第三章 蛋白质的修饰和表达蛋白质的修饰和表达是蛋白质工程的重要研究内容和手段。将从蛋白质修饰的化学途径、蛋白质改造的分子生物学途径和重组蛋白质的表达进行讲解。第一节 蛋白质修饰的化学途径蛋白质的化学修饰：凡通过活性基团的引 入或去除，而使蛋

6. 10% SDS取10g SDS，加水至100 ml，完全溶解后室温保存。7. 10%过硫酸铵溶液（AP）临用前现配。208．染色液（0.25% R-250、50%甲醇、7%乙酸）考马斯亮蓝R-250 2.5 g、 甲醇（可用无水乙醇代

蛋白质-His（N-CH2COO-）+H++I-(pH6)⑶利用某些产物的不稳定性高pH下，用氰酸、二硫化碳、O-甲基异脲和亚氨基酸等可转变氨基成脲和胍的衍生物。虽然巯基也能与上述试剂作用， 但因pH高，形成的产物迅速被分解。⑷亲和标记亲和

终止修饰反应的方法加入某种化学试剂(通常为氨基酸 与修饰剂反应 加入某种化学试剂 通常为氨基酸)与修饰剂反应，从而消耗 通常为氨基酸 与修饰剂反应， 掉游离的修饰剂； 掉游离的修饰剂； 通过洗滤、 通过洗滤、超滤或透析将修饰蛋白与未修饰蛋白

2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇(DTT)等主要 用于-S-S-的还原剂。连四硫酸钠或钾 是一温和的氧化剂， 常用于-SH的可逆 保护剂。2.1.4 芳香环取代反应蛋白质AA残基的酚羟基在3和5位上易于发生亲 电取代的碘化和硝化反应。这类

从广义上说：凡通过化学基团的引入或除去， 而使蛋白质共价结构发生改变，都可以称为蛋白 质的化学修饰。包括两个方面：（1）侧链基团的改变；(2） 主链结构的改变，前者属于化学修饰的范畴，而 后者则属于基因重组和定点突变的方法。a46蛋白质化学

最常用的是2-羟基-5-硝基苄基溴，由于溶解度的问题，常用 它的类似物二甲基（2-羟基-5-硝基苄基）锍盐。NO2 CH2Br OHpH ﹤7.5+ENZ NO2 CH 2 O N HHENZ+ HBr2-羟基-5-硝基苄基溴ENZ NH色

蛋白质化学修饰技术是现代生物技术发展的一个重要方向，以聚乙二醇(PEG)为修饰剂和以蛋白质为修饰剂是该技术的两个主要类型。 PEG修饰技术发展成熟，已经有几种PEG-蛋白质药物经过FDA认证。为了有效地检测和分离修饰产物，本论文首先用十二烷

-N-羟基琥珀酰亚胺5KMPEG-NHS10-N-羟基琥珀酰亚胺10K100 10 5100 10 530000 6000 300035000 7000 3500MPEG-NHS20-N-羟基琥珀酰亚胺20K三、药用蛋白的PEG修饰方法1.

九、丝氨酸羟基的修饰甲苯磺酰氟（PMSF)可与丝氨酸残基作用。试剂醋酸酐 酰基酸酐 醛 N-溴琥珀酰亚胺 碳二亚胺 苯异硫氰 四硝基甲烷三硝基苯磺酸焦碳酸二乙酯 碘乙酸 环乙烯亚胺 甲苯磺酰氟 马来酰胺常用重要修饰剂的专一性修饰的侧链Lys

2.1 特定的AA残基侧链基团的反应试剂 （4种方法） 2.2 巯基的化学修饰 2.3 氨基的化学修饰（3种方法） 2.4 羧基的化学修饰 2.5 咪唑基的化学修饰 2.6 二硫键的化学修饰2.5 咪唑基的化学修饰His残基的咪唑基可通过N

第三节 蛋白质侧链的修饰一、氨基的修饰（一）引入正电荷的修饰氨基 修饰引入正电荷的修饰 电荷消失的修饰 引入负电荷的修饰下列试剂修饰赖氨酸后，可在赖氨酸侧链上留下可电离的带正 电基团。 所用的醛有不同R基 1.还原烷基化-H2OENZ—NH

具有受体功能的酪氨酸 蛋白激酶 (receptor protein tyrosine kinase, RPTK)。包括三个结构域：胞外的配体 结合区，细胞内部具有酪氨酸蛋白激酶活

如果要修饰的蛋白质对有机溶剂不稳定，必须在水介质 中反应，则应选择在水中有一定溶解性的试剂。 还必须考虑，反应生成物容易进行定量测定；试剂的 体积小一些为宜。选择蛋白质修 饰剂要考虑：修饰反应要完成到什么程度； 对个别氨基酸残基是否专一；

1.烷基化试剂特别是碘乙酸和碘乙酰胺是 很重要的-SH修饰剂。修饰产物相当稳定， 易于分析。此类试剂还能与Met\Lys\His 反应。2.有机汞试剂是最早使用的-SH修饰剂之一，

.PEG是由乙二醇单体聚合而成的线性高分子材料,分子组成为 HO-CH2-CH2-(O-CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-OH; PEG链还可以与 马来酸酐进一步共聚形成梳状

实用文档2、共价结合法 是酶蛋白分子上功能团和固定支持物表面上的反应基团之间形成化学共价键连接， 以固定酶的方法。 常用载体为：天然高分子（纤维素、琼脂 糖、淀粉等），合成高聚物（尼龙、多聚 氨基酸），无机支持物（多孔玻璃）实用文档影响因素

修饰机制：选择性的试剂或者亲和标记试剂与 侧链上的特定功能团发生化学反应 修饰类型：巯基、氨基、羧基、二硫键3（一）巯基的修饰特点：亲核 最容易发生反应的侧链基团 修饰试剂 烷基化

蛋白质化学修饰的意义改变蛋白质的药代动力学 调节蛋白质的稳定性以及活性 改变蛋白质的空间构象化学修饰的原理影响蛋白质化学修饰反应进程的因素有： 影响蛋白质化学修饰反应进程的因素有： 1 蛋白质功能基的反应性（亲核性） 蛋白质功能基的反应性（

▪ 许多蛋白质要分别经过甲基化、羟基化、糖基化、羧基化、 磷酸化、乙酰化、脂酰化和异戊烯基化等共价修饰。▪ 本章将重点介绍蛋白质可逆磷酸化作用。新合成多肽链加工▪ 原核生物和真核生