大肠杆菌O157_H7量子点免疫层析试纸条的研制_袁列江

（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈａｎｇｓｈａ，Ｈｕｎａｎ４１０００７，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ，Ｈｕｎａｎ４１０００４，Ｃｈｉｎａ）
摘要：研制 一 种 大 肠 杆 菌 Ｏ１５７：Ｈ７ 量 子 点 免 疫 层 析 试 纸。 利用自制水溶性量子点静电偶联大 肠 杆 菌 Ｏ１５７：Ｈ７ 单 克 隆 抗体，将大肠杆菌 Ｏ１５７：Ｈ７ 单 克 隆 抗 体 和 羊 抗 兔 二 抗 划 线 于硝酸纤维素膜分别作为检测线和 质 控 线，制 备 双 抗 体 夹 心 法检测大肠杆菌 Ｏ１５７：Ｈ７的量子点免 疫 层 析 试 纸。 该 试 纸 条能在５ｍｉｎ内完 成 检 测，检 测 限 制 为 １×１０４ ＣＦＵ／ｍＬ，对 常见的８种食源菌无交叉反应。基于量子 点 的 大 肠 杆 菌 Ｏ１５７：Ｈ７免疫层析试纸操 作 简 便，灵 敏 度 和 特 异 性 较 好，可 用于食品快速检测。 关键词：大肠杆菌 Ｏ１５７：Ｈ７；量子点；免疫层析 Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔｓｂ（ＱＤｓ）ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｒｏｍａｔｏ－ ｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｒｉｐ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７．Ｗａｔｅｒ ｓｏｌｕｂｌｅ ＱＤｓ ｗａｓ ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７ａｎｄ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｗｅｒｅ ｍａｒｋｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ＮＣ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｓ ｔｅｓｔ ｌｉｎｅ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｌｉｎｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｒｉｐ ｔｅｓｔ ｐａｐｅｒ ｗａｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｄｏｕｂｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓａｎｄｗｉｃｈ． Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｒｉｐ ｔｅｓｔ，ｏｎｌｙ ５ ｍｉｎ ｗａｓ ｎｅｅｄｅｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃ－ ｔｉｏｎ ｗａｓ １×１０４ ＣＦＵ／ｍＬ．Ｎｏ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｗｉｔｈ ８ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｆｏｏｄ ｂｏｒｎｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．Ｔｈｅ ＱＤｓ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｒｏｍａｔｏ－ ｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｒｉｐ ｔｅｓｔ ｏｆｆｅｒｓ ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７
安全与检测
２０１５ 年 第 ４ 期
了优良的荧光特性，量 子 点 荧 光 强 度 和 稳 定 性 好，分 别 是 传 统 荧光染料的１ ０００倍和１００倍，几乎不受环境的影响，抗光 漂白性强，可以 反 复 激 发，有 利 于 长 时 间 的 试 验 观 察。 蔡 朝 霞等 利 ［１９］ 用 化 学 偶 联 剂 使 得 量 子 点 表 面 基 团 与 菌 体 之 间 的 成功结合，建立了一种快速简便的大 肠 杆 菌 定 量 检 测 分 析 方 法 ，但 此 法 几 乎 没 有 特 异 性 。 王 玉 娇 等 利 ［２０］ 用 量 子 点 甘 露 糖与大肠杆菌表面含有的 ＦｉｍＨ 凝 集 素 的 特 有 识 别 性 质，通 过配体交换合成甘露糖修饰的量子 点，作 为 检 测 大 肠 杆 菌 的 荧光探针，但此法针对大肠杆菌的特 异 性 识 别 程 度 不 如 大 肠 杆 菌 抗 原 抗 体 反 应 。 Ｗｕ 等 利 ［２１］ 用 兔 抗 山 羊 抗 体 交 联 水 溶 性 ＺｎＳ／ＣｄＳｅ量子点，合成了量子点荧光免疫探针，其方便性 和特异性佳，应 用 广 泛。 在 免 疫 层 析 技 术 中，相 比 于 其 他 标 记物，以量子点为标记物，由于其基 于 荧 光 显 色，抗 干 扰 性 和 检测灵敏度理论上都更强。结合量子点的优良荧光性质和 抗原抗体反应的特异性，本研究拟应 用 双 抗 体 夹 心 量 子 点 免 疫层析法检测大肠杆菌 Ｏ１５７：Ｈ７，并 评 价 该 方 法 的 灵 敏 度、 特 异 性 、和 适 用 性 。
图 １ 抗 体 与 量 子 点 偶 联 原 理Βιβλιοθήκη Baidu图 Ｆｉｇｕｒｅ １ Ｏｕｔｌｉｎｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ ｃｏｕｐｌｉｎｇ
１．２ 细 菌 培 养 各种细菌采用 ＬＢ 固体培 养 基 上 划 线 培 养 ２４ｈ，挑 选 特 征 菌落接种与液体 ＬＢ 培养基培养２４ｈ。以生理盐水梯度稀 释进行菌落计数。
１．３ 免 疫 层 析 试 纸 条 的 制 备 １．３．１ 量子点制备 采用巯基乙 酸 作 为 修 饰 剂 制 备 水 溶 性 量 子点。称取３１．９ｍｇ Ｔｅ粉和２８．４ｍｇ ＮａＢＨ４至预先通氮 除氧的圆底烧瓶中，加５ｍＬ除氧水，磁力搅拌至 Ｔｅ 粉完全溶 解，生成 ＮａＨＴｅ 溶液；称取１１４．２ｍｇ的 ＣｄＣｌ２·２．５Ｈ２Ｏ，加 入 ２５０ｍＬ 去氧水溶解；用 移 液 枪 量 取 混 合 修 饰 剂 ９３μＬ，加 入 氯 化铬溶液中，滴加 ＮａＯＨ 调节ｐＨ 至９，使白色絮状沉淀完 全溶 解；将 溶 液 转 移 至 三 口 烧 瓶 中，通 氮 气 除 氧，加 入 ＮａＨＴｅ溶液，１００ ℃下加热回流２ｈ，得量子点溶液。透析纯 化后４ ℃冷藏。 １．３．２ 大肠杆菌 Ｏ１５７：Ｈ７与量子点偶联最佳 ｐＨ 的确定 采 用 静 电 结 合 的 方 法 偶 联 抗 体 蛋 白 和 量 子 点 （图 １）。 移 液枪取２０μＬ 纯 化 过 的 量 子 点，０．１ ｍｏｌ／Ｌ 磷 酸 缓 冲 液 分 别 调节 ｐＨ 至６．２，６．７，７．２，７．７，８．２。分别向其中加入２０μＬ
基金项目：国 家 科 技 支 撑 计 划 课 题 （编 号：２０１２ＢＡＤ２９Ｂ０５， ２０１２ＢＡＣ０１Ｂ０７）；质 检 公 益 性 行 业 科 研 专 项 （编 号： ２０１３１００１２８，２０１２１００３５）
作者简介：袁列江（１９７３－），男，湖 南 产 商 品 质 量 监 督 检 验 检 疫 局 研 究 员 ，博 士 。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕａｎｌｉｅｊｉａｎｇ＠１６３．ｃｏｍ
第 ３１ 卷 第 ４ 期 ２ ０ １ ５ 年 ７ 月
ＤＯＩ：１０．１３６５２／ｊ．ｉｓｓｎ．１００３－５７８８．２０１５．０４．０１０
Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．４ Ｊｕｌ ．２ ０ １ ５
大肠杆菌 Ｏ１５７：Ｈ７量子点免疫层析试纸条的研制
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｔｅｓｔ ｓｔｒｉｐ ｆｏｒ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７
袁 列 江１
李 萌 立２
王 书 源２
杨 梦 昕２
李 忠 海２
ＹＵＡＮ Ｌｉｅ－ｊｉａｎｇ１ ＬＩ Ｍｅｎｇ－ｌｉ２ ＷＡＮＧ Ｓｈｕ－ｙｕａｎ２ ＹＡＮＧ Ｍｅｎｇ－ｘｉｎ２ ＬＩ Ｚｈｏｎｇ－ｈａｉ２
（１．湖南产商品质量监督检验检疫局，湖南 长沙 ４１０００７；
２．中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 ４１０００４）
通 讯 作 者 ：李 忠 海 收 稿 日 期 ：２０１５－０６－１２
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Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７；ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔｓ；ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｒｏ－ ｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ
在中国的食品 中 毒 事 件 中，约 一 半 由 微 生 物 引 起，其 中 又 以 大 肠 杆 菌 引 起 的 最 多 。 ［１－４］ 大 肠 杆 菌 Ｏ１５７：Ｈ７ 型 （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７）是一种肠道出血 性 大 肠 杆 菌，是 主要食源 致 病 菌 之 一［５］。 大 肠 杆 菌 Ｏ１５７：Ｈ７ 的 致 病 性 极 强，有文献［６］报道 仅 需 １００～２００ 个 细 菌 即 可 对 人 体 产 生 中 毒反应。大肠杆菌 Ｏ１５７：Ｈ７在全球频 繁 发 生，传 播 范 围 广， 致病性强，往往一 爆 发 就 会 造 成 严 重 危 害，因 此 引 起 了 各 国 政府的普遍 关 注。２０１１ 年 肠 出 血 性 大 肠 杆 菌 菌 株 （ＥＨＥＣ） 在欧洲的传播非常迅猛，有 １３ 个 国 家 的 ２ ４００ 多 人 被 感 染， 其中２３人死亡［７］。中 国 也 爆 发 过 多 次 ，１９９９ 年 发 生 的 大 肠 杆菌 Ｏ１５７：Ｈ７中毒事件，对中国的经济造成了巨大损失［８］。 传统的大肠杆菌检测方法为平 板 培 养 法，试 验 条 件 要 求 简单，但操作繁 琐，检 测 周 期 较 长。 分 子 生 物 学 方 法 灵 敏 度 高 ，但 在 实 际 应 用 中 受 试 验 仪 器 的 制 约 。 ［９－１３］ 免 疫 层 析 技 术 是 ［１４］ 近 年 发 展 的 一 种 快 速 检 测 方 法 ，其 检 测 简 单 迅 速 ，每 个样品检测时间在５ｍｉｎ，方便快捷、特异灵敏、稳 定 性 强、不 需 要 设 备 支 撑 ，是 一 种 优 良 的 快 速 检 测 技 术 。 解 泉 源 等［１５］ 以荧光微球为标记物建立了大肠杆 菌 Ｏ１５７：Ｈ７ 荧 光 微 球 免 疫层析试纸 条，不 借 助 检 测 仪 器 条 件 下 检 测 限 可 达 １．２× １０４ ＣＦＵ／ｍＬ。王 静 等 以 ［１６］ 胶 体 金 做 标 记 物 ，建 立 了 大 肠 杆 菌 Ｏ１５７胶体金免疫层析快速筛查方法，检 测 能 在 １５ ｍｉｎ内 完 成 ，检 测 限 为 １×１０５ ＣＦＵ／ｍＬ。 量 子 点 （ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔｓ，ＱＤｓ）是 一 种 由 Ⅱ ～ Ⅵ 族 元 素 或 Ⅲ～Ｖ 族 元 素 组 成，直 径 在 １～１０ｎｍ 的 半 导 体 荧 光 纳 米 粒 子 。 ［１７，１８］ 量 子 点 中 电 子 的 能 量 状 态 与 原 子 相 似 ，由 于 电 子 和 空穴被量子限域，连续的能带结构变 成 具 有 分 子 特 性 的 分 立 能级结构，所以量子点受激后可以 发 射 荧 光。 量 子 点 显 示 出
１ 材 料 与 方 法
１．１ 仪 器 与 材 料 分析天平：ＦＡ１００４Ｂ 型，上海佑科仪器仪表有限公司； 磁 力 搅 拌 加 热 器 ：ＣＪＪ７９－１ 型 ，金 坛 大 地 自 动 化 仪 器 厂 ； 超 纯 水 机 ：ＺＷＬ－ＬＳ１－１０ 型 ，湖 南 中 沃 水 务 环 保 科 技 有 限 公司； 荧 光 分 光 光 度 计 ：Ｆ９６ｐｒｏ 型 ，上 海 棱 光 仪 器 有 限 公 司 ； 结 合 垫 Ｇｌ０１９４、层 析 膜 Ｉｍｍｕｎｏｐｏｒｅ ＲＰ、ＰＶＣ 底 板 ＤＢ－４、吸水纸 Ｈ５０７６：上海杰一生物科技有限公司； Ｔｅ粉、巯基乙 酸、硼 氢 化 钠、氯 化 镉：分 析 纯，国 药 集 团 化学试剂有限公司； 大 肠 杆 菌 ＡＴＣＣ８７３９、鼠 抗 Ｅ．ｃｏｌｉ０１５７ 单 克 隆 抗 体 （ＬＭ－Ｍａｂ－０１）、兔抗鼠ＩｇＧ 抗体：上海慧耘生物科技公司； 沙 门 氏 菌、蜡 样 芽 孢 杆 菌、副 溶 血 性 弧 菌、霍 乱 弧 菌、肉 毒 杆 菌 、金 黄 色 葡 萄 球 菌 ：均 为 本 实 验 室 保 藏 。