酵母RNA的提取、组分鉴定和含量测定
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(3)RNA含量的计算 根据测得的光吸收值,从标准曲线上查出相 当该光吸收的RNA含量，计算出制品中RNA 的百分含量。
13
【注意事项】
样品中蛋白质含量较高时,应先用5%三氯乙酸 溶液沉淀蛋白质后再测定。
本法特异性较差,凡属戊糖均有反应.微量DNA无 影响,较多DNA存在时,亦有干扰作用。如在试剂 中加入适量CuCl2 .2H2O可减少DNA的干扰。此 外,利用RNA和DNA显色复合物的最大光吸收不 同,且在不同时间显示最大色度加以区分。反应 2min后,DNA在600nm呈现最大光吸收,而RNA则 在反应15min后,在670nm下呈现最大光吸收。14
酵母RNA的提取、组分鉴定和含量Biblioteka 定1【实验目的】
1.学习稀碱法提取RNA的原理和操作方法。 2.了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的
方法。
3.掌握地衣酚显色法及紫外分光光度法测定 酵母RNA含量的原理和方法
【实验原理】
酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液， 在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核 糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。 2
氧核糖，为什么？ 3、用你所学过的化学知识,分析3种催化剂： FeC13·6H2O,CuC12·H2O和CuO,哪种催化剂的催
化效果更好？ 4、地衣酚反应中,干扰RNA测定的因素有哪
些 如何能减少它们的影响。
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7
2.RNA的水解：取200mg提取的核酸，加入 1.5mol/L硫酸溶液10mL，在沸水浴中加热10分 钟。制成水解液并进行组分的鉴定。
3.RNA的组分鉴定 （1）嘌呤碱 取水解液1mL加入过量浓氨水，
然后加入约1 mL 0.1mol/L硝酸银溶液，观 察有无嘌呤碱的银化合物絮状沉淀生成。
8
么么么么方面
衣
【酚操-铜作离步子骤试】剂 6
1.RNA的提取：将5g酵母悬浮30mL0.04mol/L氢 氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮 液转移至100毫升锥形瓶中。在沸水浴上加热 30分钟后，冷却。离心(3000r/min)15分钟， 将上清液缓缓倾入15 mL酸性乙醇溶液中。注 意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀 完全后，离心(3000r/min)3分钟。弃去清液。 用95％乙醇洗涤沉淀两次，乙醚洗涤沉淀一 次后，再用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤。 沉淀可在空气中干燥。
核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各 组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可 以测出上述组分的存在。 RNA含量测定,除可用紫外吸收法、定磷法外,常 用地衣酚法测定。其反应原理是：当RNA与浓 盐酸共热时,即发生降解,形成的核糖继而转变 为糠醛,后者与3,5-二羟基甲苯(地衣酚orcinol) 反应,在Fe3+或Cu2+催化下,生成鲜绿色复合物。
定磷试剂含有还原剂抗坏血酸，抗坏血酸很容 易被空气中的氧所氧化，使定磷试剂失效。因 此可以改用钼酸铵试剂定磷。核酸分子中的有 机磷经强酸消化后形成无机磷，在酸性条件下, 无机磷与钼酸铵结合形成黄色磷钼酸铵沉淀。
15
【思考题】
1、如何得到高产量RNA粗制品？ 2、验证RNA中核糖的办法，可否用以检验脱
酵母粉 (或酵母片)
2.实验仪器：
研钵、150mL锥形瓶、恒温水浴锅、布氏漏斗 及抽滤瓶、离心机、漏斗、分光光度计。
5
【实验材料和主要仪器、试剂】
3.实验试剂： 0.04mol/LNaOH溶液、95%乙醇、酸性乙醇 溶液、1.5mol/L硫酸溶液 、浓氨水、 0.1mol/L硝酸银溶液 、氯化铁浓盐酸溶 液、苔黑酚乙醇溶液、钼酸铵试剂（将2g 钼酸铵溶解在100ml10%硫酸中）、标准 RNA母液、标准RNA溶液、样品溶液、地
• Sds绝对是假的
3.RNA的组分鉴定 （2）核糖 取1支试管加人水解液1mL、三氯化铁浓
盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴 中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的 存在。 （3）磷酸 取1支试管，加入1ml水解液，加入5滴 浓HNO3和1ml钼酸铵试剂后，在沸水浴中加热， 观察有无黄色磷钼酸铵沉淀产生，说明磷酸是否 存在。
3
反应产物在670nm处有最大吸收,RNA浓度在 10-100μg/ml范围内,光吸收与RNA浓度成正比。 地衣酚法特异性差,凡戊糖均有此反应,DNA和 其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色。因 此,测定RNA时可先测得DNA含量再计算RNA含 量。
4
【实验材料和主要仪器、试剂】 1.实验材料：
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4.RNA地衣酚法显色测定 （1)标准曲线的制作
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（1)标准曲线的制作 按上表编号及加入试剂。加毕，摇匀，置沸水 浴加热25min，取出后冷水冷却，以零号管作 对照,于670nm波长处测定各管光吸收值。取测 定的平均值,以RNA浓度为横坐标,光吸收为纵坐 标作图,绘制标准曲线。
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(2)样品的测定 取两支试管,各加入2.0mL样品注液,再加 2.0mL地衣酚-Cu2+试剂，如前述进行测定.
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【注意事项】
样品中蛋白质含量较高时,应先用5%三氯乙酸 溶液沉淀蛋白质后再测定。
本法特异性较差,凡属戊糖均有反应.微量DNA无 影响,较多DNA存在时,亦有干扰作用。如在试剂 中加入适量CuCl2 .2H2O可减少DNA的干扰。此 外,利用RNA和DNA显色复合物的最大光吸收不 同,且在不同时间显示最大色度加以区分。反应 2min后,DNA在600nm呈现最大光吸收,而RNA则 在反应15min后,在670nm下呈现最大光吸收。14
酵母RNA的提取、组分鉴定和含量Biblioteka 定1【实验目的】
1.学习稀碱法提取RNA的原理和操作方法。 2.了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的
方法。
3.掌握地衣酚显色法及紫外分光光度法测定 酵母RNA含量的原理和方法
【实验原理】
酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液， 在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核 糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。 2
氧核糖，为什么？ 3、用你所学过的化学知识,分析3种催化剂： FeC13·6H2O,CuC12·H2O和CuO,哪种催化剂的催
化效果更好？ 4、地衣酚反应中,干扰RNA测定的因素有哪
些 如何能减少它们的影响。
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2.RNA的水解：取200mg提取的核酸，加入 1.5mol/L硫酸溶液10mL，在沸水浴中加热10分 钟。制成水解液并进行组分的鉴定。
3.RNA的组分鉴定 （1）嘌呤碱 取水解液1mL加入过量浓氨水，
然后加入约1 mL 0.1mol/L硝酸银溶液，观 察有无嘌呤碱的银化合物絮状沉淀生成。
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么么么么方面
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【酚操-铜作离步子骤试】剂 6
1.RNA的提取：将5g酵母悬浮30mL0.04mol/L氢 氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮 液转移至100毫升锥形瓶中。在沸水浴上加热 30分钟后，冷却。离心(3000r/min)15分钟， 将上清液缓缓倾入15 mL酸性乙醇溶液中。注 意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀 完全后，离心(3000r/min)3分钟。弃去清液。 用95％乙醇洗涤沉淀两次，乙醚洗涤沉淀一 次后，再用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤。 沉淀可在空气中干燥。
核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各 组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可 以测出上述组分的存在。 RNA含量测定,除可用紫外吸收法、定磷法外,常 用地衣酚法测定。其反应原理是：当RNA与浓 盐酸共热时,即发生降解,形成的核糖继而转变 为糠醛,后者与3,5-二羟基甲苯(地衣酚orcinol) 反应,在Fe3+或Cu2+催化下,生成鲜绿色复合物。
定磷试剂含有还原剂抗坏血酸，抗坏血酸很容 易被空气中的氧所氧化，使定磷试剂失效。因 此可以改用钼酸铵试剂定磷。核酸分子中的有 机磷经强酸消化后形成无机磷，在酸性条件下, 无机磷与钼酸铵结合形成黄色磷钼酸铵沉淀。
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【思考题】
1、如何得到高产量RNA粗制品？ 2、验证RNA中核糖的办法，可否用以检验脱
酵母粉 (或酵母片)
2.实验仪器：
研钵、150mL锥形瓶、恒温水浴锅、布氏漏斗 及抽滤瓶、离心机、漏斗、分光光度计。
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【实验材料和主要仪器、试剂】
3.实验试剂： 0.04mol/LNaOH溶液、95%乙醇、酸性乙醇 溶液、1.5mol/L硫酸溶液 、浓氨水、 0.1mol/L硝酸银溶液 、氯化铁浓盐酸溶 液、苔黑酚乙醇溶液、钼酸铵试剂（将2g 钼酸铵溶解在100ml10%硫酸中）、标准 RNA母液、标准RNA溶液、样品溶液、地
• Sds绝对是假的
3.RNA的组分鉴定 （2）核糖 取1支试管加人水解液1mL、三氯化铁浓
盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴 中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的 存在。 （3）磷酸 取1支试管，加入1ml水解液，加入5滴 浓HNO3和1ml钼酸铵试剂后，在沸水浴中加热， 观察有无黄色磷钼酸铵沉淀产生，说明磷酸是否 存在。
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反应产物在670nm处有最大吸收,RNA浓度在 10-100μg/ml范围内,光吸收与RNA浓度成正比。 地衣酚法特异性差,凡戊糖均有此反应,DNA和 其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色。因 此,测定RNA时可先测得DNA含量再计算RNA含 量。
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【实验材料和主要仪器、试剂】 1.实验材料：
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4.RNA地衣酚法显色测定 （1)标准曲线的制作
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（1)标准曲线的制作 按上表编号及加入试剂。加毕，摇匀，置沸水 浴加热25min，取出后冷水冷却，以零号管作 对照,于670nm波长处测定各管光吸收值。取测 定的平均值,以RNA浓度为横坐标,光吸收为纵坐 标作图,绘制标准曲线。
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(2)样品的测定 取两支试管,各加入2.0mL样品注液,再加 2.0mL地衣酚-Cu2+试剂，如前述进行测定.