水中大肠杆菌的检测方法 一、方法概要本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生内生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在351 ℃、483小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释度之水样所产生之结果，以「100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）」表示100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。 二、适用范围本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样中大肠杆菌群之检验。 三、干扰(一)水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。(二)检测使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。 四、设备(一)量筒：100至1000 mL之量筒。(二)吸管：有 0、1刻度之10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。(三)试管：大小约15015 mm之试管或有盖螺旋试管。(四)发酵管（fermentation tube）：大小约229 mm 之玻璃管。(五)稀释瓶：容量约100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。 (六)锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。(七)采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。(八)冰箱：温度能保持在42℃者。(九)天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至0、01 g；待测物重量不大于2 g
时，须能精秤至0、001 g。()培养箱：温度能保持在351℃者。 (一)高压灭菌釜：温度能维持在121℃（压力约15 lb/in2 或1、 1 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。(二)高温干热烘箱：如用于玻璃器皿等用具之灭菌，温度须能保持在160℃达2小时或170℃达1小时以上者。(三)接种环：为白金或镍铬合金制，适用于细菌接种或移植，亦可使用无菌塑料制品。(四)pH计：精确度达0、1 pH单位。 五、试剂(一)试剂水：蒸馏水或去离子水，导电度在25 ℃时小于2 μ mho / cm（μS / cm）。(二)培养基，应使用市售商品化培养基。１、硫酸月桂酸胰化蛋白胨培养基（Lauryl sulfate tryptose broth，简称LST） 1倍浓度LST培养基含有下列成份：胰化蛋白胨（Tryptose） 20、0g乳糖（Lactose） 5、0g氯化钠（NaCl） 5、0g磷酸氢二钾（K2HPO4） 2、75g磷酸二氢钾（KH2PO4） 2、75g硫酸月桂酸钠（Sodium lauryl sulfate） 0、1g试剂水 1L 配成2倍浓度（取 71、2 g LST培养基粉末溶于1 L试剂水），完全溶解后，分取10 mL注入装有倒置发酵管之试管内，经121℃灭菌15分钟，
附件 食品微生物之檢驗方法－阪崎腸桿菌之檢驗 1 適用範圍〆本方法適用於一般食品及奶粉中阪崎腸桿菌之檢驗。 2 檢驗方法〆 2.1 工作環境〆工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為100呎燭光以上，密閉室內換 氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。每15分鐘落菌數不得超過15 CFU／培養皿。 2.2 器具及材料〆 2.2.1 乾熱滅菌器。 2.2.2 高壓滅菌釜。 2.2.3 攪拌均質器（Blender）或鐵胃（Stomacher）〆適用於無菌操作者。 2.2.4 天平〆可稱量到2000 g者，靈敏度為0.1 g々可稱量到120 g者，靈敏度為1 mg。 2.2.5 冰箱〆能維持5 ±3℃者。 2.2.6 吸管或吸管尖〆已滅菌，1 mL吸管應有0.01 mL之刻度々5 mL及10 mL吸管應有0.1 mL 之刻度。 2.2.7 吸管輔助器（Pipette aid）或微量分注器。 2.2.8 稀釋瓶〆160 mL，玻璃、聚乙烯（polyethylene）、鐵弗龍（Teflon）或其他能耐121℃濕熱滅 菌20分鐘以上之塑膠材質，附螺旋蓋。 2.2.9 培養皿〆已滅菌，內徑約9 cm，深度約15 mm，底皿之內外面應平坦，無氣泡、刮傷或其 他缺點。 2.2.10 增菌用容器〆附螺旋蓋之125 mL、250 mL、2 L三角錐瓶或廣口瓶々玻璃、聚乙烯、鐵弗龍 或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之塑膠材質。 2.2.11 pH測定儀。 2.2.12 培養箱〆能維持內部溫度在±1℃以內者。 2.2.13 溫度計〆量測溫度範圍1～55℃，最小刻度0.1℃。 2.2.14 水浴〆加蓋，具水流循環系統，能維持水溫溫差在±0.2℃以內者。
附件 水肠杆菌群检测方法－多管发酵法 NIEA E201.54B 一、方法概要 本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在35 ± 1 ℃、 48 ± 3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释度之水样所 产生之结果，以「100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）」表示100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。 二、适用围 本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样肠杆菌群之检验。 三、干扰 (一) 水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。 (二) 检测使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。 四、设备 (一) 量筒：100至1000 mL之量筒。 (二) 吸管：有0.1刻度之10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。 (三) 试管：大小约150 × 15 mm之试管或有盖螺旋试管。 (四) 发酵管（fermentation tube）：大小约22 × 9 mm之玻璃管。 (五) 稀释瓶：容量约100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。 (六) 锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。 (七) 采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。 (八) 冰箱：温度能保持在4 ± 2℃者。 (九) 天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至0.01 g；待测物重量不大于2 g时，须能精秤至0.001 g。 (十) 培养箱：温度能保持在35 ± 1℃者。 (十一) 高压灭菌釜：温度能维持在121℃（压力约15 lb/in2或 1.1 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。
PITC/JJ01-WJ-0005/1-1 食品中阪崎肠杆菌原始记录 样品编号：样品名称： 样品状态：□定型包装□散装□液态□固态 收样日期：检验日期： 检验项目/方法：阪崎杆菌GB 4789.40-2010 仪器设备：恒温箱（36℃）PITC-411WJ-148 恒温箱（44.5℃）PITC-403WJ-140 恒温箱（30℃）PITC-221WJ-104 恒温箱（26℃）PITC-221WJ-104 ATB微生物鉴定仪PITC-171 步骤过程结果 前增菌 阳对：□NG □G 取检g/mL加入 900mL以预热44℃的缓 冲蛋白胨水增菌液中混 匀℃培养h 空白：□NG □G 样品-1：□NG □G 样品-2：□NG □G 样品-3：□NG □G 样品-4：□NG □G 样品-5：□NG □G 增菌 阳对：□NG □G 移取1mL处理液转种于 10mL mLST-Vm肉汤 ℃培养h 空白：□NG □G 样品-1：□NG □G 样品-2：□NG □G 样品-3：□NG □G 样品-4：□NG □G 样品-5：□NG □G 分离分别划线接种2个阪崎 显色平板 ℃培养h 阳对：□NG □G 空白：□NG □G 样品-1：□NG □G典型菌落特征按照产品 说明进行判定。 样品-2：□NG □G 样品-3：□NG □G 样品-4：□NG □G 样品-5：□NG □G 挑取1~5个可疑菌落划线接种于TSA平板 ℃培养h 阳对：□NG □G 空白：□NG □G 样品-1：□NG □G典型菌落为黄色菌落。样品-2：□NG □G 样品-3：□NG □G 样品-4：□NG □G 样品-5：□NG □G 生化鉴定 结果报告（每100g或每100 mL）样品-1样品-2样品-3样品-4样品-5 □ND □D□ND □D□ND □D□ND □D□ND □D 注：G生长 NG不生长 D检出 ND 未检出 检验者：校核者：完成日期：
菌落总数和大肠菌群测定（固体样品） 药品： 1、平板计数琼脂 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST） 3、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 4、氯化钠 设备材料： 烧杯、三角瓶、广口瓶、培养皿、刻度吸管、倒气管、玻璃 棒、试管、硅胶塞、洗耳球、棉花、布或报纸等。 一、准备工作 （指导书是按一个样品所需物品准备的，实验室可按样品量增加） 1、平板计数琼脂培养基准备----用于菌落总数测定 将三角瓶放在电子称上，去皮，按平板计数琼脂使用说明称量，加 200ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸加热煮沸，充分溶解，盖上硅胶塞，用报纸或布包好，再用橡皮筋扎紧。 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤----用于大肠菌群测定 （a）将烧杯放在电子称上，去皮，按使用说明称量，加100ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸，充分溶解。 （b）用10ml（毫升）的吸管分装到9支（18*180规格）试管中，每支试管加10ml的月桂基溶液LST （合计90毫升）。 （c）9支试管分别放入倒气管（开口向下），排气，盖上硅胶塞。
3、0.85%的生理盐水----用于样品稀释 将广口瓶去皮，称取氯化钠1.91g加225ml蒸馏水，摇匀，用报纸 或布包好，再用橡皮筋扎紧；同样配制第二瓶。 4、准备2个空试管，盖上硅胶塞----用于样品稀释。 5、准备8个培养皿，用布包扎好。 6、准备至少3支5ml和1支10ml带有刻度的吸管，用布包扎好（顶部可用棉球塞住，防止吸液时，液体不慎吸入洗耳球）。 7、准备操作的工具：剪刀1把、镊子1个、勺子等打开产品包装所需工具，用布包扎好。 二、使用灭菌锅灭菌 1、检查灭菌锅底部加热管水位是否正常，水位要高过加热丝。 2、将上面准备好的7步骤物品逐一放入锅内，注意：滴定管吸口向下，有棉球的向上。 3、盖上火菌锅盖子时，将排气管插到排气口内，注意从对角线开始拧紧螺丝，将排气阀打开（安全阀始终关闭），通电后，待排气阀放气3分钟后（锅内冷空气已经排完），关闭排气阀。 4、查看灭菌锅的压力表，当温度升到121°，压力升到0.1MP（兆帕）时，灭菌维持15分钟后（温度和压力不能过高或者过低），断电自然冷却到接近“ 0”度后，慢慢打开排气阀，再对角拧开灭菌锅。 三、无菌操作 进无菌室前的准备：放好工具（酒精灯，记号笔，消毒用75%酒精棉球，洗耳球，电子称），打开紫外线杀菌灯，杀菌30分钟后关闭，再等
研究报告 奶粉中阪崎肠杆菌PCR检测方法研究 高旗利 张 霞 罗茂凰 张海滨 张海英 姚 霞 张宏伟(天津出入境检验检疫局,天津塘沽,300456) 刘 寅 黄熙泰 (南开大学,天津,300071) 摘 要: 目的 建立和提出奶粉中阪崎肠杆菌PCR检测方法。 方法 利用细菌16S和23S rDNA的保守区作为通用引物,对6株阪崎肠杆菌16S~23S rDNA间区序列(ISR)进行了扩增和测序,在比较阪崎肠杆菌与其近源株16S1~23S rDNA间区序列的基础上,设计了11条阪崎肠杆菌PCR检测引物,组合成30对PCR引物并筛选出一对阪崎肠杆菌PCR检测的特异性引物,建立了奶粉中阪崎肠杆菌PCR检测方法。 结果 用10株阪崎肠杆菌,18株近源菌验证试验表明,本文所建立的PCR方法特异性强;加菌试验表明,奶粉样品中阪崎肠杆菌检测低限为2.2~5.4cfu/100g,灵敏度高;新建的PCR方法与FDA BAM方法比较试验表明,两种方法的检测结果完全符合。 结论 本文提出的奶粉中阪崎肠杆菌PCR检测方法填补了国内空白,达到了国际先进水平,可在实际工作中推广。 关键词:奶粉;阪崎肠杆菌;PC R DETECTION OF Enterobacter sakazakii FROM D EHYDRATED POWDERED MILK BY PCR Gao Qili,Zhang Xia,Luo M aohuang,Zhang Haibin Zhang Haiying,Yao Xia,Zhang Hongwei. (Tianji n Exit-Entry Inspection and Quaran tine Bureau,T ianjin,300456) Liu Yin,Huang Xitai (Tianjin Nankai University,T ianjin,300071) Abstract:[Objective] To establish a PCR method for detection of Enterobacte r saka z a kii in dehydrated powdered milk.[Method] T he conserved sequences in16S rRNA and23S rRNA genes of bacteria were used as a pair of universal pri mers to amplify the16S-23S in terspacer region of6strains of Ente r obacter saka z a kii.On the basis of comparative sequence analysis of the16S-23S interspacer regions,11primers were designed and30pairs of these pri mers were combined so that a pair of pri mers specific for Enterobacte r saka z a kii was screened out.Even-tually,we established the PCR method for detection of dehydrated powdered milk from dehydrated powdered milk.[Result] The PCR method established in this article is hi ghly specific and sensitive for detection of Ente r obacter saka zakii through the testing of10strains of En-te robacter sakazakii and18strains of other relative bacteria and artificial inoculation.The sensi tivity can reach to2.2~5.4cfu/100g.[Conclu-sion] This PCR method,which fills the domestic blank and reaches to international advanced level,should be generalized and applied to routine detection. Key words:Dehydrated powdered milk;Enterobacter saka z akii;PCR 1 前言 阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii),又名黄色阴沟肠杆菌,为肠杆菌科肠杆菌属的一个种,1980年改名为阪崎肠杆菌[1]。Urmenyi and Franklin两位科学家在1961年首次报道了由该菌引起的两例脑膜炎病例,随后在全球范围内相继出现了由阪崎肠杆菌引起的脑膜炎、败血症和坏死性小肠结肠炎的报道。2001年4月,在美国某医院新生儿重症监护室,一早产儿发烧、心动过速,脑脊液培养发现阪崎肠杆菌,诊断为脑膜炎,用抗生素治疗无效,9天后死亡,扩大检查该院49名婴儿的粪便和尿液,发现10人为阪崎肠杆菌阳性,其原因是使用了某批Portagen的婴儿配方奶粉,而且在该批奶粉中也检查出了阪崎肠杆菌,结果导致Portagen婴儿配方奶粉于2002年4月被召回[2]。1998年,在比利时有12名婴儿因哺喂同一牌号的婴儿配方奶粉而发生小肠结肠坏死,在这些婴儿的粪便和该批奶粉中同时分离出阪崎肠杆菌,当停用该批奶粉后,未有新的病例发生[3]。从大多数病例看,阪崎肠杆菌主要危害婴儿,也有小部分成人感染骨髓炎和菌血症的报道,虽然有抗生素的治疗,但总体死亡率高达80%[4]。目前,该菌感染源头还不十分清楚,但多数报告表明奶 作者简介:高旗利(1964-),男,毕业于南开大学,硕士,已发表论文20余篇。 本研究为科技部农社司2003DIA6N002-002和天津出入境检验检疫局TK005-2003项目资助。 4
食品微生物检验技术课程综述 大肠杆菌的检测（MPN计数法） 院系：食品科学与药学学院 班级：食科114 姓名：张花 学号： 114031431 组长：张军玲 成员：张花 赵晶郁 朱娟娟 大肠杆菌Petrifilm测试片计数法 摘要 食品检测是反映食品加工、贮藏、运输、等环节的卫生与安全状况的重要手段，而大肠菌群检测则是食品检测的重要指标均之一。根据定义大肠菌群是在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和碱性厌氧的革兰氏阴性芽胞杆菌。其主要检测意义在于反映食品卫生状况并推测其在肠道致病菌的可能性。Petrifilm大肠菌群测试片是由美国3M生产的一种预先制备好的VRB平板培养基系统，并添加了TTC作为菌落指示剂便于菌落判读，而上层薄膜可以起到对大肠菌群发酵产生的气体截留的作用。该方法目前已被多数权威机构认可，并在国内很多实验室开展运用。 关键词大肠杆菌 Petrifilm测试法
1设备和材料 1.1恒温培养箱：36±1℃。 1.2冰箱2~5℃。 1.3恒温水浴箱:44.5±0.2℃。 1.4天平：感量0.1g。 1.5均质器 1.6振荡器。 1.7无菌吸管：lmL(具0.01 mL刻度)、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。 1.8无菌锥形瓶：容量500mL。 1.9 玻璃珠:直径约5mm。 1.10pH计或pH比色管或精密pH试纸 1.11试管架。 2. 培养基和试剂 2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（ LST ）肉汤。 2.2EC肉汤。 2.3蛋白胨水。 2.4缓冲葡萄糖蛋白胨水（MP-VP实验用）。 2.5磷酸盐缓冲液。 2.6无菌生理盐水:称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高 压灭菌15min。 2.71mol/L氢氧化钠（NaOH ) ：称取40g 氢氧化钠溶于1000ml蒸馏
《饲料中阪崎肠杆菌活菌的检测 EMA-PCR法》河南省地方标准编制说明 一、编制的目的和意义 阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazaii）是一种革兰氏阴性、周生鞭毛、能运动、无芽孢的兼性厌氧细菌，属条件性致病菌。自1961年，英国首次报道2例由阪崎肠杆菌引起的脑膜炎病例以来，相继在美国、加拿大、比利时等国家报道了新生儿阪崎肠杆菌感染事件。国际食品微生物标准委员会(ICMSF)在2002年将阪崎肠杆菌列为“严重危害特定人群生命、引起长期慢性实质性后遗症的一种致病菌”。阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，并且可能引起神经系统后遗症和死亡，在某些情况下，由阪崎肠杆菌引发疾病而导致的死亡率可达40%～80%。因此，对阪崎肠杆菌活菌建立快速、特异、灵敏的检测标准对于该菌的早期发现及传播的有效控制至关重要。 目前阪崎肠杆菌的检测方法较多，主要有传统培养方法和分子生物学方法。我国目前采用传统的细菌学方法，检测时间需要一周左右，费时费力；分子生物学方法虽然快速，灵敏，但不能区分死菌与活菌，而死菌DNA的存在容易导致假阳性问题。本研究以阪崎肠杆菌16S rDNA保守序列为靶基因设计一对特异性引物，采用EMA与PCR结合的方法进行检测，能够有效地区分阪崎肠杆菌的死菌与活菌，避免了因死菌DNA存在造成的假阳性结
果，同时减去了传统培养方法中目标菌分离纯化的步骤，节约了大量检测时间。本次研究结果显示，PCR检测阪崎肠杆菌的灵敏度在1.0×102 cfu/mL左右，从样品处理、预增菌、PCR扩增、凝胶电泳只需要48h左右，与传统培养方法相比，稳定性好、灵敏度高、特异性强，可用于检测饲料中阪崎肠杆菌的污染状况，对饲料的安全监测具有重大意义。 二、任务来源及编制原则和依据 1、任务来源 根据河南省质量技术监督局文件《河南省质量技术监督局关于下达2017年第一批河南省地方标准制修订计划的通知》（豫质监标发…2017?104号）的要求，由河南省兽药饲料监察所负责对河南省地方标准《饲料中阪崎肠杆菌活菌的检测EMA-PCR法》（立项编号：20171210482）的起草、制定工作。 2、编制原则 符合国家法律、法规和政策，本着严格遵循科学依据，与国际水平接轨，并且准确、实用、快速的原则，开展了本次研究工作。 3、编制依据 主要依据以下标准：GB 4789.40-2016 食品微生物学检验克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验；GB 19489 实验室生物安全通
附件 水中大肠杆菌群检测方法－多管发酵法 NIEA E201.54B 一、方法概要 本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生内生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在35 ± 1 ℃、48 ± 3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释 度之水样所产生之结果，以「100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）」表示 100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。 二、适用范围 本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样中大肠杆菌群之检验。 三、干扰 (一) 水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。 (二) 检测使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。 四、设备 (一) 量筒：100至1000 mL之量筒。 (二) 吸管：有0.1刻度之10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。 (三) 试管：大小约150 × 15 mm之试管或有盖螺旋试管。 (四) 发酵管（fermentation tube）：大小约22 × 9 mm之玻璃管。 (五) 稀释瓶：容量约100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。 (六) 锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。 (七) 采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。 (八) 冰箱：温度能保持在4 ± 2℃者。 (九) 天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至0.01 g；待测物重量不大于2 g时，须能精秤至0.001 g。 (十) 培养箱：温度能保持在35 ± 1℃者。
(十一) 高压灭菌釜：温度能维持在121℃（压力约15 lb/in2或 1.1 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。 (十二) 高温干热烘箱：如用于玻璃器皿等用具之灭菌，温度须能保持在160℃达2小时或170℃达1小时以上者。 (十三) 接种环：为白金或镍铬合金制，适用于细菌接种或移植，亦可使用无菌塑料制品。 (十四) p H计：精确度达0.1 pH单位。 五、试剂 (一) 试剂水：蒸馏水或去离子水，导电度在 25 ℃时小于2 μ mho / cm（μS / cm）。 (二) 培养基，应使用市售商品化培养基。 １、硫酸月桂酸胰化蛋白胨培养基（Lauryl sulfate tryptose broth，简称LST） 1倍浓度LST培养基含有下列成份： 胰化蛋白胨（Tryptose）20.0g 乳糖（Lactose） 5.0g 氯化钠（NaCl） 5.0g 磷酸氢二钾（K2HPO4） 2.75g 磷酸二氢钾（KH2PO4） 2.75g 硫酸月桂酸钠（Sodium lauryl sulfate）0.1g 试剂水1L 配成2倍浓度（取71.2 g LST培养基粉末溶于1 L试剂水），完全溶解后，分取10 mL注入装有倒置发酵管之试管内，经121℃灭菌15分钟，冷却后备用，灭菌后培养基之pH值应在 6.8 ± 0.2。 灭菌后培养基若未当日使用，应保存在4 ± 2℃，保存期限为14天。可根据检验需求量，依配方配 制培养基。 ２、煌绿乳糖胆汁培养基（Brilliant green lactose bile broth，简称BGLB） 1公升的BGLB 培养基中含有下列成份：
大肠菌群及检验 一、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。 大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工
作中。 二、大肠菌群检验方法： 由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。 目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。 （一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。 乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。 分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。 证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。 报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。
大肠杆菌检测方法的研究 大肠杆菌是人和动物肠道中的常居菌，在食品卫生质量的评价和控制中，通常将其作为指示菌来评价食品粪源性污染的程度。本文简述了大肠杆菌的传统检测方法-滤膜法、多管发酵法、平板计数法等技术，以及一些快速方法-酶底物法、聚合酶技术，这些方法应用缩短了检测流程和时间，为在大工业生产中微生物控制提供了具有时效性的检测技术。 标签：大肠杆菌检测技术食品安全 0 引言 大肠杆菌又称大肠埃希氏菌（Escherichia coli），在1885年由德国细菌学家Theodor Escherich分离出来的，其属于细菌域、变形菌门、γ—变形菌纲，能够在人和动物的肠道中正常寄居，随着人和动物的粪便排出体外。其中五种肠毒素性大肠杆菌与人类疾病相关：肠毒素性、致病性、出血性、侵袭性和粘附性大肠杆菌。乳品中大肠杆菌一旦被检测出，就意味着其受到直接或间接的污染。因此，该菌很早就已经被用作食品粪源性污染的卫生学指标，并相应的出现了大量的检测方法。本研究介绍以往采用的传统方法，及目前所使用的新检测技术。 1 大肠杆菌的生物学特性及其致病性 1.1 生物学特性 大肠杆菌体积约为0.6-0.7μm3两端钝圆的短杆菌，有时会近似球状菌。有些菌株有荚膜或微荚膜，无芽孢，含有4-6根鞭毛，会游动，长有菌毛。该类菌是需氧或兼性厌氧性菌，最适生长温度为37摄氏度。属于单细胞微生物，其结构特点为：细胞壁、细胞膜、细胞质和核质。细胞壁的内测是细胞膜，细胞壁主要由肤聚糖和外部膜结构组成，具有坚韧而富有弹性的膜状结构；细胞膜主要是由磷脂及蛋白质组成；细胞质是细菌进行新陈代谢的场所，含有蛋白质、脂类、水、核酸等物质成份。 1.2 致病性 大肠杆菌一般没有致病性，但当大肠杆菌的菌落数超过人体自身的承受能力时就可能产生疾病隐患。婴儿感染大肠杆菌可能引起新生儿脑膜炎，老人以及免疫力低下的人群可能会引起败血症等疾患；肠道感染时会出现如水泻、带血腹泻、腹绞痛、发烧、呕吐等，严重时，可并发急性肾炎；如果肠道以外的器官被大肠杆菌感染，则可能引起人体肠胃炎、尿道炎、膀胱炎、阑尾炎等。 2 测定方法 传统检测方法：多管发酵法、比浊法、稀释平板计数法等；其特点：不具时
LAMP法和PCR法对阪崎肠杆菌快速检测的对比探究 目的：研究LAMP法和PCR法在阪崎肠杆菌快速检测中的差异，指导临床在阪崎肠杆菌快速检测中方法的选择。方法：针对阪崎肠杆菌的OmpA基因，设计相关特异性引物，分别建立LAMP法和PCR法两种检测方法体系对其进行检测，并对两种检测方法的灵敏度进行记录比较；分别采用两种方法对45株阪崎肠杆菌近源菌进行检测，分析比较两种方法的特异性；最后采用两种方法对60份商场奶粉样品进行检测，将检测结果与FDA检测结果进行比较分析。结果：两种检测方法的灵敏度检测结果显示：LAMP法对阪崎肠杆菌快速检测的敏感度（101 cfu/ml）明显高于PCR法（102 cfu/ml），两者比较差异有统计学意义（P ＜0.05）；在对45株阪崎肠杆菌近源菌的检测中，显示LAMP法有5株阪崎肠杆菌出现阳性结果，而PCR法则显示非特异性条带，表明LAMP法检测的特异性明显优于PCR法。结论：LAMP法对阪崎肠杆菌快速检测有效可行、灵敏度高、特异性强，是临床进行阪崎肠杆菌快速检测的一种有效方法。 标签：LAMP；PCR；阪崎肠杆菌 阪崎肠杆菌是肠杆菌科的一种，是奶粉（乳）制品中新发现的一种致病菌。由其可引发婴儿各种疾病，致病机制可能与其侵入、诱导凋亡及肠毒素作用有关[1]。对于阪崎肠杆菌的检测，最新研究发现LAMP法对阪崎肠杆菌快速检测，灵敏度高、特异性强[2]。笔者所在医院应用LAMP法和PCR法对阪崎肠杆菌快速检测的进行对比探究，现报道如下。 1 资料与方法 1.1 菌株标本 所研究的菌株共60株，其中2株阪崎肠杆菌标准菌株是由广东省微生物研究所提供的ATCC51329和ATCC29544，8株阪崎肠杆菌野生菌株是采用FDA 传统手段从商场奶粉或果汁中提取出来的；其余在试验中用到的菌株均为本实验室自己保存。 1.2 仪器 细菌基因组DNA抽提试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司），Bst DNA Polymerase（美国NEB公司），betaine（美国Sigma公司），agarose（Promega），DK28D型电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司），PCR仪：PTC-200型；美国Bio-rad公司，EPS301电泳仪（瑞典Amersham公司）。 1.3 方法 采用LAMP法和PCR法对阪崎肠杆菌进行快速检测具体分为以下步骤。
大肠杆菌的检验方法 样品制备： 以无菌操作取25 g样品,放入装有225 mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000 r/min均质1～2min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。 稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**-4……。从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。 LST和EC初步筛选： 对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL。将接种管置于36±1℃培养48±2h。 观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生,用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养48±2h。 EMB平板： 取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,36±1℃培养24±2h。 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃培养18～24h。 生化试验： 将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。 1 色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。 2 MR-VP培养基：在36±1℃培养48±2h。以无菌操作移取培养物1 mL至 13mm×100mm试管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。 将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5 滴甲基红溶液。如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。 3 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长。 4 LST肉汤：于36±1℃培养48±2h,观察试管中是否产气。 5 革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。 大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：
大肠杆菌及菌落总数检测方法 为了对鸡精产品的微生物指标进行有效的控制，对微生物的检测就显的十分重要。 下面是鸡精产品的大肠杆菌及菌落总数实验检测方法。 一、大肠杆菌： 1）培养基准备（以3.5g乳糖胆盐发酵琼脂为例） 双料试管配制 A、用量杯量取加热的100ML蒸馏水（实验前需对蒸馏水进行高压灭菌处理，处理方法详见注一）。 B、用0.1g称量天平秤取7g乳糖。 C、将A、B混合均匀，并用10ml吸管各取10ml混合液分别注入三根装有小导管的试管中（此三根为双料试管，即双倍原料）。 单料试管配制 A、用量杯量取加热的100ML蒸馏水（实验前需对蒸馏水进行高压灭菌处理，处理方法详见注一）。 B、用0.1g称量天平秤取3.5g乳糖。 C、将A、B混合均匀，并用10ml吸管各取10ml混合液分别注入六根装有小导管的试管中（此六根为单料试管，即单倍原料）。 2）将配制好的试管放入灭菌锅进行115℃进行灭菌10min。3）将灭菌过后的试管放置在无菌室，常温保存一周。
4）若要对生产的样品检测其大肠杆菌，其步骤如下：A、量取灭菌后的蒸馏水225ml加温后与25g样品混合均匀。（样品需要在无菌室中，有封盖的塑料杯中进行混合） B、取三个玻璃培养皿，分别标上-1、-2、-3标记。 C、取两根新试管取9ml蒸馏水分别标为a、b。 D、用吸管吸取1ml样品液体，注入-1培养皿中，并盖上盖子。 E、用吸管吸取1ml样品液体，注入a试管中，记为-2培养基液。 F、用吸管吸取1ml a试管中的液体，注入到b试管中，记为-3培养基液。 G、用1ml吸管取样品液体分别注入3根单料试管中，用10ml吸管取样品液体分别注入双料试管中 H、用1ml吸管取-2培养试管液体，分别注入到单料试管中。 I、装好液体的试管，用试管塞封好，放到36℃±1℃的恒温培养箱中24小时培养。 J、24小时培养后，取出并用肉眼观察试管的颜色及冒气泡情况，若有其中的任意状况，说明有大肠杆菌，需要通过美兰做进一步的检测。 二、菌落总数的测定 1、取平板计数琼脂23.5g与100ml灭菌后的蒸馏水混合均
备案号： ICS SN 中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前 言 SN/T XXXX－XXXX《食品中多种致病菌快速检测－PCR方法》分为十一个部分： ─ 第 1 部分：食品中沙门氏菌检测方法； ─ 第 2 部分：食品中志贺氏菌检测方法； ─ 第 3 部分：食品中金黄色葡萄球菌检测方法； ─ 第 4 部分：食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌检测方法； ─ 第 5 部分：食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法； ─ 第 6 部分：食品中空肠弯曲菌检测方法； ─ 第 7 部分：食品中肠出血性大肠埃希氏菌 O157:H7检测方法； ─ 第 8 部分：食品中副溶血性弧菌检测方法； ─ 第 9 部分：食品中霍乱弧菌检测方法； ─ 第 10 部分：食品中创伤弧菌检测方法； ─ 第 11 部分：食品中阪崎肠杆菌BAX?全自动PCR检测方法。 本标准修改采用Government of Canada Laboratory Procedure MFLP-27 THE DUPONT QUALICON BAX?1） SYSTEM METHOD FOR THE DETECTION OF ENTEROBACTER SAKAZAKII IN SELECTED FOODS （2003.9）本标准的附录A是资料性附录。 本标准由国家认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 本标准起草人：卢行安等。 本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 1） 为美国杜邦公司（DuPont Qualicon）产品。
食品中多种致病菌快速检测－PCR方法 第11部分：食品中阪崎肠杆菌BAX?全自动PCR检测方法 1 范围 本部分规定了用BAX?全自动PCR技术快速检测阪崎肠杆菌的方法。 本部分适用于食品中阪崎肠杆菌的检验。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 ISO TC 34/SC 5 N: Milk and milk products-Detection of Enterobacter sakazakii. FDA/BAM 2002 “Isolation and Enumeration of Enterobacter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant Formula”. GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 WS/T 230 临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用。 3 防污染措施 参照标准《临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用》(WS/T 230)中 6：污染的预防和控制。 4 定义和缩略语 4.1 PCR：(polymerase chain reaction)聚合酶链反应，简称PCR。 4.2 阪崎肠杆菌 Enterobacter sakazakii 阪崎肠杆菌为肠杆菌科肠杆菌属革兰氏阴性无芽孢杆菌，周身鞭毛有动力，大多数产黄色素，具有ɑ-葡萄糖苷酶活性，生化特征与阴沟肠杆菌相似，但不发酵D－山梨醇。 5 原理 BAX?阪崎肠杆菌检测系统是应用PCR技术检测食品中的阪崎肠杆菌的自动方法。自动化的BAX?系统的检测对象是阪崎肠杆菌特有的一段DNA片段。只需要很微量的阪崎肠杆菌，BAX?系统的PCR技术就可以扩增出目的DNA片段。目的DNA与DNA聚合酶、核苷酸以及特异于特定核苷酸序列的引物混和在一起。混合物接着进行一系列定时的加热和冷却循环。加热变性DNA，将DNA分离成单链。当混合物冷却时，引物识别目的DNA序列并与之结合。然后，DNA聚合酶利用核苷酸延伸引物，从而产生两个拷贝的目的DNA片段。重复变性、退火和延伸循环可以使目的DNA片段的量呈指数级增长。 一旦扩增反应开始，BAX?系统PCR片剂中的荧光染料就会与双链DNA结合，光照时发出荧光信号。扩增反应后，BAX?系统开始检测，接着自动化的BAX?系统利用荧光检测来分析PCR产物，从而得到阳性或阴性结果。 BAX?系统通过将引物、聚合酶、核苷酸和阳性对照制成片剂放入PCR管中简化了整个过程。另外，自动化的荧光检测使得检测不用开盖，排除了扩增DNA受到污染的可能。
食品微生物之检验方法－阪崎肠杆菌之检验 1 适用范围：本方法适用于一般食品及奶粉中阪崎肠杆菌之检验。 2 检验方法： 2.1 工作环境：工作平台须宽敞、洁净、光线良好，操作平台光度为100呎烛光以上，密闭室内换气良好，尽可能没有灰尘及流动空气。每15分钟落菌数不得超过15 CFU／培养皿。 2.2 器具及材料： 2.2.1 干热灭菌器。 2.2.2 高压灭菌釜。 2.2.3 搅拌均质器（Blender）或铁胃（Stomacher）：适用于无菌操作者。 2.2.4 天平：可称量到2000 g者，灵敏度为0.1 g；可称量到120 g者，灵敏度为1 mg。 2.2.5 冰箱：能维持5 ± 3℃者。 2.2.6 吸管或吸管尖：已灭菌，1 mL吸管应有0.01 mL之刻度；5 mL及10 mL吸管应有0.1 mL 之刻度。 2.2.7 吸管辅助器（Pipette aid）或微量分注器。 2.2.8 稀释瓶：160 mL，玻璃、聚乙烯（polyethylene）、铁弗龙（Teflon）或其它能耐121℃湿热灭菌20分钟以上之塑料材质，附螺旋盖。 2.2.9 培养皿：已灭菌，内径约9 cm，深度约15 mm，底皿之内外面应平坦，无气泡、刮伤或其它缺点。 2.2.10 增菌用容器：附螺旋盖之125 mL、250 mL、2 L三角锥瓶或广口瓶；玻璃、聚乙烯、铁弗龙或其它能耐121℃湿热灭菌20分钟以上之塑料材质。 2.2.11 pH测定仪。 2.2.12 培养箱：能维持内部温度在± 1℃以内者。 2.2.13 温度计：量测温度范围1～55℃，最小刻度0.1℃。 2.2.14 水浴：加盖，具水流循环系统，能维持水温温差在± 0.2℃以内者。 2.2.15 接种针及接种环（直径约3 mm）：镍铬合金、铂铱或铬线材质，或可抛弃式者。 2.2.16 曲玻棒：可灭菌者，直径3～4 mm，涂抹区域45～55 mm。 2.2.17 试管：10 × 100 mm，13 × 100 mm，13 × 120 mm，15 × 150 mm，16 × 150 mm试管，或其它适用者。 2.2.18 旋涡混合器（Vortex mixer）。 2.2.19 显微镜：能放大至1000倍以上之一般光学显微镜。 2.2.20 载玻片及盖玻片：适用于染色及镜检用。 2.2.21 研钵、杵。 2.2.22 药勺、剪刀、小刀、镊子：可灭菌。 2.2.23 滤纸及褐色试药瓶。 2.2.24 无菌滤膜：孔径0.45 μm或以下之亲水性醋酸纤维膜。 2.2.25 杜兰发酵管（Durham fermentation tube）：外径9 × 22 mm或其它适用者。 2.2.26 试药：氯化钠、硫酸月桂酸钠（sodium lauryl sulfate）、胆盐No. 3（bile salts No. 3）、中性红（neutral red）、结晶紫（crystal violet）、柠檬酸铁铵（ferric ammonium citrate）、脱氧胆酸钠（sodium desoxycholate）、硫代硫酸钠（sodium thiosulfate）、草酸铵（ammonium