基因芯片技术研究进展

０．５～３ｋｂ １５～２０ｋｂ
ｍＲＮＡ 表达谱分析
＋＋
＋＋
区分基因型
－
＋＋
检测剪接变异体
－
＋＋
点阵一致性
－
＋＋
目前应用
＋
＋＋＋
批量生产一致性
－
＋＋
芯片成本
适中
较高
长寡核苷酸芯片 ４５～７０ｋｂ ＋＋ ＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋ 较低
５ 基 因 芯 片 的 应 用 基因芯片技术以一 种 全 新、系 统 的 科 研 思 维 方 式 研 究 生
题［９］。在人类基因组 中 只 有 大 约 ５％ 的 序 列 表 达 ，通 过 直 接 测序等手段来了解功能基因相当费时、费力，而应用基因芯 片 进行的基因表达水平检测，可自动、快速地检测出成千上万 种 基因的表达状况，大大提高了基因表达研究的效率，为疾病 的 诊断和治疗提供了有益的保障。在利用基因芯片技术检测表 达水平的时候看家基 因 的 选 择 极 其 重 要，是 否 选 择 了 一 个 突 变率低表达稳定的基因作为看家基因将决定试验的成败。基 因芯片检测表达水平 一 般 采 用 平 行 对 比 的 方 法 ，至 今 已 在 细 菌、酵母菌、植物、哺乳 动 物 等 方 面 进 行 了 研 究。 现 在 这 种 方 法已经成功地被用于进化研究，药物、毒物或各种因素对机 体 的影响等方面 的 研 究。 在 ＨＧＰ 完 成 之 后，用 于 检 测 在 不 同 生理、病理条件下的人 类 所 有 基 因 表 达 变 化 的 基 因 组 芯 片 已 为期不远。 ５．３ 检测基因突变和 基 因 组 的 多 态 性 有 关 实 验 结 果 已 经 表明 ＤＮＡ 芯片技 术 可 快 速、准 确 地 研 究 大 量 患 者 样 品 中 特 定基因所有可能的杂 合 变 异。Ｈａｃｉａ等 用 含 ９６０００ 个 寡 核 苷 酸探针 的 基 因 芯 片 来 检 测 遗 传 性 乳 腺 癌 和 卵 巢 癌 基 因 ＢＲＣＡ１第１１个外显子３．４５ｋｂ 长 度 内 的 所 有 可 能 的 杂 合 性 突 变（ＬＯＨ），其 准 确 率 达 ９９％［１０］。Ｋｕｒｇ等 以 ［１１］ 寡 核 苷 酸 阵 列为基础，将地中 海 贫 血 病 人 的 ＤＮＡ 的 ５ ˊ 端 固 定 在 玻 片 上，经 ＰＣＲ 扩增，加入四种荧光素标记的双脱氧 核 苷 酸，通 过 颜色的改变检测突变 取 得 成 功，并 提 出 该 法 可 以 高 可 信 度 检 测 杂 交 突 变 ，用 于 ＤＮＡ 的 突 变 分 析 和 多 态 性 分 析 。 ［１０］ 田 振 军 等 应 ［１２］ 用ｃＤＮＡ 基 因 芯 片 对 安 静 对 照 组 和 运 动 性 心 肌 肥 大组小鼠心肌组织的 基 因 表 达 差 异 进 行 筛 选，结 果 证 明 具 有 显著性表达差 异 的 基 因 有 ７１ 条，其 中 上 调 表 达 的 基 因 有 ３７ 条，下调表达的基因 有 ３４ 条，证 实 了 运 动 性 心 肌 肥 大 相 关 基 因 的 多 样 性 。林 嘉 颖 等 以 ［１３］ １０ 例 肺 腺 癌 组 织 标 本 为 材 料 ， 与含有１３８２４个寡核苷 酸 探 针 的 基 因 芯 片 进 行 杂 交，发 现 了 １１９条与肺腺癌 发 生 发 展 有 关 的 基 因，这 些 基 因 可 作 为 肺 腺 癌分子靶的候选基因。随着遗传病与癌症相关基因发现数量 的增加，检测基因突变 和 基 因 组 的 多 态 性 对 于 疾 病 的 早 期 发 现与防治具有重要意义。 ５．４ 基因诊断 从正 常 人 的 基 因 组 中 分 离 ＤＮＡ 并 与 ＤＮＡ 芯片上的方阵杂交，就可得到标准图谱，从病人基因组中分 离 出 ＤＮＡ 并与方阵 杂 交 就 可 得 到 病 变 图 谱 。 比 较、分 析 这 两 种图谱就能得出病变的 ＤＮＡ 信 息 并 进 行 治 疗。 以 往 诊 断 疾 病主要依据患者的临 床 表 现 和 既 往 史，但 这 不 能 区 分 一 些 重 要的亚型。利用基因 芯 片 的 特 点，检 测 病 变 组 织 中 特 征 性 基 因的变 化，为 疾 病 的 早 期 诊 断 和 分 型 开 辟 了 一 个 新 的 领 域 。 ［１４］ 这种基因芯 片 诊 断 技 术 以 其 快 速 、高 效 、敏 感 、经 济 、 平行化、自动化等特点，将成为现代化的诊断新技术。例如 膀 胱癌，就缺乏一种理想 的 免 疫 组 织 学 或 分 子 标 志 物 来 区 分 亚 型。丹麦的 Ｄｙｒｓｋｊｏｔ等用基因芯片检测了４０例膀胱癌组织， 将其分为三期：Ｔａ期、Ｔ１期和 Ｔ２～４期。并选出３２个 基 因， 可以明确地区分良性 膀 胱 癌 和 肌 肉 侵 入 性 膀 胱 癌 ，和 病 理 学 分期密切相 关 。 ［１５］ 美 国 Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ 公 司 生 产 的 检 测 逆 转 录 酶基因的 ＨＩＶ 芯片，可 以 判 断 被 检 查 者 是 否 携 带 艾 滋 病 毒， 还有诊断有无药物代谢缺乏症的细胞色素 ｐ４５０芯片，以及 检 测核磷蛋白基因（ｐ５３）是否突 变 来 判 断 癌 症 的 芯 片 。 ［１６］ 许 多 疾病（传染病、遗传 病、肿 瘤、心 血 管 疾 病 等）都 与 基 因 突 变 有 关，利用基因芯片，可 以 快 速 检 测 这 些 突 变，从 而 实 现 对 疾 病 快速、简便、高效的诊断。现在，肝炎病毒检测诊断芯片、结 核
【关 键 词 】 基 因 芯 片 技 术 原 理 应 用 展 望
随着人类基因组 计 划 （Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ，ＨＧＰ）的 完成以及分子生物学 相 关 学 科 的 迅 猛 发 展，极 大 地 带 动 了 人 类疾病相关基因以及病原微生物基因的定位、克隆、结构与 功 能研究，基因芯片（ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ）就 是 在 这 个 背 景 下 发 展 起 来 的 一项分子生物学新 技 术。 基 因 芯 片，是 平 面 载 体 （如 硅 片、玻 璃片、尼龙膜等）和载体上按照某种预先设计的位置高密度 有 序排列的成千上万核酸探针（如 ＤＮＡ，寡核苷酸或基 因 片 段） 的称谓，也称 ＤＮＡ 芯片或 ＤＮＡ 微阵列。 基 因 芯 片 技 术 融 合 了生命科学、化学、微电子学、计算机科学、统计学和生物信 息 学等诸多学科领域的成就，具有高通量、高集成、微型化、平 行 化、多样化和 自 动 化 等 特 点。 该 技 术 的 出 现 为 生 命 科 学 、医 学 、化 学 等 领 域 的 研 究 提 供 了 一 个 强 有 力 的 工 具 。 １ 基 因 芯 片 技 术 的 基 本 原 理
齐 齐 哈 尔 医 学 院 学 报 ２０１１ 年 第 ３２ 卷 第 １７ 期
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储存生命信息的各基 因 并 不 是 孤 立 地 发 挥 作 用 ，而 是 通 过 形
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成“基因网络”这样一个复杂系统来推动生命演化的。系统 论
的思维方式打破了以往“一 种 疾 病 一 个 基 因 ”的 模 式，强 调 各
基因间以相互联系、相 互 作 用 的 网 络 化 调 控 系 统 共 同 协 调 生
物体的功能。它克服 了 还 原 论 科 研 思 维 方 式 的 弊 端 ，可 以 对
生 命 现 象 的 本 质 进 行 全 面 、系 统 的 研 究 分 析 。
基因芯片技术的出 现 使 综 合、系 统 分 析 某 些 生 命 现 象 成
发育正常还是向恶性肿瘤方向发展。采用基因芯片对基因表
达进行分析，可随时获 取 肿 瘤 细 胞 生 长 各 期 与 肿 瘤 生 长 相 关
基因的表达模式，以 对 肿 瘤 的 发 生、发 展 有 一 个 系 统、深 入 的
阐析。
表１ 几种基因芯片技术的比较［５］
项目
ｃＤＮＡ 芯片 短寡核苷酸芯片
探针长度
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基因芯片技术研究进展
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｑｉｑｉｈａｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１１，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．１７
·综述·讲座·
陈 岩 潘 龙
【摘要】 基因芯片技术是伴随着人类基因组计划的实施而发展起来的生命科学领域里的前沿生 物 技术。它最显著的特点是高通量、高集成、微型化、平 行 化、多 样 化 和 自 动 化。 经 过 十 几 年 的 发 展，基 因 芯片技术也在不断完善、成熟，并广泛运用于生命科学的各个领域。本文系统介绍了基因芯片技术的 基 本 原 理 、技 术 环 节 、分 类 、意 义 、应 用 现 状 及 问 题 展 望 。
基因芯片技术主要是基于 近 年 来 的 一 种 全 新 的 ＤＮＡ 测 序 方 法 － 杂 交 测 序 （ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＳＢＨ）法 应 运 而生的。它通过像集成电路制作过程中半导体光刻加工那样 的微缩技术［１］，将现在生命科学研究中许多不连续的 、离散 的 分析过程，如样品制 备、化 学 反 应 和 定 性、定 量 检 测 等 手 段 集 成于１ｃｍ２ 大小的基片（硅片、玻璃和尼龙 膜 等），在 上 面 固 定 核酸、蛋白及多肽序 列 等 大 量 探 针 分 子，形 成 高 密 度 点 阵，与 样品中的靶分子作用 后，通 过 分 子 杂 交 技 术 在 相 同 条 件 下 进 行反应，反应结果用 同 位 素 法、化 学 荧 光 法、化 学 发 光 法 或 酶 标法显示，然后用精 密 的 扫 描 仪 或 激 光 共 轭 聚 焦 （ＣＣＤ）摄 像 技术记录，由计算机 进 行 分 析、综 合，并 使 这 些 分 析 过 程 连 续 化和微型化。 ２ 基 因 芯 片 技 术 的 四 个 技 术 环 节［２］ ２．１ 芯 片 的 制 备 主 要 是 原 位 合 成 法 和 直 接 点 样 法 。 原 位 合成法适用于寡核苷酸；点样法多用于大片段，有时也用于 寡 核苷酸。原位合成法包括光导合成法和压电合成法。其优点 是反应量大，探针的密 度 高 并 且 可 以 和 其 他 芯 片 制 备 方 法 结 合 使 用 ，该 方 法 的 缺 点 是 探 针 的 长 度 较 短 ，一 般 为 ２０～５０ｂｐ。 点样法包括接触式点样和非接触式点样又称喷墨式打印。因 点样法成本高，故适用 于 芯 片 上 需 要 同 一 探 针 或 是 探 针 是 长 链 ＤＮＡ。 ２．２ 样品制备与标记 从待检细胞或组织中分离出 ＤＮＡ
为可能。它可以同时 进 行 许 多 基 因 的 检 测，彻 底 改 变 了 传 统
的分子生物学方法只能对某一个或某几个基因进行研究的局
限。比如肿瘤的引发 机 制，任 何 一 个 细 胞 中 都 会 有 上 千 个 基
因在表达，而细胞间基 因 表 达 差 异 往 往 能 反 映 出 这 些 细 胞 是
基因芯片技术以种种综合、全面、系统的观点来研究生 命 现象，并充分利用生 物 学、信 息 学 等 当 今 带 头 学 科 的 成 果，使 生命科学研究的思维方式发生了深刻变化［６］。基因芯片技 术 标志着科研思维从还原论向系统论的飞跃。
从生命科学发展史 来 看，现 代 的 还 原 论 思 想 把 整 体 分 解 成各个组分再进行研 究 分 析，对 生 命 科 学 的 研 究 有 着 重 要 影 响，取得了一系列令人瞩目的成就，并直接导致了分子生物 学 的建立。然而，生命系统是一个内外相互作用的自组织系 统，
基因芯片有不同的 分 类 方 法：１）按 其 片 基 不 同 可 分 为 无 机片基芯片和有机合成片基芯片；２）按其应用不同，可分为 表 达谱芯片、诊断芯片、检 测 芯 片；３）按 其 制 备 方 法 不 同 可 分 为 原位合成芯片和合成后交 联 芯 片 （合 成 后 点 样 芯 片 ）；４）最 常 用的还是按载 体 上 所 点 探 针 的 长 度 分 为 ｃＤＮＡ 芯 片 和 寡 核 苷酸芯片两 种［４］。１）ｃＤＮＡ 芯 片：由 Ｓｃｈｅｎａ建 立，将 特 定 的 ｃＤＮＡ 经 ＰＣＲ 扩增 后 借 助 机 械 手 直 接 点 到 基 片 上。２）寡 核 苷酸芯片：由 Ｆｏｄｏｒ首先报道，用照相平板印刷术和固 相 合 成 技术在基片上生成寡 核 苷 酸，分 为 长 寡 核 苷 酸 芯 片 和 短 寡 核 苷酸芯片，与ｃＤＮＡ 芯片制作 的 一 个 主 要 不 同 点 是 多 一 步 转 录获得ｃＲＮＡ 的过程。几种基因芯片技术的比较见表１。 ４ 基 因 芯 片 意 义 － 思 维 方 式 的 转 变
物体，使揭示早期发育、分化、衰老、癌变等一系列复杂生命 现 象成为可能。基因芯片在生命科学研究领域中的应用几乎是 全方位的，已经广 泛 应 用 于 ＤＮＡ 测 序；基 因 表 达 分 析；检 测 基因突变和基因组的多态性；基因诊断；药学研究和环境保 护 及其他领域。 ５．１ ＤＮＡ 测序 基因芯片的思想是在基因测序的 早 期 提 出 来的，主要是因为 当 时 传 统 的 Ｓａｎｇｅｒ－Ｃｏｕｌｓｏｎ 及 Ｍａｘａｍ－ Ｇｉｌｂｅｒｔ测序速 度 不 够 快，不 足 以 解 决 人 类 基 因 组 的 大 量 工 作。因此，基因芯片早期主要用来研究基因结构，适应于这 种 目的的主要是寡核 苷 酸 芯 片［７］。 参 照 已 知 基 因 的 序 列 ，在 载 体上设计、合成成千上万种寡核苷酸探针，与生物样品的靶 序 列进行分子杂交，从而产生杂 交 图 谱，并 排 列 出 靶 ＤＮＡ 的 序 列。将已经荧光标记的待测 ＤＮＡ 样 品 与 设 计 在 基 因 芯 片 上 的成千上万已知序列片段杂交，若二者完全配对，则杂交信 号 较强；若有单个或多个碱基不配对，则信号较弱。目前基因 芯 片主要用 于 已 知 序 列 的 重 测 序 （ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）。 重 测 序 是 指 人类基因组计划中的 基 因 测 序 完 成 后，由 于 个 体 基 因 组 的 序 列之间存在差异，需 要 对 个 别 群 体 或 个 人 进 行 再 测 序 。 由 于 序 列 已 知 ，由 基 因 芯 片 进 行 重 测 序 将 大 大 提 高 效 率 。 ５．２ 基因表达分析 基 因 表 达 分 析 是 目 前 基 因 芯 片 应 用 最 多的一个方面，自动 化 和 快 速 是 它 的 主 要 优 势。 基 因 表 达 是 根据基因的 ＤＮＡ 模板进 行 ｍＲＮＡ 和 蛋 白 质 合 成 的 过 程，基 因表 达 分 析 直 接 涉 及 基 因 的 功 能 。 自 Ｓｔａｎｆｏｒｄ大 学 的 Ｓｃｈｅ－ ｎａ Ｍ 等［８］首 次 发 表 了 用 ＤＮＡ 微 阵 列 研 究 基 因 表 达 的 论 文 后，基因芯片用于研究 基 因 表 达 已 成 为 近 年 来 研 究 的 热 门 课
作 者 单 位 ：滁 州 城 市 职 业 学 院 卫 校 校 区 生 化 教 研 室 ，安 徽 （陈 岩 ） 安 徽 滁 州 市 中 西 医 结 合 医 院 普 外 科 （潘 龙 ）
邮 编 ２３９０００ 收 稿 日 期 ２０１１－０８－０６
或 ＲＮＡ，经逆转录、ＰＣＲ 扩增、末 端 标 记 等 操 作，标 记 主 要 有 荧光标记，生物素或 同 位 素 标 记、现 在 常 用 荧 光 素 标 记，以 提 高检测的灵敏度和使用者的安全性。 ２．３ 杂交反应 属于固－液相反相杂交，探针分子固定于 芯 片表面，与液相的靶 分 子 进 行 反 应。 但 杂 交 条 件 的 选 择 需 考 虑多方面的因素，如杂交反应体系中盐 浓 度、探 针 ＧＣ 含 量 和 所带电荷、探针与芯片之间连接臂的长度及种类、检测基因 的 二级结构的影响。由 于 基 因 芯 片 影 响 因 素 很 多，所 以 要 合 理 设置异种核酸平行实验、核酸质量、检测对照、封闭对照、归 整 化 对 照 ，以 保 证 结 果 的 准 确 性 和 重 复 性 。 ２．４ 信号检测和分析 常 用 的 荧 光 标 记 法 使 用 激 光 共 聚 集 荧光扫描仪进行信号检测。激光共聚焦扫描仪的激光光源可 产生激发不同荧光染 料 的 光，当 探 针 与 待 测 核 酸 完 全 正 常 配 对时的荧光 信 号 强 度 是 具 有 单 个 或 ２ 个 错 配 碱 基 探 针 的 ５～ ３５倍，而且荧光信号的强度还与 样 品 中 靶 分 子 的 含 量 呈 一 定 的线性关系。新发展 的 纳 米 金 标 记，通 过 银 放 大 后 可 直 接 用 肉眼观察，具有非常 好 的 灵 敏 度 （超 过 荧 光 标 记 法 １００ 倍 ）和 特 异 性［３］。 ３ 基 因 芯 片 的 分 类