厌氧菌-食品微生物学

混合冷却。
第三步：培养
每一个细菌会生成一个 菌落
稀 释 度 可以计数 过 低 ， ，但数量 菌 落 密 过多，费 集 无 法 时费力 计数
数量合 适，作 为结果
数量太少 ，误差因 素太大， 不做计数
一般计数平板的细菌生长菌落数以30~300个为
宜。 平 第四步：均 计数
细菌数量=？ 细菌数量=数出的菌落数/稀释度 例如：10-5稀释度时菌落数为125个 细菌数量=125/10-5=1.25×107个/mL 平板计数法是采用最广的一种活菌计数法
2.对数期 以最大的速率生长和分裂，细菌数量呈对数增加
细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长。
对数生长期细菌个体形态、化学组成和生理特性等均 较一致，代谢旺盛、生长迅速、代时稳定，所以是研 究微生物基本代谢的良好材料。它也常在生产上用作 种子，使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。
细菌研究中常用的三个参数
c.薄膜计数法 （滤器及膜事先灭菌）
薄膜——微孔滤膜 （φ0.45um）
原理——膜抽滤（细菌 浓缩）+ 膜平板培养 + 计数
（（ba））滤抽膜滤培养
膜有菌面冲上
滤膜，细菌不能通过
支撑体，支撑滤膜 抽气
要求——样品洁净
（如空c）气或统饮计用计水。数
缺点？


提堵问孔、：菌假太如多难测以出分2散50个菌落，抽滤了50ml自来水，
细菌最 可能数
4.0 3.0 3.5 4.0 2.5 4.0 6.5 4.5 7.5 11.5 16.0
数量 指标 320 321 322 323 330 331 332 333
细菌最 可能数
9.5 15.0 20.0 30.0 25.0 45.0 110.0 140.0
水中大肠菌群、铁细菌、硝化菌、亚硝化菌也 用这种方法进行数量统计。
常用于对微生物的快速鉴定与检测
第三节 微生物的生长规律
一、细菌群体生长规律
生长曲线
在不补充营养物质或移去培养物， 保持整个培养液体积不变条件下， 以时间为横坐标，以菌数为纵坐 标，根据不同培养时间时细菌数 量的变化，可以作出一条反映细 菌在整个培养期间菌数变化规律 的曲线。
生长曲线可分： 延滞期 对数期 稳定期 衰亡期
第一节 微生物纯培养的获得
平板划线分离法 稀释倒平板法 单孢子或单细胞分离法 利用选择性培养基分离法
1.平板划线分离法
用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在 无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的 连续划线 ，如果划线适宜的话，微生物能一一分散， 经培养后，可在平板表面得到单菌落。
2.稀释倒平板法
繁殖代数（n） 指数生长方式： 1 2 4 8… …2n
设接种时细胞数为x1, 时间为t1, 到时间t2后，繁殖n代， 细胞数为x2，它们之间的相互关系为：
x2 = x1*2n
以对数表示：㏒ x2 = ㏒ x1 + n㏒2
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
㏒ x2 - ㏒ x1
∴n=
= 3.322(㏒ x2 - ㏒ x1 )
㏒2
细菌最 可能数
0.0 0.3 0.3 0.6 0.6 0.4 0.7 1.1 0.7 1.1 1.1
数量 指标 121 130 200 201 202 210 211 212 220 221 222
细菌最 可能数
1.5 1.6 0.9 1.4 2.0 1.5 2.0 3.0 2.0 3.0
3.5
数量 指标 223 230 231 232 300 301 302 310 311 312 313
如国标法水中细菌总数的测定 。
注意：作空白及取平行样（2～3组）均值减小 误差
B.稀释液体计数法
特点：液体培养、统计学查表计数 又称MPN法 （或最可能数法）
Most Probable Number
例如测定SRB（硫酸盐还原菌，厌氧）的数量 提问：能用稀释平板法计数吗？为什么？ 一般不能，厌氧菌暴露在空气中不能生长（除非厌氧
上细面例菌子最中可数量能指数标—“3—20通” 过对应其的他细精菌最确可的能计数为数9.法5个，菌/确毫升定，
最低稀释度为10-4，
的各种数量折指算标出样时品细中菌菌浓数度量为的？最个可菌/能毫升值。
个菌/毫升 MPN三管法测数统计表
数量 指标 000 001 010 020 100 101 110 102 110 111 120
特点：
该时期死亡的细菌以对数方式增加，但在衰亡期的后期，由于 部分细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低。
二、同步培养
同步培养(synchronous culture)：是一种培养方法， 它能使群体中不同步的细胞转变成能同时进行生长 或分裂的群体细胞。
同步生长：以同步培养方法使群体细胞能处于同一 生长阶段，并同时进行分裂的生长方式
获得更多的菌体物质或代谢产物采取措施：
补充营养物质或取走代谢产物或改善培养条 件，如对好氧菌进行通气、搅拌或振荡等
4.衰亡期
现象：
细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些产 物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。细胞呈现多种形态， 有时产生畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性菌变成 阴性反应等。
连续培养的基本原则：微生物培养过程中不断的补充营养 物质和以同样的速率移出培养物
连续培养类型
恒浊连续培养 恒化连续培养
恒浊法：培养基流速可变，菌体以最高生 长速度生长
可获得大量菌体或与菌体生长相平衡的某 些代谢产物
恒化法：培养基流速不变，直到菌体生长 速度与培养基流速相适应
用于与生长速率相关的研究
提问：已知什么条件通过测定细菌群体重量知道其数量？ 已知单个细菌的平均重量 除法计算 细菌的湿重量＝10-15~10-11g/个细胞 干重约为湿重的10％~20％。
(1)干重法
方法：含菌水样在105～110℃下进行干燥恒重。
悬浮物＝无机物+有机物（包括细菌） 提问：如何确定悬浮物中有机物与无机物的量？ 高温(550℃)灼烧
生长速度常数（R）
n
3.322(㏒ x2 - ㏒ x1 )
R=
=
t2 – t1
t2 – t1
代时(G) 1
G= = R
t2 – t1 3.322(㏒ x2 - ㏒ x1)
3.稳定期
原因： 由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境 变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率 降低直至零(即细菌分裂增加的数量等于细菌死 亡数量)，结束对数生长期，进入稳定生长期。
生
产生抑制(或杀死)作用的效果；
长
客观地反映微生物生长的规律；
微
个体计数法
生
物
生
重量法
长
测
量
生理指标法
方
法
1、个体计数法
（1）直接计数法 借助显微镜观察测定
优点：快速 提问:有哪些缺点? 缺点：不能区分细菌的
死活。
方法： a.涂片染色法 b.计数器(血球计数板）测定法 c.比例计数法 d比浊计数法 450~650nm
第一步：菌样巧妙稀释
1mL
混合
1mL
混合
无菌水 9mL 10mL
1 ： 10-1
10-2
10-3
10-4
菌样被
无菌水
不同稀
释倍率
10-1
：
1后培0-2平养板图
得到不同
稀释度
（10-x）
10-5
菌液
10-2
10 -3
第二步：接种平板
各取 1ml，均匀涂布于
冷固体培养基平板上或
10-4
10 -5
与温热液态固体培养基
（2）间接计数法(活菌计数法)
提问：前述方法中计数的不都是活菌，如何分辨菌死活？
活菌可以繁殖
提问：细菌繁殖的可见现象是什么？ 产生菌落（固体培养基培养）、菌液混浊（液体培养基培养）
计数原理：一个细菌可繁殖成一个菌落或一群细菌.
缺点：慢
分固体培养法和液体培养法
A. 稀释平板计数法—固体培养法
3.单孢子或单细胞分离法
采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单 个个体进行培养以获得纯培养 。
在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单 孢子或单细胞进行培养。也可以采用特制的毛细管在 载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来，然后移 到合适的培养基进行培养。
4.选择性培养基分离法
各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵 抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生物而限制其它微生 物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。
恒温37℃培养14天 记录变黑的试管情况
3 32 0
(d)统计－查表－计算
根据不同稀释度变黑试管
①统计出数量指标
②查表
三位数及其中最低稀释度 表——MPN表
（取变黑的管数最多、稀释度又最低的生长管 数，为第一位数字，后面两个稀释度的生长管 数为后两位数）
提问：上例情况而言统计数量是几？ 320 10-4
来表示细菌的生长量
少量纯细菌培养时 细菌数量的测定。
精确性非常高，对 样品纯度以及仪器 和人员的要求较高。
3.生理指标测定法
微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、 生物热等与其群体的规模成正相关。
样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显， 因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量 热计等设备来测定相应的指标。
分离方法
微生物纯培养分离方法的比较 应用范围
平皿划线法
方法简便，多用于分离细菌
稀释倒平皿法
即可定性，又可定量，用途广泛
单细胞挑取法
局限于高度专业化的科学研究
利用选择培养基法
适用于分离某些生理类型较特殊 的微生物
第二节 微生物生长量的测定
评价培养条件、营养物质
微
等对微生物生长的影响；
生
物
评价不同的抗菌物质对微生物
1.延滞期 将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数 不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延 迟期、适应期。
迟缓期的特点：分裂迟缓、代谢活跃、对环境敏感
在工业发酵和科研中通常采取一定的措施缩短延滞期：
①通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短； ②利用对数生长期的细胞作为“种子”； ③尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大； ④适当扩大接种量等方式缩短迟缓期，克服不良的影响。 （3%-8%）
培养箱） 对这类菌可以利用它们生长时产生的硫化亚铁黑色特征进 行深层隔氧液体培养，按MPN法进行计数。
10-2
1ml
+
9ml
10-3
10 -3
10 -4
培 养 基
10-4
10-5
10 -5
10 -6
（a）稀释 稀释程度、取样概率
（b）稀释接种样品
在液体表面加一层无菌 液体石蜡隔绝氧气，
（c）培养
无机物化学性质稳定，高温下不会分解 提问：什么情况下可以直接用悬浮物的重量表
示细菌的重量？
悬浮物中绝大多数是细菌。
(2)细胞含N量法
大多数生物包括细菌，细胞内的蛋白质氮含量 比较稳定，一般为蛋白质干重15％~16％，平均 为16％。
（3）.DNA含量法
同种细菌的DNA含量一致,可通过测定DNA的含量
同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的 生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种 理想的材料。
三、连续培养
连续培养(continous culture of microorganisms)是在微生物 的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比 生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。
自来水中菌浓度是多少呢？
250÷50ml=5个/ml自来水
样品中的细菌数量=菌落数÷抽滤样品的体积数
提问：如何用活菌计数法测定较脏的水样？ 减少滤液体积、无菌水稀释
2.重量法 以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量；
通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算 微生物群体的生物量；
生理指标测定法
第八章 微生物的生长繁殖
及其控制
生长
生物个体由小到大的增长，即表现 为细胞组分与结构在量方面的增加
繁殖
指生物个体数目的增加
在单细胞微生物中，生长繁殖的速度很快，而 且两者始终交替进行，个体生长与繁殖的界限难 以划清，因此实际上常用群体生长作为衡量微生 物生长的指标。
群体生长的实质是包含着个体细胞生长与繁 殖交替进行的过程
第四节 环境因素对微生物的影响
微生物与所处的环境之间具有复杂的相互影响和 相互作用：一方面，各种各样的环境因素对微生物的 生长和繁殖有影响；另一方面，微生物生长繁殖也会 影响和改变环境。研究环境因素与微生物之间的关系， 可以通过控制环境条件来利用微生物有益的一面,同时 防止它有害的一面。
影响微生物生长的外界因素很多，除了前面讲过的营 养因素之外，还有许多物理化学条件。 本节主要内容：