阿魏酸酯酶的研究与应用

B型 以甜菜渣做培养基时,微生物倾向于分泌B型阿 魏酸酯酶。B型的阿魏酸酯酶对连接在阿拉伯糖 残基C-2和半乳糖残基C-6上的阿魏酸酯键具有专 一性,黑曲霉来源的B型阿魏酸酯酶对1,5-阿魏酸阿 拉伯糖酯键也有催化作用,但效果远远低于A型。 另外B型的阿魏酸酯酶不能使阿魏酸二聚体游离 出来。B型阿魏酸酯酶还可以催化水解人工合成 的阿魏酸甲酯、咖啡酸甲酯以及香兰酸甲酯中的 酯键,但是对芥子酸甲酯无效。B型阿魏酸酯酶的 产酶微生物主要有黑曲霉、青霉和链孢霉菌等。
菌株名称

绳状青霉 Penicillium funiculosum
粗糙脉孢菌 Neurospora crassa
荧光假单胞菌 Pseudomonas fluorescens
Type-A feruloyl esterase from Penicillium Type-B feruloyl chrysogenum esterase from Penicillium Type-C feruloyl chrysogenum esterase from Sporotrichum thermosporum 阿魏酸酯酶 的名称 Type-B feruloyl esterase from Aspergillus Niger Type-C feruloyl esterase from Penicillium chrysogenum
七、黑曲霉阿魏酸酯酶A的克隆、 表达及快速酶活检测体系的建立
7.1.黑曲霉阿魏酸酯酶A cDNA的获得
黑曲霉在PDA 固体培养基 上划线活化
培 养
以CTAB法提 取总RNA
以总RNA为模板， 以oligo(dT)为引物逆转 录合成第一链cDNA.
以第一链cDNA为模板 进行PCR扩增出编码阿 魏酸酯酶的cDNA
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2.在饲料和造纸工业中的应用 利用阿魏酸酯酶处理植物性的原材料,可以将阿 魏酸从植物细胞壁的结构中游离出来,从而破坏了 细胞壁的骨架结构,使得木质素、半纤维素以及纤 维素之间的连接被部分打破,结构变得比处理前疏 松。 在饲料工业中,变得疏松的原料更容易被牲畜消 化吸收利用,可以提高饲料的利用效率。而在造纸 工业中,纤维素是构成纸张的主要成分,半纤维素可 部分被利用,木质素是需要去除的成分,经阿魏酸酯 酶处理的原料,木质素更容易脱除,因而可以减少制 浆工序的化学药品用量。而纤维细胞壁经阿魏酸 酯处理后,表面变得疏松,更容易形成分叉,在成纸 时,纤维间的交织力变大,可以提高纸品的机械强度。
0.94×108t
粮食秸秆露天焚 烧量 非露天燃烧量
3.96×108t
图一：中国主要粮食作物年平均秸秆燃烧情况
120 100 80 60 40 20 0 CO2 CO 总C量 排放量× 1E+6t
图二：粮食作物秸秆露天焚烧排放情况
纤维素是世界上最丰富的天然有机物，占植物界碳 含量的50％以上。
二、阿魏酸酯酶对其它纤维素酶类具 有协同作用
例1： 当阿魏酸酯酶加入量为 240 mu/g对底 物水解 72 h 时, 稻草纤维素的酶解率、不溶 性底物失重率较不加阿魏酸酯酶分别增加 了 32.00%、32.77%； 阿魏酸酯酶(300 mu/g )对底物作用 120 min 后， 纤维素酶对 稻草纤维素的酶解率、不溶性底物失重率 分别增加了 29.85%、32.48%。由此表明, 阿魏酸酯酶和纤维素酶之间存在较大的协 同作用，添加阿魏酸酯酶能够提高纤维素 酶对天然木质纤维素的酶解效率。
阿魏酸酯酶A的三维结构
阿魏酸
阿魏酸(Ferulic Acid)的化学名称为 4羟基3甲氧基肉桂酸，是植物界普遍 存在的一种酚酸,在植物体内很少以游 离态存在, 主要与细胞壁多糖和木质 素交联构成细胞壁的一部分，与低聚 糖、多胺、脂类和多糖形成结合态。 它有许多保健功能,如清除自由基、抗 血栓、抗菌消炎、抑制肿瘤、防治高 血压、心脏病等。阿魏酸毒性低,易于 为人体代谢,其用途越来越广泛。阿魏 酸在食品工业中主要用于制备天然香 阿魏酸分子式 兰素、抗氧化剂、防腐剂、交联剂和 机能促进剂等,阿魏酸可通过化学合成 法和提取法获得。
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催化过程中阿魏酸酯酶的催化中心和辅助 中心将阿魏酸酯化合物中的阿魏酸残基束 缚，而后经过一系列化学过程将酯键断裂, 使阿魏酸游离出来。
四、阿魏酸酯酶的分类和催化专一性
阿魏酸酯酶对苯乙酸酯类具有催化专一性, 然而不同的阿魏酸酯酶的催化专一性也有 所不同,依据催化专一性的不同,阿魏酸酯酶 最初被分为A、B两种类型,后来又发现了一 些其他类型。
第三种类型 目前还发现一种称作XYLD的乙酸酯酶具有阿 魏酸酯酶活性,它是从荧光假单胞杆菌的一个亚种 中分离得到的,它对苯乙烯酚酸酯类(阿魏酸酯、咖 啡酸酯、香兰酸酯以及芥子酸酯)的化合物同样有 催化作用。用XYLD处理小麦的外壳,产物中有 5,5’-阿魏酸二聚体。此外,也有研究者依据诱导产 酶培养基、能水解的酯键、肽链中氨基酸的序列 和产物中是否产生阿魏酸的二聚体等因素进一步 把阿魏酸酯酶细分为A、B、C、D 4类。
挑取黑曲霉孢子 接种于50 mL黑曲霉 液体基本培养基中
培 养 24 h
收集菌体
5d
经胶回收纯化的PCR 产物连接到pMD18-T克 隆载体上后转化E.coli DH5α 感受态细胞。
7.2.表达载体的构建、阳性克隆的筛选和表达
以正确的质粒为模 板 扩增无信号肽的成熟阿魏 酸酯酶编码序列 连接到pPIC9K上相 应的多克隆位点
例2：在pH 值为 5.0、45 ℃、料液比 1∶30 （g∶mL）条件下，取 47.5 U/mL 的木聚糖 酶粗酶液 15 mL，加入 1.0 g 麦糟的乙醇不 溶物，反应 12 h 后，加入 40.8 U/mL 的阿 魏酸酯酶粗酶液 15 mL 再反应 12 h，阿魏 酸和低聚木糖释放率分别为 54.1%和 161 mg/g （麦糟的乙醇不溶物）。结果表明， 阿魏酸酯酶与木聚糖酶存在协同作用，能 极大提高麦糟中阿魏酸及低聚木糖的释放 率，有利于麦糟的降解。
三、阿魏酸酯酶的结构以及催化特性
由于其催化底物的结构复杂，相应的阿魏酸酯酶 也有着相当复杂的结构。虽然不同的阿魏酸酯酶 结构有差异，但都为球蛋白质且大都具有Ser-HisAsp的“三点催化活性中心”仅结核分枝杆菌( M ycobacterium tu-berculosis)产生的酶的活性中心由 Ser-Glu-His组成。 阿魏酸酯酶A氨基酸序列：
阿魏酸酯酶的研究与 应用
随着全球人口和经济规模的不断增长，能源使 用带来的环境问题及其诱因不断地为人们所认识， 不止是烟雾、光化学烟雾和酸雨等的危害，大气 中二氧化碳浓度升高将带来的全球气候变化，也 已被确认为不争的事实。二氧化碳的释放很大部 分是由于植物秸秆的燃烧。这不尽污染了环境而 且也是对能源的浪费。
纤维素 半纤维素 木质素 其它
图三：一般木材中的成分
此外，麻、麦秆、稻草、甘蔗渣等，都是纤维素的丰富来源。
所以，应如何充分利用秸秆， 木材等生物原料？
分解纤维素的酶：
纤维素酶、木聚糖酶、阿拉伯糖苷 酶、阿魏酸酯酶
什么是阿魏酸酯酶？
一：阿魏酸酯酶 feruloyl esterase
阿魏酸酯酶指能水解阿魏酸甲酯、低聚糖 阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键，将阿 魏酸游离出来的一种酶。 它能切断细胞壁中多糖-多糖、多糖-木质素 间的交联，有利于细胞壁物质中多糖的降 解和木质素的释放，因此在食品、饲料和 造纸工业具有广阔的应用前景。
Table 1 Classification of feruloyl esterases
甘蓝链格孢菌 Alternaria brassicicola
黑曲霉 Aspergillus niger
产黄青霉 Penicillium chrysogenum
互隔交链孢菌 Alternaria alternata
六、阿魏酸酯酶的应用
1.在食品工业中的应用 研究表明阿魏酸可以作为抗氧化剂用于油脂的抗 氧化,除此之外,阿魏酸还具有的抗肿瘤、消炎、促 进伤口愈合等保健作用,所以阿魏酸可作为功能因 子开发功能性的食品。同时,阿魏酸可以作为合成 天然香兰素的前体,以阿魏酸为原料,利用微生物的 方法生产的香兰素与合成的香兰素相比具有毒性 低,安全性高的特点,可以用作食品和化妆品行业的 香料。阿魏酸大量存在于植物的细胞壁中,研究者 使用阿魏酸酯酶和使用阿魏酸酯酶与其他酶协同 作用从各种农作物的副产品中提取阿魏酸的研究 取得了一定的成果,目前主要使用麦麸、玉米麸皮 等作为原材料来提取阿魏酸。
A型 这一类阿魏酸酯酶对以1,5-酯键连接在阿拉伯 糖残基C-5上的阿魏酸具有催化专一性。当原料用 木聚糖酶预处理过或用木聚糖酶与阿魏酸酯酶协 同水解时,产物中有少量的5,5’-和8-O-4’-阿魏酸二 聚体。A型的阿魏酸酯酶对苯环上有甲氧基(特别 是在3,5位)的酚类酯都有催化特性。A型阿魏酸酯 酶还可以催化水解人工合成的阿魏酸甲酯、芥子 酸甲酯以及香兰酸甲酯中的酯键,但是对咖啡酸甲 酯无效。AnFaeA就是属于A型的阿魏酸酯酶。当 以谷物作为培养基时,微生物倾向于产生A型阿魏 酸酯酶。
目录： 一、阿魏酸酯酶 feruloyl esterase 二、阿魏酸酯酶对其它纤维素酶类具有协同 作用 三、阿魏酸酯酶的结构以及催化特性 四、阿魏酸酯酶的分类和催化专一性 五、阿魏酸酯酶的最适作用条件 六、阿魏酸酯酶的应用 七、黑曲霉阿魏酸酯酶A的克隆、表达及快 速酶活检测体系的建立 八、阿魏酸酯酶的研究现状及展望
Type-A feruloyl esterase from Aspergillus niger
PcFacA
AnFaeA
五、阿魏酸酯酶的最适作用条件
阿魏酸酯酶种类不同,其作用的最适条件也 不尽相同。表1列出了典型的产酶微生物黑 曲霉所产生的几种阿魏酸酯酶的最适作用 条件。
例：方园等人利用泡盛曲霉固体发酵麦麸，蔗渣 等纤维质原料产生阿魏酸酯酶，并对其酶学性质 进行初步检验，结果表明： 该酶制剂最适 pH 为 6.0，最适温度为 25 ℃， Cu2+、Fe2+、EDTA 对该酶活力有激活作用， Mg2+、Zn2+、Mn2+则有一定的抑制作用。其中， Cu2+的最适添加浓度为 0.25 mol/L，EDTA 与 Fe2+ 的最适添加浓度为 0.20 mol/L。W( 最适 酶) :W( 底物) = 1:100，在 1.5 h 后，酶解产率达 到最高。并研究该酶对去淀粉麦麸、蔗渣、玉米 皮和玉米芯这 4 种天然纤维质原料的酶解效果， 结果表明该酶对去淀粉麦麸的酶解效果最佳。产 生阿魏酸的质量浓度达到72.93 mg / L。