诱导分化成熟脂肪细胞方案

干细胞诱导分化具体步骤及注意事项
一、技术简介
干细胞诱导分化是诱导干细胞定向分化，使之成为成熟的功能细胞，是目前干细胞研究的关键环节。

干细胞是一种未充分分化，具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。

如：骨髓间充质干细胞是位于骨髓基质中的一类中胚层来源的未分化细胞，在体内外均发现有极强的增殖能力，具有很强的自我更新和多向分化潜能。

在一定诱导条件下，可以分化为成骨细胞、成软骨细胞和成肌细胞等，还可以分化为巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞和成纤维细胞等骨髓基质细胞，具有发育为骨、软骨、脂肪、肌肉、真皮及骨髓基质等中胚层组织的潜能。

在体胚胎分化过程中，组织发生和身体构造的形成具有时空顺序性和相互诱导性。

在个体发育过程中，细胞分化是程序控制的有序有规律过程，程序的运行结果表现为不同发育阶段、不同组织部位的细胞表现出不同的形态、不同的生长方式和不同的生理功能。

从分子水平上来看，这一结果取决于细胞在基因表达上的时空差异，这种基因表达差异除由细胞内在发育程序决定外，还受细胞外环境影响和调控，且有时这种外部控制条件或环境对形成特定细胞有着决定性作用。

干细胞体外定向诱导分化的原理，就是选择适当的诱导剂和诱导模式，通过诱导物与细胞表面受体结合或使细胞发生轻度可逆性损伤等，使被诱导细胞按预定的细胞类型方向分化，然后将这些定向分化的细胞进行分离和培养传代，从而得到人们所需要的细胞类型。

二、实验流程
1. 干细胞的分离、原代和传代培养。

2. 定向诱导干细胞分化。

3. 成长曲线测定。

4. 诱导分化后细胞鉴定。

5. 结果统计分析。

诱导分化成熟脂肪细胞方案集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]Sigma的试剂：IBMX（Sigma I-7018)Dexamethasone (Sigma D-4902)Insulin (Bovine; Sigma I-5500)gibco血清：小牛血清 (GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198)胎牛血清(GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566)培养基DMEM;（GibcoBRL-Cat# 11965-084）MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070)Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016)一: 本次3T3-L1细胞共一25cm3培养瓶消化后传代分为2个10cm培养皿， 3天后每个10cm皿分别传代3个10cm皿。

共6个10cm皿，将其中5个皿细胞冻存于-80°，将一个10cm皿中3t3-l1细胞分别接种于一个6孔板一个12孔板其中4孔和2个10cm皿，待2个10cm皿中细胞铺满90%后消化冻存于-80。

二：6孔板和12孔板4孔即将用于分化。

两者均在细胞铺满90%左右接触抑制2d开始加诱导剂，诱导方案严格按照之前计划的施行，诱导剂①培养2d后换为诱导剂②培养2d，后换诱导剂③培养，以后每48h换液，均采用诱导剂③，8天左右即可看到脂滴，此次整个诱导过程共用14天，出脂滴后继续48h换液，目的主要是获得更多的脂肪细胞。

三：3t3-l1诱导分化过程整体较为顺利，之前考虑到的诸如细胞可能贴壁不牢，易漂浮的情况基本未出现（漂浮很少），诱导剂配置过程中由于剂量极低，担心的浓度不准问题，后证明对分化影响不是很大。

一、诱导液配制1、4,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液（IBMX）配制。

3T3-L1 Differentiation ProtocolStep 1: 3T3-L1细胞传代于35或60-mm培养板中，使用DMEM-F12培养基培养2 day（以此为基点，即：诱导分化的第0 day）。

Step2: 使用诱导液I诱导3T3-L1分化。

加入配制好的诱导液I于3T3-L1细胞中，培养2 day（诱导分化的第2 day）。

诱导液I：0.5m M IBMX;0.25 μM地塞米松；1μg/ml insulin;含10% FBS 的DMEM-F12。

Step3: 使用无血清培养基清洗细胞，去除残余的IBMX和地塞米松。

使用诱导液II诱导细胞分化，并培养2 day （诱导分化的第4 day）。

诱导液II：1μg/ml insulin;含10% FBS 的DMEM-F12。

Step4: 最后用普通DMEM-F12培养基培养并每2 day 换一次液。

Step5: 每次实验前，用serum-free DMEM-F12 或KRP buffer 培养单层细胞2 h。

Step6: 用于实验的脂肪细胞应该在诱导分化后的8-12 day之间为宜。

这样的条件下≥ 95%的细胞表现为脂肪细胞的表型。

Step7: Oil Red O staining鉴定分化后的脂肪细胞内的脂质，可以使用油红染色。

细胞用PBS轻轻冲洗2次，使用10 %的formalin或4% paraformaldehyde 室温固定30 min。

固定后的细胞使用新配制的Oil Red O solution 染色（注意避光）1 h，之后只用蒸馏水轻轻冲洗3次，最后观察结果。

Oil Red O solution 配制：0.5%（W/V）的Oil Red O-异丙醇溶液。

取0.5%的Oil Red O-异丙醇溶液6份，加入4份的蒸馏水，配制成Oil Red O solution。

Step8: 获得结果并进行后期处理。

Other protocol can be used:美国密歇根大学的3T3-L1细胞分化的PROTOCOL(非常详细)3T3-L1 Differentiation ProtocolMATERIALSDulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM; GibcoBRL-Cat# 11965-084: high glucose, with L-glutamine, with pyroxidine HCl, without sodium pyruvate)Calf Serum (GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198)Fetal Bovine Serum (GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566)-filter sterilize (0.22um filter) before mixed into DMEMIsobutylmethylxanthine (IBMX; Sigma I-7018)Dexamethasone (Sigma D-4902)Insulin (Bovine; Sigma I-5500)MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070)Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016)SOLUTIONS10% Calf Serum/DMEM60mL Calf Serum6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate6mL 100x P/S/G500mL DMEM10% FBS/DMEM60mL Fetal Bovine Serum (Filter Sterilized)6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate6mL 100x P/S/G500mL DMEMIBMX Solution (make fresh)a)Dissolve IBMX in a solution made of 0.5N KOH to a final concentration of 0.0115g/mL.b)Filter sterilize through a 0.22 mm syringe filter.Insulin Stock Solution167 uM (1mg/mL) in 0.02M HClFilter sterilized through 0.22 mm filterCan store at -20C for long term, 4C short term.Dexamethasone Stock SolutionsFreezer Stock: 10mM of Dex in 100% ethanol (store at -20C)Working Stock: Dilute Freezer stock to 1mM in PBSFilter sterilize and store at 4C.MDI Induction Media (10mL/10cm plate; 5mL/6cm plate)To required volume of 10% FBS/DMEM add:1:100 IBMX1:1000 Insulin1:1000 Dexamethasone working stockInsulin Media (10mL/10cm plate; 5mL/6cm plate)To required volume of 10% FBS/DMEM add:1:1000 InsulinMETHODPreadipocyte maintenance and passage:We plate the cells in 10% CS/DMEM on treated polystyrene culture dishes from Corning (Cat#430167) and incubate them at 37C in 10% CO2. It is important to feed the preadipocytes every couple of days and avoid letting them get too confluent (>70%), if you want to continue to passage them and differentiate them at a later date. So, take care to split them appropriately. They can be split as far as 1:15, though we usually do 1:10 or less depending on need.Adipocyte Differentiation Protocol:1. Grow preadipocytes to confluency in 10% calf serum/DMEM2. Two days post confluency (DAY 0) stimulate the cells with MDI induction media. You will notice a distinct change in the morphology of the cells (become more spindly) in the next 2 days.3. Two days after MDI (DAY 2) change the media to Insulin Media. The media will begin to get more viscous as free fatty acids are produced by the cells and secreted into the media.4. Two days later (DAY 4) change media to 10% FBS/DMEM. Feed cells with 10%FBS/DMEM every two days. Full differentiation is usually achieved by DAY 8.。

3T3-L1 前体脂肪细胞诱导分化小结1、诱导液配制先配母液：IBMX（0.5 mM）碱性溶液或乙醇溶解，由于下面的Dex 需要用乙醇溶解，所以这里建议用碱性溶液溶解，因为乙醇对细胞分化有影响（可以查到相关文献）。

100×母液配制：0.0115 g IBMX + 940 µl dd H2滤膜过这只是1 ml体积，你可以按照比例多配些。

保存温度我记不清了，你自己查一下。

Dex (1 µM)配制成1000×母液，-20 ℃保存Insulin (10 µg/ml, 比文献中报道的浓度高，可能是我买的胰岛素是分装的，效价比他们的低些，你可以稍微摸索一下)配制成300×母液溶于pH 2-3 0.22µm滤膜过滤除菌，用PCR小管分装，-20以上母液配好后，下面来配诱导液：诱导液Ⅰ：59 ml DMEM（10% FBS）+ 600 µl IBMX + 200 µl Insulin + 60 µl Dex再加140 µl DMEM 补齐到60 ml诱导液Ⅱ：59 ml DMEM（10% FBS）+ 200 µl Insulin再加800 µl DMEM 补齐到60 ml注：“59 ml DMEM”可以用20 ml或30 ml注射器加比较方便。

最终浓度：IBMX 0.5 mMDex 1 µMInsulin10 µg/ml2、诱导分化程序按照经典的“鸡尾酒”法进行诱导分化，稍微改动点，具体细节自己把握。

一般第5天可以看到明显脂滴，第8-10天左右，能有90%左右的分化率。

未分化的3T3-L1 第5天以上所述，仅供参考。

许多细节自己可以根据实验结果来摸索调整。

提前大家实验顺利，新年快乐！xiaoma44。

利用培育技术进行脂肪细胞培养的操作指南现代生物技术的发展为各个领域带来了许多突破性的技术和方法，其中包括利用培育技术进行脂肪细胞培养。

脂肪细胞是人体内一种特殊的细胞类型，其对于肥胖和代谢疾病等研究具有重要意义。

本文将详细介绍利用培育技术进行脂肪细胞培养的操作指南，希望能为相关研究提供有价值的参考。

一、培养基准备脂肪细胞培养的第一步是准备适当的培养基。

建议使用基于DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）的培养基，并添加适当的补充物，如胰岛素、脂肪酸结合蛋白和抗生素。

同时，为了提供适宜的细胞黏附条件，可以将底物预先涂覆成聚-L-赖氨酸、明胶等。

二、细胞获取与传代脂肪细胞的获取可以通过组织切割、离心分离或细胞系购买等方式进行。

在获得脂肪组织后，应迅速将其转移到培养基中，并进行细胞分散。

这可以通过酶处理（使用胰蛋白酶）或机械分散等方法实现。

分散后的细胞应经过离心沉淀，并将上清转移至新的培养基中进行培养。

为了保持细胞的健康生长，定期进行细胞传代非常重要。

一般情况下，当培养皿中的细胞达到80%～90%的密度时，可进行传代。

传代时应用酶处理或机械振荡将细胞分散，然后按照适当的比例用新鲜培养基进行传代。

三、脂肪细胞分化脂肪细胞培养的核心目标是实现细胞的分化，使其发展成成熟的脂肪细胞。

为此，可在培养过程中添加适当的诱导剂，如甲基异丁基黄酮（IBMX）、地塞米松和青霉素/链霉素。

这些诱导剂可以启动脂肪细胞分化的关键信号途径，从而促进细胞向脂肪细胞的分化。

诱导过程中，要注意避免过度分化或细胞死亡。

适量的诱导剂添加和适时的培养基更换是维持细胞健康的关键。

此外，还可以通过观察细胞形态和特定的标记物表达来判断细胞分化的程度。

四、细胞存活与细胞功能评估脂肪细胞培养后，应对细胞存活和功能进行评估。

细胞存活率可以通过尝试剂（如Trypan blue染色）进行测定。

此外，还可以检测细胞中特定标记物的表达，如脂肪细胞特异性的标记物PPARγ和脂肪酸结合蛋白等。

脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序一、试剂准备（一）成脂分化诱导液（Adipogenic Medium, AM）配方【1】：试剂名称浓度商品信息1.极限必须培养基(Dulbecco’S Modified Eagle Medium ，DMEM) 1.0 L(SH30021.01B, Hyclone)2.胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）10%(ES-009-B, Millipore)3.青霉素/链霉素（Penicillin/Streptomycin）1%（TMS-AB2C, CHEMICON）4.地塞米松(Dexamethasone,DM) 1µmo／L 分子量：392.46(D4902-25MG, Sigma)5.胰岛素(Insulin, IS) 10 µmol／L 分子量：5808(91077C—1g, Sigma)6.3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Isobutylmethylxanthine,IBMX) 0.5 mmol／L 分子量：222.24( I5879-100MG, Sigma)7.吲哚美辛(Indomethacin,ID) 200 µmol／L 分子量：357.79(I7378—5G, Sigma)（二）成脂分化诱导液浓储液配制试剂名称质量浓缩倍数配制方法1.Stock A胎牛血清1ml/管1X( liquid）分装1ml/管X100 保存：-20℃2.Stock B青霉素/链霉素0.1ml/管100X( liquid）分装0.1ml/管X100 保存：-20℃3.Stock C地塞米松0.0117738 g 1000X 溶于30ml 无水乙醇(0.1%) 分装0.1ml/管X300保存：-20℃4.Stock D胰岛素0.05808 g100X 溶于10ml Hcl(0.1 mol/L，PH2.0) 分装0.1ml/管X100保存：4℃5.Stock E3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.05556 g 200X 溶于2.5ml DMSO(0. 5%) 分装0.05ml/EP管X50 保存：-20℃6.Stock F吲哚美辛0.07155 g 500X 溶于2ml 无水乙醇(0.2%) 分装0.02ml/管X100保存：-20℃（三）成脂分化诱导液工作液配制（10ml）1.取DMEM(L)8.72ml加入15ml离心管（BD）;2.加1管Stock A（1ml）；3.加1管Stock B（0.1ml）；4.取1管Stock C（0.1ml）溶解，加入0.01ml；5.加1管Stock E（0.05ml）；6.加1管Stock F（0.02ml）；7.加1管Stock D（0.1ml）；8.测渗透压，调pH7.2-7.4;9.0.22µm微孔过滤，4℃贮存，一周内使用。

3T3-L1前脂肪细胞株的诱导分化1)将3T3-L1前脂肪细胞接种于培养板，用含10%小牛血清的高糖DMEM培液在37℃、5％CO2培养;2)待细胞长满至80-90%，融合2天（融合的意思是指让细胞接触抑制，就是长满后换液让其再长两天）后，加含终浓度为0.5 mmol/L IBMX（储存液浓度0.5 mmol/L）、终浓度为1 umol/L(储存液浓度为1 mg/ml (2.5 mmol/L)) DEX和终浓度为10 ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养48 h；（诱导剂临用时再加到培液中混匀）加入aspirin(5 mM)，salsalate(1、5 mM)3)48 h后换含终浓度为10 ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养液再培养48h，48h后再换10%小牛血清高糖DMEM继续培养，2天后换培养液一次，诱导分化8～12天，3T3-L1细胞90%多呈成熟脂肪细胞表型，可用于实验。

油红O染色1）先小心轻缓倒去培养夜。

2）用pbs轻缓漂洗。

3）加10%多聚甲醛固定30 min。

4）用60％异丙醇洗涤5）油红O母液现用现配：称取0.5g油红O粉末，以异丙醇溶解并定容至100 ml，4℃避光贮存。

稀释油红O母液，油红：去离子水＝3:2，滤纸过滤，室温放置10 min（除去一些杂质，染色结果更清晰）。

6）油红O染色10 min左右，加的体积覆盖住板底即可，如6孔加1. 5 ml，24孔加0.5-1 ml（实际染色时间1小时都可以）。

7）脱色，用75%酒精/60%异丙醇漂洗，除去多余的染料（实际用其他平衡液洗也没问题，背景并不会残留多少）。

8）甘油明胶封片。

9）显微镜观察拍照。

脂肪细胞分化调控机制的研究脂肪细胞是机体内负责储存和消耗脂肪的细胞，其分化调控机制是近年来广受关注的研究领域。

在人体内，脂肪细胞的数量和大小在很大程度上影响了代谢健康和疾病的发展。

因此，深入研究脂肪细胞分化调控机制对于研究代谢性疾病、肥胖症、糖尿病等疾病的病理机制和治疗具有重要价值。

脂肪细胞分化是一个复杂的生物学过程，在该过程中前脂肪细胞通过一系列的生化反应转化为成熟的脂肪细胞，其过程受多种激素、蛋白质和细胞因子的调节。

理解脂肪细胞分化调控机制需要对人体内的调节途径和分子机制有深入的了解。

在生物学研究中，分化调控机制主要包括转录因子、旋转控制机制、信号途径和表观遗传学调控等多个方面。

其中，转录因子是控制分化过程的关键生物大分子，其功能包括调节基因的表达、激活和抑制细胞中的生化反应。

转录因子是脂肪细胞分化中主要的调节因子。

最重要的脂肪细胞特异性转录因子有三个，分别为脂肪细胞增殖物原子（PPARγ）, 瑞登素（C/EBPα）,和瑞登素巨噬细胞分化因子（C/EBPβ）。

这三个基因被称为脂肪细胞分化的“核心三剑客”，它们是嵌合转录因子、转录因子集群、细胞因子、激素和局部信号分子的作用下启动脂肪细胞增殖和分化的关键生物因素。

除此之外，在脂肪细胞分化过程中还有一些细胞因子的参与。

例如TNF分泌异构体（TNFα）在诱导脂肪细胞分化过程中发挥了重要的作用。

TNFα通过调节转录因子表达和调节多个细胞信号途径启动了脂肪细胞生长和分化。

更进一步地，通过该调节机制研究表明，TNFα同样能够诱导脂肪细胞的死亡和脂肪细胞功能障碍，这是与发病相关的分子机制之一。

在脂肪细胞分化的调控机制中，信号途径也是一个重要的调节方式。

信号途径分为内源性和外源性途径。

内源性信号途径主要涉及黄体酮和胰岛素等激素，而外源性信号途径涉及Leptin、Insulin等细胞因子。

胰岛素是维持葡萄糖稳态的重要激素，也是脂肪细胞增殖和形成的重要媒介。

它可以通过刺激细胞内的代谢过程启动胰岛素受体的信号途径，调节细胞能量代谢和生物物质合成，从而启动脂肪细胞分化过程。

3t3-l1细胞诱导分化原理
3T3-L1细胞是一种常用的成纤维细胞株，可通过特定的诱导条件转分化为脂肪细胞。

其诱导分化的原理是通过连续培养和控制细胞外
环境，使细胞经历特定的分化过程。

首先，3T3-L1细胞会被培养在含有高营养的培养基中，其中含有高浓度的葡萄糖和羊血清。

这一步骤有助于细胞增殖和发育。

接下来，在细胞生长至达到密度的时候，减少培养基中营养物的浓度，同时添
加较低浓度的羊血清。

这种改变细胞外环境的操作有助于减少细胞增殖，促进细胞向分化方向发展。

然后，在细胞进入密集生长阶段之后，可以应用一种称为诱导剂
的物质来促使细胞向脂肪细胞分化。

常用的诱导剂有一种混合物，包
括二甲苯和异丙基甲基酰胺(DMI)。

这种物质可以诱导细胞内的转录因
子PPARγ和C/EBPα的表达，这两个转录因子在脂肪细胞分化中起到
关键作用。

最后，在细胞处于诱导剂作用下，可以观察到细胞的形态和特征
从成纤维样逐渐转变为脂肪细胞特征。

这包括细胞膜的变化、细胞内
脂滴的积聚以及与脂肪细胞相关的基因表达的增加。

综上所述，3T3-L1细胞的诱导分化原理主要包括通过调节细胞外环境和应用特定的诱导剂，促使细胞向脂肪细胞方向分化，并最终表
现出脂肪细胞特征。

间充质干细胞成脂成骨分化实验方法学开发思路和流程干细胞是一种具有自我更新能力和多潜能分化的细胞，可以分化成为各种类型的细胞，包括脂肪细胞和骨细胞。

间充质干细胞（MSCs）是一种重要的干细胞类型，它们存在于各种组织中，如骨髓、脂肪组织和胎盘组织等。

间充质干细胞成脂成骨分化的实验方法学开发，是生物医学研究中一个重要的课题。

本文将从方法学开发的思路和流程入手，对间充质干细胞成脂成骨分化实验方法学进行探讨。

一、研究背景间充质干细胞成脂成骨分化是指间充质干细胞在一定的诱导条件下分化为脂肪细胞或骨细胞的过程，这一过程在细胞生物学和再生医学领域具有重要意义。

成脂成骨分化的研究有助于深入了解骨质疏松症、骨折愈合和脂肪代谢等疾病的发病机制，同时也为干细胞治疗提供了理论基础。

因此，开发一套可靠的实验方法学对于间充质干细胞成脂成骨分化研究至关重要。

1.确定分化诱导条件间充质干细胞在体外培养时，可通过添加不同的生长因子、细胞因子或药物来诱导其分化为脂肪细胞或骨细胞。

因此，确定最佳的分化诱导条件是方法学开发的第一步。

此过程需要考虑到诱导因子的种类、浓度、培养时间等因素，以及不同来源的间充质干细胞在分化过程中的差异性。

2.确定评价指标分化过程中，需要通过一系列的生物化学和分子生物学方法来评价间充质干细胞的脂肪细胞或骨细胞特征。

这些评价指标包括脂肪细胞的油红O染色、脂肪球形成实验，以及骨细胞的矿化实验、ALP染色等。

确定合适的评价指标对于评估分化效果至关重要。

3.确定实验方案在确定了分化诱导条件和评价指标后，需要制定详细的实验方案。

包括细胞的处理方法、诱导条件的优化、实验的时间节点等，以便后续实验的顺利进行。

1.间充质干细胞的提取和培养首先需要从适当的组织中分离和提取间充质干细胞，并进行细胞培养。

这一步需要注意细胞的纯度和活性，以保证后续实验的准确性。

2.分化诱导实验将培养好的间充质干细胞分别进行脂肪和骨分化诱导实验，根据预先确定的诱导条件进行处理。

首先细胞数一定要够，接触抑制后，加诱导液，诱导液一（IBMX是SIGMA的，浓度我用0.5m mol/l,配的时候用DMSO浓缩1000倍，DEX我用的是Solarbio分装的100MG的也用DMSO 溶，Ins我用的人用胰岛素，医院买的），最主要的是要细胞代数20代以内，换诱导液2时不用1ML的移液枪加用200ul的慢慢加.让细胞长满以后，接触抑制2天（是细胞退出生长周期），加入含有IBMX（一般使用浓度0.5mmol/L），DEX（地塞米松，一般使用浓度是1umol/L）和insulin（胰岛素，一般使用浓度1-10ug/ml）的培基2天，再换成只含胰岛素的培基2天，然后每两天换液（普通培基）。

这是分化的步骤，但是最关键的是细胞的传代次数，我现在就在做诱导，细胞传代次数较多，分化率很低。

一般说不能超过20代，最好在10代以内。

诱导分化中，细胞的传代数和状态是最重要的。

诱导剂的配制IBMX(异丁基-甲基-黄嘌呤):分子量：222.2（Sigma:I5879）-20度保存用二甲基亚砜DMSO配制111.1mg/ml（0.5mol/L）储存液终浓度为0.5mmol/L,即每100ml培养液加100ul储存液。

DEX：分子量：392.5（Sigma:D4902）-20度保存用无水乙醇配制1mg/ml(2.5mmol/L)储存液终浓度为1umol/L,即每100ml培养液加40ul储存液。

可用2年。

Insulin：分子量：6000 ,4度保存原液为诺和灵R：400IU/10ml终浓度为10ug/ml,即每100ml培养液加600ul原液。

4度保存3T3-L1前脂肪细胞株的诱导分化1)将3T3-L1前脂肪细胞接种于培养板，用含10%小牛血清的高糖DMEM培液在37℃、5％CO2培养;2)待细胞长满至80-90%，融合2天（融合的意思是指让细胞接触抑制，就是长满后换液让其再长两天）后，加含终浓度为0.5mmol/L IBMX（储存液浓度0.5mmol/L）、终浓度为1umol/L(储存液浓度为1mg/ml(2.5mmol/L))DEX 和终浓度为10ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养48h；（诱导剂临用时再加到培液中混匀）3)48h后换含终浓度为10ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养液再培养48h，48h后再换10%小牛血清高糖DMEM继续培养，2天后换培养液一次，诱导分化8～12天3T3-L1细胞90%多呈成熟脂肪细胞表型，可用于实验。

⼲细胞成⾻、成脂、成软⾻诱导分化及检测三个⽅向诱导分化诱导⾻髓间充质⼲细胞成软⾻分化⼀、诱导⽅法将细胞悬液置于 50 mL聚苯⼄烯培养瓶(Nunclon)中培养。

完全培养基中加⼊能诱导MSCs 向软⾻细胞转化的诱导因⼦: (⼀致统⼀的诱导物质)转化⽣长因⼦β1 10ng/ml,（左旋）维⽣素 C 50 mg/L(也有0.1mmol/L)地塞⽶松 0.1nmol/L （也有10 nmol/L）ITS 50mg/ml丙酮酸钠 1mmol/L亚油酸 5.35ug/mg⽜⾎清⽩蛋⽩ 1.25ng/ml。

倒置显微镜逐⽇（1－3 weeks）观察细胞⽣长情况。

细胞长成单层后进⾏传代。

细胞培养3周。

去除培养液,晾⼲,①细胞⽤通⽤Ⅱ型胶原检测试剂盒(晶美⽣物⼯程有限公司) 免疫组化，按试剂盒说明书操作；②⽤alcian blue 孵育5 min, 流⽔冲洗2 min ,麦⽒苏⽊素复染5 min ,流⽔冲洗2 min ,晾⼲，显微镜下观察细胞的蛋⽩聚糖沉积。

或者⽤甲苯胺蓝染⾊，具体我也没做过，查到⼀篇⽂章中是这么说的：MSC成软⾻诱导后的甲苯胺蓝染⾊检测：培养不同时间的MSC培养⽫倒掉诱导培养液，10％甲醛固定lh，⾃来⽔冲洗15min，双蒸⽔冲洗1次，滴加1％甲苯胺蓝染液于培养⽫内，染⾊3h，加⼈95％⼄醇，洗去多余的染液，烘⼲，中性树胶封⽚。

诱导⾻髓间充质⼲细胞成⾻⽅向分化成⾻诱导培养: 取第 3代细胞, 接种⼊含体积分数为0.1 的新⽣⽜⾎清、0.1 µmol/L 地塞⽶松、50 µmol/L 抗坏⾎酸、10 mmol/L β- ⽢油磷酸钠的⾼糖 DMEM培养基进⾏成⾻诱导培养, 进⾏形态观察、功能检测。

间充质⼲细胞成⾻特性检测:①碱性磷酸酶组织化学染⾊:取成⾻诱导 14 d 的细胞 , 40 g/L 中性甲醛固定 15 min, Gomori改良钙钴法染⾊。

取 5 块玻⽚, 每⽚随机取 2个视野, 采⽤⽹格计数法, 计算碱性磷酸酶染⾊阳性细胞的百分⽐。

Sigma的试剂：IBMX（Sigma I-7018)Dexamethasone (Sigma D-4902)Insulin (Bovine; Sigma I-5500)gibco血清：小牛血清 (GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198)胎牛血清(GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566)培养基DMEM;（GibcoBRL-Cat# 11965-084）MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070)Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016)一: 本次3T3-L1细胞共一25cm3培养瓶消化后传代分为2个10cm培养皿， 3天后每个10cm 皿分别传代3个10cm皿。

共6个10cm皿，将其中5个皿细胞冻存于-80°，将一个10cm皿中3t3-l1细胞分别接种于一个6孔板一个12孔板其中4孔和2个10cm皿，待2个10cm 皿中细胞铺满90%后消化冻存于-80。

二：6孔板和12孔板4孔即将用于分化。

两者均在细胞铺满90%左右接触抑制2d开始加诱导剂，诱导方案严格按照之前计划的施行，诱导剂①培养2d后换为诱导剂②培养2d，后换诱导剂③培养，以后每48h换液，均采用诱导剂③，8天左右即可看到脂滴，此次整个诱导过程共用14天，出脂滴后继续48h换液，目的主要是获得更多的脂肪细胞。

三：3t3-l1诱导分化过程整体较为顺利，之前考虑到的诸如细胞可能贴壁不牢，易漂浮的情况基本未出现（漂浮很少），诱导剂配置过程中由于剂量极低，担心的浓度不准问题，后证明对分化影响不是很大。

一、诱导液配制1、4,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液（IBMX）配制。

分子量222，几乎不溶于水，现配现用，过滤除菌。

100×母液（50mmol/L）： IBMX+940ul超纯水+60ul 1mol/L KOH。

首先细胞数一定要够，接触抑制后，加诱导液，诱导液一（IBMX是SIGMA的，浓度我用0.5m mol/l,配的时候用DMSO浓缩1000倍，DEX我用的是Solarbio分装的100MG的也用DMSO溶，Ins我用的人用胰岛素，医院买的），最主要的是要细胞代数20代以内，换诱导液2时不用1ML的移液枪加用200ul的慢慢加.让细胞长满以后，接触抑制2天（是细胞退出生长周期），加入含有IBMX（一般使用浓度0.5mmol/L），DEX（地塞米松，一般使用浓度是1umol/L）和insulin（胰岛素，一般使用浓度1-10ug/ml）的培基2天，再换成只含胰岛素的培基2天，然后每两天换液（普通培基）。

这是分化的步骤，但是最关键的是细胞的传代次数，我现在就在做诱导，细胞传代次数较多，分化率很低。

一般说不能超过20代，最好在10代以内。

诱导分化中，细胞的传代数和状态是最重要的。

诱导剂的配制IBMX(异丁基-甲基-黄嘌呤):分子量：222.2（Sigma:I5879）-20度保存用二甲基亚砜DMSO配制111.1mg/ml（0.5mol/L）储存液终浓度为0.5mmol/L,即每100ml培养液加100ul储存液。

DEX：分子量：392.5（Sigma:D4902）-20度保存用无水乙醇配制1mg/ml(2.5mmol/L)储存液终浓度为1umol/L,即每100ml培养液加40ul储存液。

可用2年。

Insulin：分子量：6000 ,4度保存原液为诺和灵R：400IU/10ml终浓度为10ug/ml,即每100ml培养液加600ul原液。

4度保存3T3-L1前脂肪细胞株的诱导分化1)将3T3-L1前脂肪细胞接种于培养板，用含10%小牛血清的高糖DMEM培液在37℃、5％CO2培养;2)待细胞长满至80-90%，融合2天（融合的意思是指让细胞接触抑制，就是长满后换液让其再长两天）后，加含终浓度为0.5mmol/L IBMX（储存液浓度0.5mmol/L）、终浓度为1umol/L(储存液浓度为1mg/ml(2.5mmol/L))DEX 和终浓度为10ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养48h；（诱导剂临用时再加到培液中混匀）3)48h后换含终浓度为10ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养液再培养48h，48h后再换10%小牛血清高糖DMEM继续培养，2天后换培养液一次，诱导分化8～12天3T3-L1细胞90%多呈成熟脂肪细胞表型，可用于实验。

无血清原代培养人前脂肪细胞并诱导分化1朱惠娟，史轶蘩，邓洁英，龚凤英中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院内分泌科（100730）E-mail：huijuanzhu@摘 要：采用胶原酶消化法从人皮下脂肪中分离并原代培养人前脂肪细胞，通过对细胞形态学的观察、油红O对细胞内脂质染色，以及脂肪细胞标志性酶G-3-PDH活性的测定对细胞进行鉴定。

摸索在无血清条件下培养并诱导人前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的条件。

在无血清的基础培养基中前脂肪细胞可以维持增殖，增殖期的第3-10天为对数增长期。

无血清分化培养基培养4天后细胞形态逐渐变圆，并出现球性脂滴，脂滴的数量逐渐增多至分化培养的第21天到达顶峰。

在无血清培养的状态下成功诱导前脂肪细胞向脂肪细胞的分化，为研究激素或细胞因子对前脂肪细胞的增殖或分化机制的研究打下了的基础。

关键词：无血清培养，原代培养，前脂肪细胞，增殖，分化1．引言随着全球经济的迅猛发展和物质的高度丰富，肥胖症正在以惊人的速度取代感染性和营养不良性疾病威胁人类的健康。

导致机体肥胖的脂肪组织是由脂肪细胞、前脂肪细胞、微血管内皮细胞和细胞外的基质成分组成的（1），过多热量以甘油三脂的形式存储在脂肪细胞内，脂肪细胞是在不同的转录因子诱导一系列特异基因表达下由前脂肪细胞分化而来的，而前脂肪细胞起源于胚胎中胚层的多能干细胞（2-4）。

目前认为在胚胎期就存在分化的脂肪细胞，在胚胎发育的后期和出生后的儿童期脂肪细胞迅速分化，到了成人期，虽然主要以脂肪细胞的体积增加为主，但前脂肪细胞仍然保留了分化能力，在适当的生理条件诱导下能够不断地分化成为脂肪细胞。

目前对前脂肪细胞的研究主要是通过体外细胞培养的方法进行的。

目前体外用于前脂肪细胞和脂肪细胞研究的细胞系主要有三类：1）来自胚胎的全潜能（totipotent）胚胎干细胞,能生成各种细胞系（ES细胞）(5)。

12）以C3H10T1/2、NIH3T3为代表的多潜能（multipotent）干细胞系；3）以3T3-L1、3T3-F442和Ob17为主的前脂肪细胞系是目前应用最广泛的前脂肪细胞分化为脂肪细胞研究的细胞系。