水稻愈伤组织转化
一、实验目的
1.掌握植物组织培养的基本原理；
2.学习水稻愈伤组织的诱导方法；
3.学习农杆菌转化法的原理，掌握农杆菌转化水稻愈伤组织的方法；
4.学习转基因植株的各种鉴定方法（包括PCR检测、GUS染色、Southern-blot、Western-blot、FISH
等），同时能够操作PCR与GUS染色鉴定的方法。
二、实验原理
1.植物组织培养
植物组织培养（plant tissue culture）是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体和花药等，在人工控制的培养基上培养，使其生长、分化以及形成完整植株的技
术。自1902年Haberlandt 首先用紫鸭跖草( Tradescantia )的叶片栅栏组织进行培养来，植物组织培养已有100余年历史。用于离体培养的各种植物材料称为外植体（explant）。根据外植体的类
型，又可将组织培养分为：器官培养、组织培养、胚胎培养、细胞培养以及原生质体培养等。（从这个角度讲，本学期的实验属于胚胎培养。）植物组织培养的理论基础是植物细胞全能性。
2.基因工程
基因工程技术是在离体条件下对不同生物的遗传物质(DNA)进行人为“加工”，并按照人们的意愿重新组合，以改变生物的性状和功能，然后再通过适当的载体将重组DNA转入生物体或细胞
内，并使其在生物体内或细胞中表达，从而获得新的生物机能。这种利用基因工程技术获得的植
物一般称为“基因工程植物”。自1983年首次获得转基因植物以来，转基因技术发展十分迅速，
成功进行转基因的植物已达60多种，在世界上批准进入田间试验的转基因植物已超过500例，有些转基因产品已进入市场。通过基因工程改良作物品种在未来的农业生产中日益显示出巨大潜力。
3.农杆菌转化法
转基因的方法有很多，对于植物而言，最常用的是农杆菌转化法和基因枪法。农杆菌转化法使用的是根癌农杆菌，其内含Ti质粒：
T-DNA（Transferre DNA）区：农杆菌Ti 质粒中向植物中转移并整合进植物基因组中的部分。
T-DNA区大小为10-30Kb，左右边界高度保守，为25bp正向重复序列。根癌农杆菌进行转化时，只识别左右边界（尤其是右边界在转化时最为重要），而T-DNA区内为什么基因则不影响转化。因此我们可以通过基因工程改造T-DNA区，转化目的基因。
毒性蛋白（Virulence）区：越20Kb，包括A、B、C、D、E、F、G等基因区，有些基因区含多个基因，形成操纵子结构。毒性蛋白区在侵染植物细胞的过程中起重要作用。
4.农杆菌转化过程：
1)植物受伤部位酚类化合物的分泌；
2)附着（染色体毒性基因ChvA、ChvB）；
3)VirA/G的双元系统感受受伤信号；
4)其他 Vir基因的表达；
5)T-DNA链的切出（VirD1+VirD2）；
6)T-complex（T复合体）的形成；
7)运输（从细菌中输出、进入植物细胞、入核）；
8)整合。
植物受伤后的分泌物中含有酚类物质，这些酚类物质可以被农杆菌感知，借助于趋化性迁移至植物受伤部位，在ChvA、ChvB的帮助下，附着到受伤部位。【因此在人工进行农杆菌侵染时，需要加入乙酰丁香酮（AS）吸引农杆菌，乙酰丁香酮即起到和植物受伤后分泌的酚类物质相同的作用。】VirA识别植物受伤后分泌的酚类物质信号，进行自磷酸化，进而将磷酸化信号传VirG——这是典型的细菌双元信号传导系统。VirG磷酸化后被活化，作为转录因子启动或增强各毒性蛋
白的表达。VirD2在 D1的帮助下识别T-DNA区25bp的边界序列，利用核酸外切酶的在第3、4碱基之间形成缺刻；VirD2的Tyr29与缺刻的5 ’端共价结合，DNA新链合成时便生成一条T-DNA单链，这条单链与VirD2和VirE2 结合形成T-complex。T-complex通过细菌细胞壁上由11个VirB 蛋白和VirD4组成的通道从农杆菌进入植物细胞。此外，VirD2含有NLS（核定位序列），能够引
导T-complex进入细胞核，并帮助T-DNA插入植物染色体中。VirE2是非特异DNA结合蛋白，包裹T-DNA单链，使DNA由随机卷曲状态转变为规则螺旋，这种形状使T-complex 容易穿过核孔。此
外，VirE2将T-DNA包裹，还可避免T-DNA从细菌向植物转移过程中被降解。VirE2可在植物细胞膜上形成通道，使T-complex进入植物细胞；VirE2虽不含NLS序列，但亦可促进T-complex向核定向转运。
5.Ti质粒的改造：
Ti质粒只有被解甲之后才能被应用于转基因实验中。所谓解甲，是指去除对转基因有不良影响的基因，如生长素、细胞分裂素合成基因等。现使用的工程菌株均使用双元载体。双元载体由
存在于工程菌株中的大质粒和方便体外操作的小质粒组成。大质粒包含Vir区，负责侵染植物细胞、帮助T-complex转运等；小质粒约十几Kb，方便体外操作，包含T-DNA区、筛选标记等。实际应
用时，将目的基因插入T-DNA区即可。
三、实验用品
1、实验仪器：镊子、灭菌滤纸、移液器、平皿、离心管、离心机、三角瓶、EP管、摇床、分光光度
计、超净工作台等；
2、实验材料：日本晴水稻种子、 EHA105农杆菌；
3、实验试剂
1)0.1% 升汞，无菌水等
2)抗生素：利福平（Rif）、卡那霉素（Kan）、头孢霉素（Cef）、潮霉素（Hyg）
3)培养基：
①N6培养基：
大量元素母液（50×）g/L
KNO3141.5
MgSO4·7H2O 9.25
KH2PO420
（NH4）2SO423.15
