 溶液灭菌12～13 min，用无菌水冲洗5～6次。将消毒好的茎按上段（具茎尖）、中段和下段（匍匐茎段）切成长约1.5～2 cm，带有1～2个节间的小段，分别接种于MS+6－BA 4.0 mg/L +NAA 0.4 mg/L 培养基上，pH5.6，蔗糖 2.5%，琼脂0.7%。培养条件为：温度(25±2）℃，光照时间12 h/d，光照强度1 500～2 000 lx。 1.3 不定芽诱导 1.3.1 基本培养基对不定芽诱导的影响采用单因素实验，培养基选用MS（Murashige-Skoog）［3］，1/2MS（大量元素减半，其他成分不变），VW(Vacin & Went)，B5（Gamborg·Miller & Ojima）和KC(Knudson C)等5种，分别添加6－BA 4.0mg/L，NAA 1.0 mg/L。 1.3.2 激素对不定芽诱导的影响以MS为基本培养基，添加不
葡萄糖肉浸液肉汤Dextrose Meat Infusion Broth 用途：用于溶血性链球菌的增菌培养 配方：（g/L）牛肉粉3.0 氯化钠5.0 蛋白胨10.0 磷酸氢二钾2.0 葡萄糖10.0 pH 值7.5 ±0.1 25℃ 原理：蛋白胨、牛肉粉提供氮源、维生素和生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压；磷酸氢二钾为缓冲剂；葡萄糖提供碳源。 用法：称取本品30.0g,煮沸溶解于1000ml 蒸馏水中,121℃高压灭菌15 分钟,备用。质量控制：在36± 1℃培养24 小时。质控菌株溶血性链球菌单增李斯特氏菌大肠杆菌沙门氏菌27853 25922 14028 生长情况（10-8）+++ （10-8）+++ +/+/ 匹克氏肉汤基础A Pick’s Broth BaseA 用途：用于溶血性链球菌的增菌培养 配方：（g/L）胰蛋白胨10.0 牛心浸粉20.0 叠氮钠0.065 结晶紫0.002 pH 值7.3-7.5 原理：25℃胰蛋白胨、牛心浸粉提供碳氮源、维生素和生长因子；脱纤维兔血（或羊血）为溶血性链球菌提供大量生长因子；结晶紫和叠氮钠为选择性抑菌剂。 用法：称取本品30.0g,加热溶于1000ml 蒸馏水中,分装, 121℃高压灭菌15 分钟, 冷至50℃左右时,加入脱纤维羊血,混匀。 质量控制：在36± 1℃培养18-24 小时。 肉浸液肉汤培养基Meat Infusion Broth 用途：用于溶血性链球菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的增菌培养（GB 标准） 配方：（g/L）牛肉粉3.0氯化钠5.0蛋白胨12.0 磷酸氢二钾2.0 pH 值7.5 ±0.1 原理：蛋白胨和牛肉粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源；磷酸氢二钾为缓冲剂；氯化钠可维持均衡的渗透压。 用法：称取本品20.0g,溶解于1000ml 蒸馏水中,121℃高压灭菌15 分钟,备用。 质量控制：在36± 1℃培养18-24 小时。25℃ 质控菌株溶血性链球菌金黄色葡萄球菌大肠埃希氏菌沙门氏菌 菌株编号ATCC32210 ATCC25923 ATCC25922 ATCC14028 生长情况+++ +++ +++ +++ 浑浊浑浊浑浊浑浊 叠氮钠葡萄糖肉汤Azide Dextrose Broth 用途：用于链球菌的增菌培养 配方：（g/L）胰蛋白胨15.0 牛肉浸粉4.5 氯化钠7.5 葡萄糖7.5叠氮钠0.2 pH 值7.0 - 7.4 原理：胰蛋白胨和牛肉浸粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源；葡萄糖提供碳源；叠氮化
金龟子绿僵菌选择性培养基的筛选 作者：程子路， 詹儒林， 许天委， 宋妍， 郭立佳， 张世清， 黄俊生 作者单位：程子路,许天委,宋妍,郭立佳,张世清,黄俊生(中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,海南儋州,571737)， 詹儒林(中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,海南儋州 ,571737;中国热带农业科学院南亚热带作物研究所,广东湛江,524091) 刊名： 江苏农业科学 英文刊名：JIANGSU AGRICULTURAL SCIENCES 年，卷(期)：2007(5) 被引用次数：2次 参考文献(13条) 1.李增智.程双龙.鲁绪祥绿僵菌、黄僵菌对松毛虫的室内杀虫及固体生产试验初报[期刊论文]-安徽农学院学报1985(02) 2.宋漳.景云.蔡和谦应用绿僵菌防治马尾松毛虫初探 1997(02) 3.江英成绿僵菌和白僵菌侵染马尾松毛虫试验比较[期刊论文]-浙江林学院学报 2000(04) 4.Weiner J E B M.Kennedy C Growth and variability in crowded and uncrowded populations of dwarf marigold(tagetes patula) 1990 5.张思玉桫椤群落内主要乔木种群的种间联接性[期刊论文]-应用与环境生物学报 2001(04) 6.张思玉.郑世群永定桫椤群落的结构特征[期刊论文]-植物资源与环境学报 2001(03) 7.尚进.李旭光.石胜友重庆涪陵磨盘沟桫椤种群结构与分布?格局研究[期刊论文]-西南农业大学学报(自然科学版) 2003(03) 8.张跃西.钟章成亚热带次生常绿阔叶林乔木优势种邻体干扰竞争模型的研究 1997 9.张跃西.钟章成亚热带次生常绿阔叶林优势种间的竞争效应与竞争反应[期刊论文]-应用与环境生物学报 2003(04) 10.史红霞.胡明龙球孢白僵菌选择性培养基的筛选和检测应用[期刊论文]-浙江林学院学报 2002(02) 11.王滨.樊美珍球孢白僵菌选择性培养基的筛选[期刊论文]-安徽农业大学学报 2000(01) 12.Veen K H.Ferron P A selective medium for the isolation of Beauveria tenella and of Metarhizium anisopliae 1966 13.樊美珍.李增智绿僵菌在土壤中的延续及控制桃小食心虫的潜力 1996(01) 引证文献(2条) 1.孔琼.袁盛勇.郭亚力.张宏瑞.田学军.李河球孢白僵菌MZ041016菌株及其与化学农药混配对禾谷缢管蚜的毒力测定[期刊论文]-江苏农业科学 2008(4) 2.程辉彩.敦冬梅.张丽萍.张根伟.董超.崔冠慧高毒力杀蝗绿僵菌的紫外线诱变选育[期刊论文]-江苏农业科学2008(3) 本文链接：https://www.doczj.com/doc/ef16080729.html,/Periodical_jsnykx200705025.aspx
培养基的选择和优化（初稿） 一、培养基的概念：culture medium 是人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物需要的多种营养物质的混合物。其成分和配比对微生物的生长、发育、代谢产物的合成，甚至对于发酵工业的生产工艺都有很大的影响。 二、用途和分类： 用途：筛选菌种、保藏菌种、检验杂菌、培养种子、发酵生产。 分类： 1.按成分不同：天然：用化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物配制。 例：牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基。 合成：化学成分完全了解的物质配制而成的培养基。 例：查氏培养基、高氏 1号培养基 复合（半合成培养基）：天然成分+化学试剂 2.按物理状态：固体：加入一定量的凝固剂，琼脂含量1.5%-- 3.0%， 常用来微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏。 半固体：琼脂0.3%--0.5%，观察运动特征，分类鉴定 液体：不加任何凝固剂， 大规模生产及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究。 3.按实验目的：基础：适合大多数微生物生长的培养基，如牛肉膏蛋白胨培养基 加富：在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类培养基。如高糖培养基 选择：在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。如麦康凯培养基 鉴别：用于鉴别不同微生物的培养基，微生物产生某种代谢产物，与培养基中的化学物质发生化学反应，产生明显的特征变化，如EMB培养基 三、成分来源： （人工配制的、适合微生物生长、繁殖或产生代谢产物的营养基质，是微生物学研究和微生物发酵生产的基础。任何培养基都应具备微生物所需要的六大营养要素，且其间的比例合适。） 营养: 有机体吸取和利用营养物质的过程。 营养物质: 微生物为了生存就必须从环境中吸取各种物质以合成细胞物质、提供能量以及在新陈代谢中起调节作用。这些物质就称为营养物质。
细胞筛选 一嘌呤霉素 (一)确定最优筛选浓度 当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时，需进行滴定，或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。一般而言，嘌呤霉素浓度范围在2-10微克/毫升时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。 1.培养待转染（而不是转染后）的细胞。（筛选的目的是杀灭未转染的细胞） 2.取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血 清的培养基制成1.5×105个/ml的细胞悬液。 3.向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在1.5×104个），然后 向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养过夜。（这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。） 4.第二天用嘌呤霉素浓度分别为0,2,4,6,8,10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基 溶液替换各孔中的旧的培养基。（每个浓度可用两个复孔，相当于每个浓度测定三次）。（注意：对于多数细胞种类而言，过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的反应。） 5.每日检查细胞活力，根据细胞活力，每三天(即每隔两天)更换含嘌呤霉素的新鲜无 抗无血清培养基溶液一次。如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。 6.在正常的实验操作规程时，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一
般生存时间而定，大概需3到14天。在所需时间之后，嘌呤霉素的导致所有细胞 死亡的最小浓度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。最优浓度为在3-5天内杀死 所有细胞的浓度。 (二)转染细胞 1.第一天：在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到 70%-80%的密度，CO2孵箱过夜培养。 2.第二天：准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene使其终浓度为8μg/ml。 将已经制备的病毒颗粒0.5ml加至上述培养基，轻吹混匀。去除60mm培养皿内的 旧的培养基，加入含病毒培养基。（Polybrene能够增加病毒感染的效率，然而， 有时候Polybrene对细胞有毒性。这时，可以用ProtamineSulfate代替Polybrene） (三)筛选细胞 1.病毒感染后24小时，可以换用含最优浓度puromycin的培养基。 2.如果病毒对细胞有毒性，可以减少感染时间至4-6小时，然后换用新鲜培养基， 24-48小时后换加含最优浓度puromycin的培养基。最好设立一个对照皿，不加病 毒液，加入Ploybrene，观察Polybrene是否对细胞有毒性；如果Polybrene没有 毒性，还可以加入puromycin，作为puromycin是否有效的对照。 3.以后每隔一天换用新鲜含puromycin的无抗生素无血清培养基，以替换含大量死细 胞的培养基。直到抗性群落能被识别出（一般是在筛选后10到12天）。 4.待抗性细胞长满以后，细胞转入10cm培养皿，同时，留一部分细胞在原来的60mm 平皿内。
植物组织培养MS培养基配方 （一）母液配制与保存 配制培养基时，如果每次配制都要按着杨成分表依次称量，既费时，又增加了多次称量误差。为了提高配制培养基的工作效率，一般将常用的基本培养基配制成10～200倍，甚至1000倍的浓缩贮备液，即母液。母液贮存于冰箱中，使用时，将它们按一定的比例进行稀释混合，可多次使用，并在配制较多数量的培养基时，降低工作强度，也提高试验的精度。 基本培养基的母液有四种：大量元素（浓缩20倍），微量元素（浓缩100倍），铁盐（浓缩200倍），除蔗糖之外的有机物质（浓缩100倍） 1大量元素 配制大量元素母液时要分别称量，分别溶解，在定容时按表1中的序号依次加入容量瓶中，以防出现沉淀。倒入磨口试剂瓶中，贴好标签和做好记录后，可常温保存或放入冰箱内保存。 表1大量元素母液（配1L20倍的母液） 序号成分配方浓度/（mg.L-1）称取量/mg 配1mL培养基吸取 量/mL 1 硝酸铵NH4NO3 1650 33000 50 2 硝酸钾KNO 3 1900 38000 3 磷酸二氢钾KH2PO 4 170 3400 4 七水合硫酸镁MgSO4.7H2O 370 7400 5 氯化钙无水CaCl2 440 6644 2微量元素母液 在配制微量元素母液时，也应分别称量和分别溶解，定溶时不分先后次序，可随意加入溶量瓶中定容（表2），一般不会出现沉淀现象。倒入磨口试剂瓶中，贴好标签和做好记录后，可常温保存或放入冰箱内保有存。 表2微量元素母液(配制1L100倍母液) 成分配方浓度/(mg.L-1) 称取量/mg 配制1L培养基吸取 量/mL 碘化钾KI 0．83 83 10 硫酸锰MnSO4.H2O 22．3 2230 硼酸H3BO3 6．2 620 硫酸锌ZnSO4.7H2O 8．6 860 钼酸钠Na2MoO4.2H2O 0．25 25 硫酸铜CuSO4.5H2O 0．025 2．5 氯化钴CoCl2.6H2O 0．025 2．5 3铁盐母液 由于铁盐无机化合物不易被植物吸收利用，只有基螯合物才能被植物吸收利用，因此需要单独配成螯合物母液表3）。 配制方法：称取5.56g硫酸亚铁和7.46g乙二胺乙酸二钠，分别用450ml的去离子水溶解，分别适当加热不停搅拌，分别溶解后将硫酸亚铁溶液缓缓加入到乙二胺四乙酸二钠溶液中，将两种溶液混合在一起，最后用去离子水定溶于1000mL，倒入棕色贮液瓶中，贴好标签和做好记录后放入冰箱内保存。
植物组织培养的培养基中，需要添加糖类作为碳源物质，因此糖类是影响植物组织培养成功与否的关键之一。高中生物教材中明确指出，植物组织培养的培养基中添加的糖类是蔗糖。那么为什么不添加葡萄糖呢？很多资料上解释为蔗糖较葡萄糖便宜，易被植物细胞吸收。其实并非如此。之所以以蔗糖作为碳源，主要有三个方面的原因： （1）同样作为碳源为植物细胞提供能量来源，蔗糖较葡萄糖能更好地调节培养基内的渗透压。配制相同质量分数的培养基，蔗糖形成的渗透压要明显低于葡萄糖，因此若采用葡萄糖作为碳源，易使植物细胞脱水而生长不良。同时，植物细胞吸收蔗糖的速率要明显慢于吸收葡萄糖的速率，所以蔗糖形成的渗透压可相对长期的保持稳定。 （2）植物组织培养过程中，要时刻注意防止培养基受到微生物的污染。微生物生长所需的碳源最常用的是葡萄糖，一般很少利用蔗糖。因此，采用蔗糖作为培养基的碳源，可一定程度上减少微生物的污染。 （3）诱导作用。在培养基成分中，增加生长素的浓度，导致木质部形成，增加蔗糖浓度则导致韧皮部形成。当生长素水平恒定时，2％蔗糖使分化出的全部是木质部，4％蔗糖使分化出的几乎全部是韧皮部，3％蔗糖则可以分化出两者。所以，生长素和蔗糖浓度决定愈伤组织中维管束的类型与数量。因此，在植物组培中要选用蔗糖而不选用葡萄糖。 通过细胞膜内外的液体的浓度差来调节 当细胞膜内的浓度小于细胞膜外的时候蔗糖救能进入细胞中了 植物细胞培养中最常用的培养基的碳源是蔗糖，已知葡萄糖和果糖也能使某些植物生长得很好。植物细胞可以分解蔗糖，蔗糖是由一分子果糖和一分子葡萄糖组成的，蔗糖是可以直接进入细胞的，蔗糖跨质膜从质外体进入细胞是由载体介导并需要消耗能量的质子-蔗糖共运输机制进行的，另外，植物能够利用的某些其他形式的碳源有麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖等。葡萄糖更不稳定，培养基需添加葡萄糖一般都在灭菌后再兑换。实在要添加葡萄糖那么灭菌温度一般控制在108~110左右，120度灭出来的就有一定程度的碳化了。所以用蔗糖更简单 动物细胞只能吸收葡萄糖，二糖蔗糖是无法吸收的。 以蔗糖为植物培养基碳源有两个原因: 1.抑制杂菌生长.细菌等不能直接以蔗糖为碳源,故可起抑制其生长的作用 2.蔗糖被植物细胞利用机理目还无定论.主要有以下两个学说(1)植物细胞先以次级主动运输的方式在细胞内外形成质子梯度,然后蔗糖就会利用这个梯度被吸收进细胞. (2).植物的细胞壁中含有能分解蔗糖的相关酶,蔗糖先在细胞膜外被分解为单糖,然后这些单糖再以主动运输的方式进入细胞,从而被细胞利用.
金线莲组培快繁技术研究 【摘要】?? 目的建立金线莲快繁体系。方法以茎段为外植体，开展了茎段不同部位、培养基、激素、有机物和活性炭对不定芽增殖、幼苗生长的影响研究，并进行了移栽试验。结果外植体以不含顶芽和长根的中间段茎节为好；不定芽增殖最佳培养基配方为MS（或B5）+BA3.0?mg/L?+NAA0.5～1.0?mg/L，两个月增殖倍数达5.0以上；壮苗最适培养基为1/2MS＋NAA3.0?mg/L＋6-BA?0.5?mg/L＋香蕉提取物20%（或椰子汁20%）；试管苗移栽适宜的基质为菜园土1份＋2～3?mm粗砂2份（或1份）＋木屑1份（或2份），3个月成活率均达100%，且生长良好。结论采用上述方法，能实现金线莲幼苗的快速繁殖。?? 【关键词】??金线莲；?快速繁殖；?增殖；?生长；?移栽? 金线莲Anoectochilus?roxburghii（wall.）lindl为兰科开唇兰属多年生草本，别名金蚕、金线兰、金线虎头蕉等，是我国传统珍贵药材，素有“金草”“神药”“乌人参”等美称，在民间应用范围较广，广泛应用于风湿性关节炎、高血压病、糖尿病、肾病等疑难杂症的治疗和强身健体、病后体虚恢复等方面，在浙江、福建、台湾等省和东南亚地区被视为珍稀名贵药材，特别在台湾省更是备受青睐，被称为“药中之王”［1，2］。? ????? 金线莲种子微小，由未成熟的胚及数层种皮细胞构成，自然萌发率和繁殖率低，目前市场上货源主要来自于野生采挖，产品一直处于供不应求的状况。近年来，随着对其药效学和临床应用研究的深入，对金线莲药用价值的认识进一步提高，其市场货源紧缺的状况更为严峻，野生资源也不断遭到破坏性采挖，以致于处于濒临灭绝之地。本研究旨在采用组织培养技术，解决金线莲种苗来源，加快人工栽培，以保护金线莲野生资源、稳定市场供应。现将有关实验结果如下。? 1??材料与方法? 1.1??材料??无菌繁殖体系的建立为浙江金线莲野生种源，其它实验为继代培养的不定芽及无根幼苗茎段。? 1.2?? 无菌繁殖体系的建立取生长健壮、无病虫害的植株，去叶后放入低浓度的洗衣粉水中漂洗3～5?min，然后用流水冲洗30?min。在超静工作台前，用75%?酒精湿润5～6?s，放入0.1%的HgCl溶液灭菌12～13?min，用无菌水冲洗5～6次。将消毒好的茎按上段（具茎尖）、中段和下段（匍匐茎段）切成长约1.5～2?cm，带有1～2个节间的小段，分别接种于MS+6－BA?4.0?mg/L?+NAA?0.4?mg/L?培养基上，pH5.6，蔗糖 2.5%，琼脂0.7%。培养条件为：温度(25±2）℃?，光照时间12?h/d，光照强度1?500～2?000?lx。? 1.3??不定芽诱导? 1.3.1??基本培养基对不定芽诱导的影响采用单因素实验，培养基选用MS （Murashige-Skoog）［3］，1/2MS（大量元素减半，其他成分不变），VW(Vacin?&?Went)，B5（Gamborg?Miller?&?Ojima）和KC(Knudson?C)等5种，分别添加6－BA?4.0mg/L，NAA?1.0?mg/L。? 1.3.2??激素对不定芽诱导的影响以MS为基本培养基，添加不同种类及浓度的细胞分裂素和生长素。? ????? 上述实验选取无菌健壮植株，切取长约1～1.5?cm，带有一个节间的茎中段，每处理接10个茎节，重复3次。培养期间定时观察不定芽生长情况，培养60?d后统计不定芽数。其它条件同实验“1.2”项。? 1.4??壮苗培养? 1.4.1??激素对幼苗生长和发根的影响以1/2MS为基本培养基，NAA设1～5?mg/L?5个处理，6－BA设0.5，1.0和1.5?mg/L?3个处理，共15个处理。?
芽孢杆菌常用培养基配方 （按理说，该实验的所有培养基都在这了，后红字更为清楚些。。。摘自百度） 一、肉汤琼脂培养基：蛋白胨10g ，牛肉膏15g ，NACL15g ， 蒸馏水1000ml ，琼脂18g 。调节, 灭菌。如果用液体做培养基，则去掉琼脂即可。100 mL/组，其中20 mL液体培养基/250 mL △中（内装玻璃珠10颗）；50 mL固体斜面培养基分装在试管中：5mL/支，10支。 2、或是（J-琼脂培养基：胰蛋白胨5g,酵母膏15g, 磷酸氢 二钾3g,葡萄糖2g, 琼脂20g, 蒸馏水1000ml。调节— 30min灭菌。） 二、过氧化氢酶测定 1、试剂：3-10%过氧化氢 2、接种与培养：一般将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，30度下 培养1-2天。 3、试验方法：取一干净载玻片，在上面加一滴3-10%的双氧水， 挑取1环1-2天的的菌苔，在双氧水溶液中涂抹，如有气泡出 现（O2），作为过氧化氢酶阳性，无泡为阴性。也可以将过氧 化氢液直接加入斜面上，观察气泡的产生。
三、需氧性测定 1、培养基：酪素水解物20g,葡萄糖 10g, ,NACL5g,HOCH2SO3Na1g,HSCH2COONa2g,琼脂15g,蒸馏水1L。调节，分装试管，，30min灭菌，培养基不摆斜面。 2、接种与观察：用一小环的肉汤菌液，穿刺接种到上述培养基中 （穿刺管底），一般与30 度培养3-7天观察结果。若芽孢杆菌在琼脂柱表面生长为好氧菌，沿穿刺线生长则为厌氧菌。 四、酪素水解（用于检测不同种类的芽孢杆菌是否具有分解酪素的 特点） 1、培养基 （1）脱脂牛奶制备取新鲜牛奶，煮沸后去掉上层油脂，再经离心脱脂（3000r/min,10min）,除去上层油脂，即为脱脂牛奶。（2）牛奶平板的制备取50ml的脱脂牛奶放入一只三角瓶中，另外称1.5g琼脂置于含有50ml蒸馏水的另外3只三角瓶中，然后将两液分开灭菌，，带冷至45-50摄氏度时，速将两液混匀倒平板，即为牛奶平板。将平板倒置过夜，使表面水分干燥。 2、接种与观察 将测试菌种以三点法点接在牛奶平板上，一般于30度培养1,3,5,7和14天，如菌落周围和下面呈透明，表明酪素已被分解。
实验一、植物组织培养基母液配制的若干关键环节目的与要求： 熟悉MS培养基的组成，掌握贮备液的配制方法. 植物组织培养（plant tissue culture）是指植物的任何器官、组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化形成完整植株的过程.植物组织培养具有取材少，培养材料经济；人为控制培养条件，不受自然条件影响；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于自动化控制等特点.因而被广泛应用于各种植物的快速繁殖之中. 为了避免每次配制培养基都要对几十种化学药品进行称量，应该将培养基中的各种成分，按原量10倍、100倍或1000倍称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做母液。这样，每次配制培养基时，取其总量的1/10、1/100、1/1000，加以稀释，即成培养液。现将培养液中各类物质制备母液的方法说明如下。 以MS培养基为例，其母液的配制包括大量元素、微量元素、铁盐、维生素、氨基酸、植物生长调节物质和有机附加物等种类.(见表1) 表1 MS培养基母液的配制 成分规定用量 /mg.L-1 扩大倍 数 称取量/ mg 母液定溶 体积/ml 配1LMS培 养基吸取量 /ml 大量元素 KNO3 NH4NO3 MgSO4·7H2O KH2PO4 CaCl2·2H2O 微量元数 MnSO4·4H2O ZnSO4·7H2O 1900 1650 370 170 440 22.3 8.6 20 20 20 20 20 1000 1000 38000 33000 7400 3400 8800 22300 8600 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 50 50 50 50 50 1 1