复合酶中糖化酶活力的测定_郑曼新

SHANDONGＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ发酵工艺学实验报告糖化酶发酵、提取及活力测定实验学院：生命科学学院专业班级：生物工程1602项目组成员：刘松良、张金中、蔡超、何建雨、周钻钻指导教师：王丽娟2018年6月糖化酶发酵、提取及活力测定实验何健雨王丽娟生命科学学院生工1602班1. 实验目的(1)了解黑曲霉生长特性,学习糖化酶发酵工艺；(2)了解黑曲霉生长特性,学习糖化酶发酵工艺。

(3)学习并掌握糖化酶活力测定方法2. 实验原理葡萄糖淀粉酶( glucoamylase,EC.3.3.13)系统名为淀粉a-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶,俗称糖化酶,是国内酶制剂中产量最大的品种。

糖化酶对淀粉分子的作用是从非还原性末端切开a-1,4键,也能切开a-1,3键和a-1,6键,生成葡萄糖。

生产糖化酶常用的菌种是黑曲霉,将活化好的黑曲霉制成孢子悬浮液,转接接到三角瓶直接进行发酵,或转接到三角瓶作为种子,进行一次扩大培养后,再转接到发酵罐进行糖化酶发酵。

黑曲霉糖化酶是一种胞外酶。

首先采用过滤法将菌体等杂质除去,继而对滤液进行浓缩,最后用有机溶剂如乙醇将酶沉淀出来,对沉淀物进行干燥,加工成成品。

糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解a-1,4键,生成葡萄糖。

葡萄糖分子中含有的醛基能被次碘酸钠氧化,过量的次碘酸钠钠,酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液标定,计算酶活力。

酶活力定义:1g固体酶粉(或1mL液体酶),于559CpH4.6的条件下,1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖,即为一个酶活力单位,以U/mL(U/g)表示。

3. 实验材料优质大麦芽粉、大米粉、酒花；耐高温-α淀粉酶、糖化酶；乳酸（磷酸）；0.025 mol/L碘液；温度计（100℃）、恒温水浴锅、糖度计、布氏漏斗、分析天平、纱布、玻璃仪器。

4. 方法步骤待测酶液的制备:称取酶粉1-2g,精确至0.0002g,先用少量的乙酸缓冲液溶解,并用玻璃棒捣研,将上请液小心倾入容量瓶中。

糖化酶活力测定1. 定义1g 固体酶粉(或 1ml 液体酶,于 40℃、 pH 值为 4.6的条件下, 1h 分解可溶性淀粉产生 1mg 葡萄糖,即为 1个酶活力单位,以 u/g(u/ml表示。

2. 原理糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。

葡萄糖分子中含有醛基, 能被次碘酸钠氧化, 过量的次碘酸钠酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液滴定,计算酶活力。

3. 试剂和溶液(1乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH 为 4.6。

称取乙酸钠(CH3COONa·3H2O 6.7g ,溶于水中,加冰乙酸(CH3COOH 2.6ml ,用水定容至 1000ml 。

配好后用 pH 计校正。

(2硫代硫酸钠标准溶液(Na2S2O3, 0.05mol/L。

(3碘溶液(1/2I2, 0.1mol/L。

(4氢氧化钠溶液(NaOH , 0.1mol/L。

(5 200g/L可溶性氢氧化钠溶液。

(6硫酸溶液(2mol/L。

(7 20g/L可溶性淀粉溶液。

(8 10g/L淀粉指示液。

4. 仪器和设备恒温水浴锅、秒表、比色管、玻璃仪器。

5. 步骤(1 待测酶液的制备称取酶粉 1~2g , 精确至 0.0002g (或吸取液体酶 1.00ml , 先用少量的乙酸缓冲液溶解, 并用玻璃棒捣研, 将上清液小心倾入容量瓶中。

沉渣部分再加入少量缓冲液,如此捣研 3~4次,最后全部移入容量瓶中,用缓冲液定容至刻度(估计酶活力在 100~250u/ml范围内,摇匀。

通过 4层纱布过滤,滤液供测定用。

(2测定于甲、乙两支 50ml 比色管中,分别加入可溶性淀粉 25ml 及缓冲液 5ml ,摇匀后,于 40℃恒温水浴中预热 5min 。

在甲管(样品中加入待测酶液 2ml , 立刻摇匀, 在此温度下准确反应 30min , 立刻各加入氢氧化钠溶液 0.2ml , 摇匀,将两管取出迅速冷却,并于乙管(空白中补加待测酶液 2ml ,吸取上述反应液与空白液 5ml ,分别置于碘量瓶中,准确加入碘溶液 10ml ,再加氢氧化钠溶液 15ml ,摇匀,密塞,于暗处反应15min 。

技术总结报告根霉固体发酵高产糖化酶发酵条件优化、酶学性质的研究以及应用糖化酶是世界上生产量最大应用范围最广的酶类，根霉在自然界分布很广，用途广泛，其糖化酶活性很强，是酿造工业中常用糖化菌。

我国最早利用根霉糖化淀粉（即阿明诺法）生产酒精。

根霉能生产延胡索酸、乳酸等有机酸，还能产生芳香性的酯类物质。

根霉亦是转化甾族化合物的重要菌类。

现在一般采用的诱变技术来获得高产菌株，例如在酿酒工业中。

此过程中虽然操作简单，但是运用诱变之后的菌株不稳定，容易发生变异，从而产量下降。

从自然条件中筛选产稳定高产根霉，不易变异，更实用于生产。

根霉所产生的糖化酶在白酒酿造、啤酒酿造、冰冻食品生产、饲料生产、食醋酿造中都有较广的应用。

固体发酵培养基单纯，发酵原料成本较经济；基质前处理较液体发酵少，不需特殊机具；因水分少可减少杂菌污染，此种低灭菌步骤即可施行的发酵，适合低技术地区使用；固体发酵相当于使用相当高的培养基，且能用较小的反应器进行发酵，单位体积的产量较液体为高；下游的回收纯化过程及废弃物处理通常较简化或单纯，常是整个基质都被使用，无废弃物的问题；固体发酵可食品产生特殊风味，并提高营养价值。

固体发酵法目前主要用在传统的发酵工业中。

例如：酱油的生产，从菌种培养到制曲，再到发酵都采用固体法。

发酵条件相对比较开放，工艺简单，设备要求简单，成本相对比较低。

虽然最近有的厂家也采用深层液体发酵，但在口味上明显与固体发酵无法比拟。

又如在食醋的生产上有的厂家采用前液后固，目的在于提高食醋的风味。

随着社会的进步，环境问题、食品安全卫生以及能源问题越来越成为人们关注的问题，可持续发展已成为社会经济发展的必然趋势。

作为可再生资源综合利用最有希望的固体发酵技术，是有效解决上述问题的途径之一。

如今科学技术进步越来越快，而作为传统工艺的固体发酵技术却进步较小。

但固体发酵在酿酒等工业生产中的作用却越来越突显。

本项目通过对筛选出的根霉固体发酵高产糖化酶菌株进行条件优化和酶学性质的研究，从而对该高产菌株进行实际应用。

华南农业大学综合实验报告实验项目名称：糖化酶活力测定实验项目性质：综合实验计划学时：2学时所属课程名称：食品与发酵工业分析班级：10级生物工程1班姓名：肖佩学号：************指导老师：沈玉栋徐振林一．实验原理采用可溶性淀粉为底物，在一定的pH值与温度下，使之水解为葡萄糖(还原糖)，以直接滴定法测定。

二．试剂及仪器（1）碱性酒石酸铜甲溶液（使用时等体积混合甲、乙溶液）：甲液：称取15.693g硫酸铜(Cu2SO4·5H2O)，0.05g次甲基蓝，用水溶解并稀释定容至1000mL；乙液：称取50g酒石酸钠钾，54g氢氧化钠，4g亚铁氰化钾，用水溶解并稀释定容至1000mL（2）0.1%标准葡萄糖溶液：准确称取1g无水葡萄糖（预先在100-1050C 烘干），用水溶解，加5mL浓盐酸，用水定容至1000mL。

（3）pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液：0.2mol/L乙酸溶液：量取11.8mL冰乙酸，用水稀释至1000mL；0.2mol/L 乙酸钠溶液：称取27.2g乙酸钠（CH3COONa·3H2O），用水定容至1000mL；pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲液：取0.2mol/L的乙酸溶液和0.2mol/L的乙酸钠溶液等体积混合。

（4）0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，用水溶解并定容至1000mL。

（5）2%可溶性淀粉溶液：准确称取2g可溶性淀粉（预先于10-105 0C烘干），加少量水调匀，倾入80mL沸水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100mL。

（6）固体曲（7）滴定管、电子天平、烧杯、恒温水浴锅、脱脂棉、容量瓶、移液管、三角瓶三．测定步骤（1）5%固体曲浸出液制备：称取5.0g固体曲（以绝干曲计），置于250mL 烧杯中，加90mL水和10mL pH4.6乙酸－乙酸钠缓冲溶液，搅匀，于30℃水浴中保温浸1小时，每隔15min 搅拌一次。

用脱脂棉过滤，滤液为5％固体曲浸出液。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910205311.4(22)申请日 2019.03.18(71)申请人 中粮集团有限公司地址 102209 北京市昌平区北七家镇未来科技城南区四路申请人 吉林中粮生化有限公司　南京百斯杰生物工程有限公司(72)发明人 佟毅　章方良　李义　周旭　许宏贤　彭辉　白挨玺　周鹏　陶进　(74)专利代理机构 北京润平知识产权代理有限公司 11283代理人 刘依云　乔雪微(51)Int.Cl.C12N 9/34(2006.01)C12N 9/44(2006.01)C12P 19/02(2006.01) (54)发明名称复合糖化酶制剂和淀粉糖化的方法(57)摘要本发明涉及生产淀粉糖领域，具体涉及复合糖化酶制剂和淀粉糖化的方法。

所述制剂含有第一糖化酶和普鲁兰酶，所述第一糖化酶为失活agdB基因后的黑曲霉分泌的糖化酶，第一糖化酶与普鲁兰酶的酶活比例为(7.5-80)：1。

本发明所述复合糖化酶制剂可以有效地减少逆反应，得到产物的DX较高，同时可以大幅缩短糖化周期，延长糖化窗口。

权利要求书1页 说明书14页序列表2页CN 110004128 A 2019.07.12C N 110004128A权　利　要　求　书1/1页CN 110004128 A1.一种复合糖化酶制剂，所述制剂含有第一糖化酶和普鲁兰酶，所述第一糖化酶为失活agdB基因后的黑曲霉分泌的糖化酶。

2.根据权利要求1所述的复合糖化酶制剂，其中，所述第一糖化酶与普鲁兰酶的酶活比例为(7.5-80)：1。

3.根据权利要求1所述的复合糖化酶制剂，其中，所述第一糖化酶与普鲁兰酶的酶活比例为(10-60)：1。

4.一种淀粉糖化的方法，所述方法包括：(1)配置料液；(2)在权利要求1-3中任意一项所述的复合糖化酶制剂的存在下对料液进行糖化。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述料液通过质量浓度为28％-65％的淀粉溶液经α-淀粉酶液化得到。

可编辑修改精选全文完整版3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定糖化酶活力一、原理糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。

在煮沸条件下，葡萄糖在碱性介质中被3,5-二硝基水杨酸(DNS)氧化成葡萄糖酸，而3,5-二硝基水杨酸被还原成红褐色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出淀粉经糖化酶水解后产生的葡萄糖总量。

由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

反应过程如下：二、仪器、试剂1、仪器1)具塞玻璃刻度比色管：25mL×19；2)烧杯：100mL×4；3)三角瓶：100mL×1；4)容量瓶：100mL×3，50mL×3；5)刻度吸管：1mL×4；2mL×3；10mL×1；6)沸水浴；7)冰浴；8)扭力天平；9) UV —2802SH 型紫外可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司； 2、试剂1) 1mg/mL 葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg ，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL ，混匀，4℃冰箱中保存备用。

2) 3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂将6.3g DNS 和262mL 2M NaOH 溶液，加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL ，贮于棕色瓶中备用。

三、操作步骤1、葡萄糖标准曲线的绘制取7支25mL 具塞刻度比色管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。

糖化酶活力的测定一、实验目的1、学习糖化型淀粉酶(或液体曲)酶活力的测定方法。

2、了解糖化型淀粉酶活力大小对工艺生产的指导意义。

二、实验原理糖化型淀粉酶可催化淀粉水解生成葡萄糖。

本实验在一定条件下用一定量的糖化型淀粉酶作用于淀粉，然后用碘量法测定所生成的葡萄糖的含量来计算淀粉酶的活力。

碘量法定糖原理：淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖，葡萄搪具有还原性，其羰基易被弱氧化剂次碘酸钠所氧化：I2+2NaOH=NaIO+NaI+H2ONaIO+C6H12O6=NaI+CH2OH(CHOH)4COOH+NaI体系中加入过量的碘，氧化反应完成后用硫代替硫酸钠滴定过量的碘，即可推算出酶的活力。

I2＋2Na2S2O3 = Na2S4O6＋2NaI三、仪器、原料和试剂仪器吸管(25mL，5mL，2mL，10mL)、定碘瓶(500mL)、碱式滴定管、烧杯、恒温水浴锅、分析天平。

原料：AS3.4309黑曲霉斜面试管菌；麸皮、稻壳。

试剂1. 2％可溶性淀粉溶液：准确称取2克可溶性淀粉(预先于100~105℃烘干至恒重约2小时)，加少量蒸馏水调匀。

倾入80毫升左右的沸蒸馏水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100毫升。

2. 0.05 mol/L碘液：称取25克碘化钾溶于少量水中，加入12.7克碘，溶解后定容至1000毫升。

3. pH4.5的1mol/L醋酸缓冲液：称取8.204克无水醋酸钠，先在少量水中溶解，定容至1000毫升。

取分析纯冰醋酸5.78毫升定容至1000毫升。

以上两种溶液按醋酸和醋酸钠的体积比为25：22混合即为所要求之缓冲液。

4. 0.1 mol/L氢氧化钠溶液：称取分析纯氢氧化钠4克溶解并定容至1000毫升。

5. 1 mol/L硫酸：吸取分析纯浓硫酸(比重1.84)55.5毫升，缓缓如入944.5毫升水定容至1000毫升。

6. 0.01 mol/L硫代硫酸钠：称取26克硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)和0.4克碳酸钠，用煮沸冷却的蒸馏水溶解并定容至1000毫升，配制后放置三天再标定。

一种复合酶溶液、酒精检测试纸及其制备方法和应用技术领域本发明涉及电化学生化检测领域，具体涉及一种复合酶溶液、酒精检测试纸及其制备方法和应用。

背景技术近年来，随着交通运输业的迅速发展，机动车数量和拥有驾照的人员数量快速增长，与此同时，各类交通事故数量也在增加。

在这些交通事故中，饮酒和醉酒造成的交通事故高达20％以上。

因此，快速、准确的检测驾驶员的人体酒精浓度受到人们越来越多的关注。

酒精检测在法医学和临床检验中具有重要的作用，检测血液或者唾液酒精浓度，可以用来诊断急性酒精中毒以及与酒精滥用相关的一些综合症。

目前，主要的酒精测试方法包括：呼气酒精检测、分光光度法和气相色谱法。

其中，呼吸式设备价格昂贵，特异性差，干扰多，测试的可靠性比较差；分光光度法的灵敏度高，重复性好，线性范围宽，但是样品需要稀释，预处理繁琐；气相色谱法测定时间比较长，检测费用比较高，合适批量检测。

而且，目前市场上用的半定量唾液酒精试纸，测试准确度不高，不能进行准确的定量测试；且部分试酒精试纸存在酶活化成分有毒，对人体有害，污染环境，无法有效平衡酶的活性和稳定性的问题。

此外，目前技术制作的半定量唾液酒精试纸，存在部分底色不正常，导致测试结果误差大。

然而，定量测试血液或者唾液中酒精浓度，对于部分驾驶人员喝了少量酒，测试是否达到酒驾以及诊断急性酒精中毒等具有重要作用。

CN107607730A公开了一种用于检测唾液中酒精含量的试剂条、制备方法和试剂盒。

所述试剂条包括牛血清白蛋白和海藻酸钠。

所述牛血清白蛋白可与乙醇氧化酶和辣根过氧化物酶溶液均匀混合，防止酶的分解和非特异性吸附，避免了产品检测时产生假阳性的现象，使产品具有更优良的稳定性，然而该试剂条属于半定量试纸条测试，存在检测不够准确，无法进行准确定量检测的问题。

CN103267758A公开了一种用于测试唾液中酒精含量的干化学法快速诊断试剂条及其制备方法。

它包括用于支撑反应物体系的支持物；用于吸附所述反应物的滤纸；所述反应物包括为显色剂、乙醇氧化酶和/或过氧化物酶、含氮杂环化合物以及添加剂，所述添加剂为牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮或乙基纤维素中的一种或两种以上。