[基金项目] 浙江省档案局科研项目(2007-9)[作者简介] 燕勇(1974-),男,学士,主管技师,主要从事微生物检验工作。
【论著】r D N A-I T S 序列分析在真菌鉴定中的应用燕勇,李卫平,高雯洁,沈志英,王恒辉,陈黎霞(浙江省嘉兴市疾病预防控制中心,浙江嘉兴 314050)[摘要] 目的:通过对3株真菌的r D N A-I T S 序列进行分析,以探讨、说明基于核糖体R N A 基因(即r D N A )内转录间隔区(I n t e r n a l T r a n s c r i b e dS p a c e r ,I T S )的多态性的序列分析(r D N A-I T S 序列分析)在真菌鉴定中的应用。
方法:通过P C R扩增与测序的方法测得待检真菌菌株的r D N A-I T S 序列,从G E N B A N K 获取相似序列,使用B L A S T 和D N A M A N 工具对r D N A-I T S 序列进行比对分析。
结果:1号真菌菌株与X y l a r i a l e s s p .L M 40(属炭角菌目)同源性高,但尚不能鉴定到具体的属、种;2号真菌菌株可鉴定到种,为草酸青霉P e n i c i l l i u mo x a l i c u m ;3号真菌菌株可鉴定到种内组水平,为近平滑假丝酵母I I I 组(最新命名为C a n d i d a m e t a p s i l o s i s )。
结论:相对于传统的真菌形态学鉴定方法,r D N A-I T S 序列分析用于真菌鉴定更客观、省时、简便、快速,但目前也存在一定的应用限制(受基因库的完善程度、高度同源性序列的多少以及具体物种I T S 区的可变程度等影响)并不能鉴定出所有真菌,宜与传统的形态学鉴定方法相结合用于真菌鉴定。
[关键词] r D N A ;内转录间隔区(I T S );P C R ;测序;真菌;鉴定[中图分类号] R 446.5 [文献标识码] A [文章编号] 1004-8685(2008)10-1958-04A p p l i c a t i o n o f r D N AI T Ss e q u e n c e a n a l y s i s i nf u n g u s i d e n t i f i c a t i o nY a n Y o n g ,L i W e i -p i n g ,G a o W e i -j i e ,S h e nZ h i -y i n g ,W a n gH e n g -h u i ,C h e n L i -x i a o (J i a x i n g C e n t e r f o r D i s e a s e C o n t r o l a n dP r e v e n t i o n ,J i a x i n g 314050,C h i n a )[A b s t r a c t ] O b j e c t i v e :T o i n t r o d u c e a n di l l u m i n a t e t h e a p p l i c a t i o no f r D N AI T Ss e q u e n c e a n a l y s i s i nf u n g u s i d e n t i f i c a t i o no n b a s i s o f s e q u e n c e a n dl e n g t h p o l y m o r p h i s m s o f i n t e r n a l t r a n s c r i b e ds p a c e r (I T S )i nr i b o s o m a l R N Ag e n e (r D N A ).Me t h o d s :T h e t h r e e p e n d i n g f u n g u s s t r a i n s ′r D N AI T Ss e q u e n c e s t e s t e db y P C Ra m p l i f i c a t i o na n ds e q u e n c i n g m e t h o d s w e r e a n a l y z e da n dc o m -p a r e dw i t hs i m i l a r s e q u e n c e s f r o m G E N B A N K b yN C B I B L A S To n l i n et o o l a n dD N A M A N s o f t w a r e .R e s u l t s :N o .1f u n g u ss t r a i n h a d a h i g hh o m o l o g y w i t hX y l a r i a l e s s p .L M 40,b u t w a s n o t y e t i d e n t i f i a b l eo ng e n u so r s p e c i e sl e v e l o f t a x o n o m i cc l a s s i f i c a -t i o n .N o .2s t r a i n w a s i d e n t i f i e d a s P e n i c i l l i u m o x a l i c u m ,a g e n u s l e v e l .N o .3s t r a i n w a s i d e n t i f i e da s C a n d i d a m e t a p s i l o s i s ,n e w d e s i g n a t i o no f C a n d i d a p a r a p s i l o s i s g r o u pI I I ,a g r o u pl e v e l i n s p e c i e s r e l a t i v e l y .C o n c l u s i o n :C o m p a r e dw i t ht h e t r a d i t i o n a l m o r -p h o l o g i c a l i d e n t i f i c a t i o nm e t h o d s ,t h e r D N AI T S s e q u e n c e a n a l y s i s i s m o r e o b j e c t i v e ,t i m e -s a v i n g ,c o n v e n i e n t ,a n df a s t f o r f u n -g u s i d e n t i f i c a t i o n ,b u t w i t h s o m e a p p l i e d l i m i t s c u r r e n t l y .D e p e n d e d o n t h e p e r f e c t i o n d e g r e e o f g e n e d a t a b a s e ,t h e n u m b e r o f h i g h -d e g r e e h o m o l o g y s e q u e n c e ,t h e v a r i a b i l i t y e x t e n t o f I T S r e g i o n o f b i o l o g i c a l i n d i v i d u a l s a n d s o o n i t c a n b e a p p l i e d .T h e n ,i t d o e s n o t i d e n t i f y a l l f u n g i ,a n d s h o u l db e c o m b i n e d w i t ht h e t r a d i t i o n a l m o r p h o l o g i c a l i d e n t i f i c a t i o n m e t h o d s f o r f u n g u s i d e n t i f i c a t i o n .[K e yw o r d s ] r D N A ;I n t e r n a l t r a n s c r i b e ds p a c e r (I T S );P C R ;S e q u e n c i n g ;F u n g u s ;I d e n t i f i c a t i o n 真核生物基因组中编码核糖体的基因包括28Sr D N A 、5S r D N A 、18Sr D N A 和5.8Sr D N A 4种,它们在染色体上头尾相连、串联排列,相互之间由间隔区分隔。
其中18S 、5.8S 和28S r D N A 基因组成一个转录单元(图1),三者高度保守,适合于较高等级水平的生物群体间的系统分析[1],其间的间隔区为内转录间隔区(I n t e r n a l T r a n s c r i b e dS p a c e r ,I T S ),包括I T S 1及I T S 2两部分,由于进化相对迅速而具多态性,因而适合于等级水平较低的系统学研究。
真菌种类繁多,仅依靠形态、生化等表型特征来鉴定真菌既需要丰富的真菌鉴定工作经验又需要较长的检验时间,尤其对于那些生长条件特殊、形态相似的菌株要通过传统的表型特征鉴定方法来加以鉴别显得非常困难。
而基于r D N A-I T S 的多态性(包括长度多态性和序列多态性)的序列分析,由于可以从不太长的核酸序列中获得相对足够的信息用来反映生物亲缘关系与分类情况,因而成为真菌分类及鉴定研究的热点,目前已广泛应用于真菌的属种间[2,3]及部分种内组群水平[4,5,15]的系统学研究。
本文通过P C R 扩增与测序的方法对I T S 序列分析在真菌的分子生物学鉴定中的应用作初步的介绍与分析。
1 材料和方法1.1 r D N A-I T S 扩增引物I T S 的引物选择与扩增的目标区间有关(表1),单独分析I T S 1区、I T S 2区序列可以研究亲缘关系较近的属种或群组之1958中国卫生检验杂志2008年10月第18卷第10期 C h i n e s e J o u r n a l o f H e a l t hL a b o r a t o r y T e c h n o l o g y ,O c t 2008;V o l 18 N o 10间小范围、低水平的序列变化;若需要相对足够的序列信息用于未知真菌的系统分类学研究或鉴定未知真菌的属种,可对于整个I T S 区设计引物,由于真菌全长I T S 区序列(图1)包含了其两端的18Sr D N A 、28Sr D N A 的部分序列和中间的I T S 1区、5.8S r D N A 、I T S 2区的完整序列(长度300～1000b p ,真菌通常600b p 左右)拥有相对丰富的信息,因而全长序列的I T S 分析在真菌分子生物学鉴定中比较常用。
