香豆素分析

2．紫外光区扫描法测定独活中蛇床子素含量 取独活粗粉约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中， 加乙醇 20ml ，超声处理 30min ，放冷，滤过，滤液 置25ml量瓶中，用少量乙醇分次洗残渣，洗液并入 同一量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，作为供试品溶 液。另取蛇床子素对照品适量，精密称定，加乙醇 制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。 精密吸取供试品溶液2μl、对照品溶液1μl与2μl， 分别交叉点于同一硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯 （ 30 ： 1 ）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外 光灯（365nm ）下检视定位，照薄层色谱法进行扫 描，λs322nm，λR370nm，测量供试品吸收度积分值 与对照品吸收度积分值，计算，即得。 本品含蛇床子素（C15H16O3）不得少于0.30%。
OH COOH
-H2O 7 6 5 4 8 1
O
2 3
O

分子中苯核或α- 吡喃酮环上常有取代基存在， 如羟基、烷氧基、苯基、异戊烯基等
香豆素按结构分为
简单香豆素——只在苯环上有取代基的 呋喃香豆素 —— 线型（6、7～）； 角型（7、8～） 吡喃香豆素——线型（6、7～）； 角型（7、8～） 其他香豆素—— α－吡喃酮环上有取代基的
1．6,7-呋喃香豆素（线型）

C6、C7位与呋喃环稠合（6位异戊烯基 与7位羟基环合，降解失去三个碳原子） 的衍生物，称为线型。
O O O
O OCH3 O O
H3C HO CH3
O
O
O
补骨脂内酯
花椒毒内酯
紫花前胡内酯
2．7,8-呋喃香豆素（角型）

C7、C8位与呋喃环稠合（8位异戊烯基 与7位羟基环合）的衍生物，称为角型。
2

与碱的反应
香豆素类化合物分子中具α,β-不饱和内酯结构， 具有内酯化合物的通性。如在稀碱性条件下加 热可水解开环，生成易溶于水的顺式邻羟基桂 皮酸盐。酸化后又闭环恢复为亲脂性内酯结构。 与碱液长时间加热，顺式邻羟基桂皮酸盐则发 生双键构型的异构化，转变为稳定的反式邻羟 基桂皮酸盐，此时，再经酸化也不能环合为内 酯。

（一）简单香豆素类
基本结构即苯并α-吡喃酮。 苯环上常见羟基、甲氧基、亚甲二氧基 和异戊烯基等取代基。

RO
CH3O CH3O O O
HO
O
O
HO
O
O
伞形花内酯 七叶内酯 R = H 七叶苷 R = glc
滨蒿内酯
（二）呋喃香豆素类

基本结构为香豆素母核苯环与呋喃环稠合， 根据稠合位置可分为线型与角型。
OHO COO- + O OH C6H5 N O CH3 CH3 N NH2 C6H5 N O OH CH3 CH3 N N COO-
4
荧光与紫外吸收
（1）香豆素类化合物在紫外光的照射下显蓝色 荧光，不但作为定性鉴别，而且作为定量测定 依据。 但具有荧光的化合物不一定都是香豆素，如咖 啡酸、绿原酸等在UV下也能呈现蓝色荧光，二 氢黄酮则呈天蓝色荧光。 此外，个别的香豆素类化合物（如双香豆素） 不产生荧光。
OH
紫苜蓿酚
茵陈炔
二、 分布

香豆素类成分广泛分布于植物界，如伞形 科、夹竹桃科、萝藦科、菊科、十字花科、杜 鹃花科、豆科、唇形科、兰科、禾本科、芸香 科、蔷薇科、茄科、无患子科、瑞香科等植物 中均有较多分布。 含有香豆素类化合物的常用中药有白芷、秦 皮、独活、前胡、阿魏、当归、补骨脂、茵陈 蒿、川芎、防风、蛇床子等。
*
（2）羟基香豆素在紫外光下有强的荧光，不难辨 认；呋喃香豆素较弱，但也能在紫外光下显示蓝、 紫、棕、绿、黄等色。必要时可喷10% KOH醇液， 或20% SbCl3氯仿液以显色。 （3）香豆素类化合物羟基和芳环形成的共轭体系 具较强的紫外特征吸收，不同的香豆素化合物在 不同pH条件下表现不同的光谱特性，对该类成分 的分析具重要意义。
薄层色谱法
1．应用特点
薄层色谱法可用于含多类成分的中药的鉴别，可用标准 品或标准药材对照，再与上述荧光反应、颜色反应配合， 即可方便、快速鉴别含香豆素类化合物的中药。 因香豆素类成分大都具荧光，含香豆素类中药提取物， 在硅胶板上的色谱指纹图具一定的鉴别意义， 可用化学对照品对照； 可以使用经准确鉴定学名的标准药材做对照品；
30
第三节 香豆素定量分析
含香豆素成分的中药定量测定方法有比色法、荧 光法、极谱法、紫外分光光度法、薄层色谱法、高 效液相色谱法、气相色谱法等。 每种方法都有其特点，有的简单，有的操作麻烦， 有的则需要一定的仪器设备。 相比之下，因该类成分多具有较强的荧光，故可 荧光分光光度法进行定量分析；薄层扫描法测其紫 外吸收或荧光的方法较简便快速，兼有分离功能， 应用日趋普遍；近年来又有了分离效率较高的高效 液相色谱技术，对复杂的中药样品更为合适。
33
二．薄层色谱法
1．荧光扫描法测定蛇床子中蛇床子素含量 精密称取在 P2O5 干燥器中减压干燥至恒重的蛇 床子粉末 1g ，置具塞锥形瓶中 ，精密加入乙醇 20ml ，振摇后放置过夜，滤过，取续滤液，作为 供试品溶液。另取蛇床子素对照品适量，精密称 定，加乙醇制1mg/ml的溶液，作为对照品溶液。 精密吸取上述两种溶液各1μl，分别交叉点于同 一硅胶Ｇ薄层板上，以苯- 乙酸乙酯（30：1）为 展开剂，展开，取出，晾干。 照薄层色谱法进行荧光扫描，激发波长λX365nm ，测量供试品与对照品荧光强度积分值. 本品含蛇床子素（C15H16O3）不得少于1.0％ 。 34
（2）酚类试剂反应： 因该类化合物多具酚羟基，能和常规酚类试剂 反应，如三氯化铁、硝酸银的氨溶液、三氯化铁 铁氰化钾。 如果香豆素化合物的C6位上（即酚羟基的对位） 没有取代基，则能和 Emerson试剂反应现橙~红色； 与Gibbs试剂反应现蓝色。 Emerson反应是将香豆素类化合物溶于碱性溶液 中，加入2% 4- 氨基安替比林溶液数滴及8%铁氰化 钾溶液2~3滴即可显色，其反应如下：
2．7,8-吡喃香豆素（角型）

C7、C8位与吡喃环稠合（8位异戊烯基与 7位羟基环合）的衍生物。
OCH3 O
O
O
O
O
O
O
O
邪蒿内酯
黄曲霉素B1
（四）其他香豆素类

具有抗凝血作用的紫苜蓿酚 (sativol) 属双 香豆素类；茵陈炔 (capillone) 属异香豆素 类。
O O O O
O O
OH
2．颜色反应
（1）蛇床子的鉴别 取蛇床子粉末2g，加乙醇20ml，加热回流30min， 滤过。取滤液数滴，点于白瓷板上，置紫外光灯 （365nm）下观察，显蓝紫色荧光； 另取滤液 2ml，加等量的3％碳酸钠溶液，加热 5min ，放冷，再加新制的重氮对硝基苯胺试液 1~2滴，即显樱红色。
（2）白芷的鉴别 取少量样品粉末，加乙醚，振摇5min后静 置20min，取上清液 1ml，加入7%盐酸羟胺 甲醇溶液2~3滴，20%KOH甲醇溶液2~3滴 ，摇匀，在水溶上微热，冷却后加稀盐酸 调到pH 3 ~ 4，然后加入1%三氯化铁乙醇溶 液1~2滴，溶液显紫红色。
一．荧光分光光度法
1、应用概况

香豆素类化合物在紫外光的照射下显蓝色荧光， 可用荧光分光光度法测定。如 7- 羟基香豆素和香 豆素混合物的测定，前者用370nm激发，在450nm 测定，浓度为 1~10µg／ ml 时荧光与浓度成线性失 系。后者用361nm激发，在491nm测荧光。 如果香豆素7位上有乙氧基（代谢产物）可使其变 为7- 羟基香豆素用390nm激发，440nm测定。
第二节 香豆素定性分析
定性分析
化学定性分析： 荧光法 显色反应
色谱定性分析： 薄层色谱法 高效液相法 气相色谱法
化学定性方法：
1．荧光反应
（1）秦皮的鉴别 取秦皮，加热水浸泡，浸出液在日光下可见碧 蓝色荧光。 （2）前胡的鉴别 取前胡粉末1g，加乙醚10ml，浸渍2h后，取乙 醚液2 滴，分别点于两张小滤纸片上，置紫外光 灯（365nm）下观察，显淡天蓝色荧光。然后滴 加15％氢氧化钠溶液数滴，2 min后荧光消失。 将一张滤纸片避光保存，另一张滤纸片曝光， 约3h后，置紫外光灯（365nm）下观察，曝光者 天蓝色荧光加强，避光者不显荧光。

三、理化性质
1 2
通性 与碱的反应
3 4
显色反应
荧光与紫外吸收
1
通性
多具芳香气，能随水蒸气挥发或升华。
不溶于水或难溶于水，可溶于石油醚、苯、 乙醚、氯仿或乙醇等溶剂中；一般含氧取代 基的香豆素衍生物，在石油醚中的溶解度比 较小，冷的情况下更小。 在定量测定时，多用氯仿和乙醇来提取。
香豆素分析
杨杰 cpusyj@163.com
概述

香豆素及其衍生物是中药中的主要成分之一， 具有多种生理活性，临床上用于止咳、利尿、 抗菌、抗放射、抗凝血等。
香豆素分析
举例
定量分析 定性分析 定义、分布、性质
第一节 结构、分布、理化性质
一、结构

香豆素从结构上可看成是顺式的邻羟基桂皮酸 脱水而成的内酯，基本母核为苯并α-吡喃酮。
OH O O
-

OH OCOO
-
-
COOO-
H+
顺式邻羟基桂皮酸
反式邻羟基桂皮酸
3
显色反应
（1）异羟基肟酸铁反应： 因香豆素具有内酯环，所以能与异羟基肟酸铁 反应，产生紫红色，可被用来鉴别和比色测定， 其反应如下：
NH2OH O O NaOH NH ONa O OH Fe
3+
,H
+
NH ONa O O Fe 1 3
硅胶薄层色谱常用的展开系统有：

氯仿； 含1.5%乙醇氯仿； 乙醚- 苯（1：1）； 乙醚- 苯- 10%乙酸（1：1：1）等
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2、应用实例
白芷的薄层定性分析 取白芷粉末0.5g，加乙醚10ml，浸泡1h，时时振 摇，滤过，滤液挥干乙醚，残渣加醋酸乙酯1ml使 溶解，作为供试品溶液。另取欧前胡素、异欧前 胡素对照品，加醋酸乙酯制成每 1ml 各含 1mg 的混 合溶液，作为对照品溶液。 吸取上述两种溶液各4µl，分别点于同一以羧甲 基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚 （30~60℃）- 乙醚（3：2）为展开剂，在25℃以 下展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检 视。供试品色谱中，在与对照品色谱相对应的位 置上，显相同颜色的斑点。
35
三、高效液相色谱法
1．白芷中3种香豆素的测定 测定氧化前胡素（oxypeucedanin，Ⅰ）， 欧前胡素（imperatorin，Ⅱ）和异欧前胡素（ isoimperatorin，Ⅲ），其方法是：准确称取Ⅰ 、Ⅱ、Ⅲ标准品各5mg，用乙酸乙酯溶解，定 容至50ml，分别取此溶液0.5、1.0、1.5、2.0、 2.5、3.0ml，均用乙酸乙酯定容至10m1，制得 6 个不同浓度的标准溶液。

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2．应用实例
（1）佛手油中的香豆素分析 可用硅胶GF254薄层分离，以己烷- 醋酸乙酯 （3：1）展开，分出4个荧光点即：柠美内酯（ Citropten）Ⅰ；5- 牻牛儿氧基-7-甲氧基香豆素（5geranyloxy-7-methydroxycoumarin）Ⅱ；佛手内酯Ⅲ 和佛手柑亭（bergamottin）Ⅳ，可直接在薄层上进 行荧光测定，对于Ⅰ和Ⅱ用330nm激发，424nm测 定荧光，Ⅲ和Ⅳ用272nm激发，520nm测定。
OCH3 CH3OHale Waihona Puke Baidu
OCH3
O
O
O
O O O
O
O
O
异补骨脂内酯 茴芹内酯
异佛手内酯
（三）吡喃香豆素类

基本结构为香豆素母核苯环与吡喃环稠合， 也分为线型和角型。
1．6,7-吡喃香豆素（线型）

C6、C7位与吡喃环稠合（6位异戊烯 基与7位羟基环合）的衍生物。
O OCH3 O O
O
O
O
花椒内酯
美花椒内酯
按下述条件进行HPLC分析：以µ-Bondapak C18柱为色谱 分离柱，加预柱以防样品污染分析柱，流动相为甲醇- 水 （70：30），流速1.0ml／min，UV 254nm检测各组分峰， 进样 10µl，以峰面积为纵坐标，各成分浓度为横坐标， 得3条通过原点的直线，线性范围0.005 ~ 0.05mg／ml，其 回归方程如下： 氧化前胡素 Y = 1521X + 25.40， r = 0.999 欧前胡素 Y = 1953X + 76.53， r = 1.000 异欧前胡素 Y = 1930X + 53.73， r = 0.999 精密称取白芷粉（40目）2g，置索氏提取器中，用乙 醚提取9h，回收乙醚，真空干燥，残渣溶于乙酸乙酯并 定容成25ml，经Millipore样品过滤器过滤，同上色谱条件 测定。标准品与样品分离情况（见图 13-1）较好。