高效中华绒蟹微卫星文库的构建及其七个位点的特征分析

中华绒螯蟹养殖群体与野生群体的种群遗传学研究作者：周华兴段国庆江河凌俊胡玉婷来源：《农学学报》2022年第06期摘要：研究旨在探究安徽中华绒螯蟹种质资源状况以及资源混杂程度，以期为中华绒螯蟹资源的科学保护、合理利用以及相关产业政策的制定提供理论依据。

采集了中华绒螯蟹4个养殖群体和长江野生群体共170尾样本，基于线粒体分子标记，进行种群遗传学分析。

结果表明，长江野生中华绒螯蟹遗传多样性低，盲目捕捞可能造成野生资源衰退。

野生群体与养殖群体间未出现显著遗传分化，存在严重的种质混杂。

研究探明了长江中华绒螯蟹的资源现状，为其科学的保护提供理论依据。

关键词：中华绒螯蟹；养殖与野生群体；线粒体基因；种群遗传分析；种质混杂中图分类号：S917.4文献标志码：A论文编号：cjas2020-0158Population Genetics of Chinese Mitten Crab Between the Breeding and Wild PopulationsZHOU Huaxing， DUAN Guoqing， JIANG He， LING Jun， HU Yuting（Fisheries Research Institution， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Anhui Key Laboratory of Aquaculture and Stock Enhancement， Hefei 230031， Anhui， China）Abstract： Eriocheir sinensis， especially the Yangtze mitten crab， is an important aquaculture species in China. In recent years， serious germplasm mixture of this species has been detected and little is known about the reasons. In this study， population genetics among wild and breeding populations of the Chinese mitten crab was comparatively analyzed based on mitochondrial marker in order to explore the germplasm mixed level. The results show that the genetic diversity of wild crab in the Yangtze River is low， and over fishing could cause the decline of wild resources. No genetic difference among the wild and breeding populations is detected， which means serious germplasm mixture. This study clarifies the resource status of Chinese mitten crab in the Yangtze River， and can provide a scientific basis for the protection of this species.Keywords： Chinese mitten crab； the breeding and wild populations； mitochondrial gene；population genetics analysis； germplasm mixture0引言中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis），俗称河蟹，隶属节肢动物门、甲壳纲、十足目、方蟹科、绒螯蟹属，是重要水产养殖品种，其营养价值丰富，口味鲜美，深受人们喜爱。

微卫星富集文库的构建脊尾白虾（梭子蟹）微卫星富集文库(GT)n的构建，其具体步骤如下：1.酶切反应：取一尾虾的约1μg基因组总DNA放入含有5U的内切酶Mse I (MBI)的Eppendorf50µL，。

具体体系如下：配好后，轻轻混匀，放在水温为65℃的恒温热稳循环仪中温浴2h。

然后拿出放到4℃冰箱保存。

2.连接反应：2.1 接头的制备O ligo-MseI A 5‟-TACTCAGGACTCAT-3‟Oligo-MseI B 5‟-GACGATGAGTCCTGAG-3‟将Oligo-MseI A和Oligo-MseI B分别配成100μM贮存液，充分溶解后，取出等体积Oligo-MseI A和Oligo-MseI B各25μL，混匀变为50μM，稀释至20μM，于94℃变性5min,取出后缓慢冷却至室温，保存于-20℃备用。

2.2连接体系取15µL的酶切反应产物为模板以及MseI AFLP接头在总体积为30µL反应混合液中进行连接，体系如下：混匀后，置22℃恒温水浴锅温浴1h，然后立即转到65℃水浴10min灭活T4 DNA Ligase。

连接产物保存在-20℃备用。

3. PCR预扩增：以上步酶切连接好的产物为模板，以Mse I-N：5‟-GATGAGTCCTGAGTAAN-3‟为引物进行PCR扩增，体系如下：PCR反应在MJ Research PTC-100 PCR仪上进行。

反应条件为：首先94℃预变性5min，然后在94℃变性30 s，53℃退火1 min，72℃延伸1 min；进行17个循环，最后72℃终延伸10min。

反应产物使用1%琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量。

4. PCR预扩增产物的纯化使用普通DNA产物纯化试剂盒（TIANGEN），所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1 柱平衡：向吸附柱CB2中加入500μL的平衡液BL，13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

微卫星DNA多态性分析和免疫因子基因克隆在蟹类的应用探索的开题报告一、研究背景蟹类是世界上重要的经济水产品之一，其养殖和捕捞产值早已达到了数百亿美元的规模，因此对蟹类进一步的研究与开发具有重要的意义。

微卫星DNA多态性分析和免疫因子基因克隆等技术在生物学研究中被广泛应用，可用于探索蟹类的遗传变异和免疫应答等问题，为蟹类的育种和防疫提供技术支持。

二、研究目的本研究旨在应用微卫星DNA多态性分析和免疫因子基因克隆技术分析蟹类的遗传多样性和免疫应答机制，为蟹类的育种和防疫提供理论支持和实际应用参考。

三、研究内容1. 收集蟹类样本并提取基因组DNA，设计微卫星引物对蟹类DNA进行PCR扩增。

2. 对扩增产物进行电泳分析，测定微卫星DNA富集度和群体遗传多样性。

3. 克隆蟹类免疫因子基因，构建表达载体并进行基因表达和功能分析。

4. 对微卫星DNA多态性和免疫因子基因表达等数据进行统计分析。

四、研究方法1. 样本采集：从不同水域和养殖场采集各种蟹类，收集新鲜样品（肌肉、脑、鳃等），分装到离心管中，保存在-80℃冰箱内备用。

2. DNA提取：采用高盐法快速提取样品基因组DNA。

3. 微卫星引物设计：利用文献资料筛选设计适合蟹类的微卫星引物，并进行验证。

4. PCR扩增：利用微卫星引物对蟹类DNA进行PCR扩增，将扩增产物进行凝胶电泳，用Image J软件进行基因片段大小测定。

5. 免疫因子基因克隆：利用RT-PCR方法，克隆蟹类免疫因子基因，进行测序和表达向量构建，并进行基因表达和功能鉴定。

五、预期结果1. 利用微卫星DNA多态性分析和免疫因子基因克隆技术，分析蟹类的个体遗传多样性、种质资源特征、及其遗传演化规律等。

2. 探究蟹类免疫系统的基因表达、调控机制等，为蟹类育种和防疫提供参考。

3. 得到蟹类的微卫星DNA多态性指纹图谱和免疫因子基因，为蟹类遗传分析、育种改良和防疫工作提供理论和实际指导。

利用微卫星分子标记分析四个中华绒螯蟹群体的遗传多样性马海涛;常玉梅;于冬梅;孙效文【期刊名称】《动物学研究》【年(卷),期】2007(028)002【摘要】Using microsatellite markers, we analysed genetic polymorphism in four populations of Eriocheir sinensis, sampled from Jiangsu, Anhui, Liaoning and Tianjin. Twenty-four pairs of primers were used to amplify the target fragments ranging from 80 bp to 445 bp, which included 16 pairs designed in our laboratory and eight pairs published internationally. Two to 10 alleles per locus in four populations were amplified, and there were 155 alleles in all populations. The average number of alleles per locus was 6.458. The average number of effective alleles per locus (Ne) was4.3491 to 4.7234;the average observed heterozygosity (Ho) was 0.5690 to 0.6722;and the average expected heterozygosity (He) was 0.7238 to 0.7546. Hardy-Weinberg equilibrium analysis (χ2 test, P＜0.05) revealed that seven loci in the four populations were in equilibrium. The genetic distances between the four populations were calculated and revealed that the Anhui, Jiangsu and Tianjin crabs belong to a Yangtse River population, while the Liaohe crabs form another branch.%利用本实验室克隆的16个和国际上发表的8个微卫星标记,对4个中华绒螯蟹群体(江苏、安徽、辽宁、天津)的遗传多样性进行检测.所检测到的扩增片段长度为80-445 bp,在群体间扩增出2-10个等位基因,共计155个等位基因,平均等位基因6.458个.4个中华绒螯蟹群体的平均有效等位基因数(Ne) 为4.3491-4.7234,平均观察杂合度(Ho) 为0.5690-0.6722,平均期望杂合度(He) 为0.7238-0.7546,并通过基因型的P值, 确定了7个座位处于Hardy-Weinberg平衡;同时对4个群体的遗传距离进行了估算, 聚类分析结果表明,安徽、江苏、天津聚为一支,属于长江河蟹类型,辽河种群单独聚为一支.【总页数】8页(P126-133)【作者】马海涛;常玉梅;于冬梅;孙效文【作者单位】中国水产科学研究院黑龙江水产研究所,黑龙江,哈尔滨,150070;大连水产学院,辽宁,大连,116023;中国水产科学研究院黑龙江水产研究所,黑龙江,哈尔滨,150070;中国水产科学研究院黑龙江水产研究所,黑龙江,哈尔滨,150070;大连水产学院,辽宁,大连,116023;中国水产科学研究院黑龙江水产研究所,黑龙江,哈尔滨,150070【正文语种】中文【中图分类】Q959.223【相关文献】1.应用微卫星多态分析四个鲤鱼群体的遗传多样性 [J], 全迎春;孙效文;梁利群2.利用微卫星DNA分子标记分析中华绒螯蟹养殖群体遗传分化 [J], 熊良伟;李真;马克异;邱高峰3.微卫星分子标记分析四川绵羊群体遗传多样性 [J], 王婷;吴登俊4.微卫星分析四个大黄鱼群体的遗传多样性 [J], 王文文;常玉梅;梁利群5.利用微卫星分子标记分析渤海湾的口虾蛄遗传多样性 [J], 谷德贤;王婷;许玉甫;吴宁;王娜;郝郁;王刚;李文雯;刘国山因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

中华绒螯蟹育种群体遗传特征分析及性早熟相关SNP标记筛选的开题报告一、研究背景及意义中华绒螯蟹是中国的一个经济性、生态性重要淡水蟹种，属于中国特产的优良品种之一。

但是，由于人类活动、环境变化等因素的影响，中华绒螯蟹数量不断下降，已经成为濒危物种。

因此，对中华绒螯蟹的保护、繁殖、育种等方面的研究具有重要的实际意义。

二、研究内容及目的本研究旨在对中华绒螯蟹进行群体遗传特征分析，筛选与性早熟相关的SNP标记，为中华绒螯蟹的育种提供科学依据。

具体研究内容包括以下几个方面：1. 中华绒螯蟹不同产地的群体遗传特征分析，包括遗传多样性分析、遗传结构分析、遗传流动分析等。

2. 基于性早熟相关的鉴定指标，筛选中华绒螯蟹性早熟相关的SNP标记。

3. 对筛选出的SNP标记进行验证，确认其与性早熟的相关性，并对不同基因型个体的生长、发育情况进行比较分析。

三、论文结构本文的结构如下：第一章绪论。

主要介绍研究背景、研究目的、研究内容等。

第二章中华绒螯蟹群体遗传特征分析。

主要介绍中华绒螯蟹不同产地的群体遗传特征分析结果。

第三章筛选与性早熟相关的SNP标记。

主要介绍基于性早熟相关的鉴定指标，筛选出中华绒螯蟹性早熟相关的SNP标记。

第四章 SNP标记验证与个体差异比较分析。

主要介绍对筛选出的SNP标记进行验证，确认其与性早熟的相关性，并对不同基因型个体的生长、发育情况进行比较分析。

第五章结论与展望。

主要对本研究的结论进行总结，并展望未来中华绒螯蟹育种方面的研究方向。

四、论文预期成果本文的预期成果包括以下几个方面：1. 对中华绒螯蟹不同产地的群体遗传特征进行分析，了解不同地域间中华绒螯蟹的遗传差异，为育种提供科学依据。

2. 筛选出中华绒螯蟹性早熟相关的SNP标记，为中华绒螯蟹的育种提供新的途径。

3. 对筛选出的SNP标记进行验证，并对不同基因型个体的生长、发育情况进行比较分析，为中华绒螯蟹育种提供更为精准的方法。

4. 提出未来中华绒螯蟹育种方向的建议，为中华绒螯蟹保护和开发利用提供参考。

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis ）俗称河蟹，主要分布于中国长江、辽河、瓯江等水域，但群体自然分布以长江流域为主。

长江流域湖泊水草旺盛、饵料丰富、河口浅滩广阔，是中华绒螯蟹得天独厚的育肥和产卵场。

自20世纪70年代末突破中华绒螯蟹人工育苗技术难关以来，中华绒螯蟹养殖业扭转了完全依赖天然产量的被动局面，现已成为中国渔业生产中发展最为迅速、最具特色的支柱产业之一。

20世纪90年代以来，随着人工养殖规模的不断扩大，长江水系天然成蟹以及蟹苗资源被过度捕捞，天然蟹苗资源急剧衰退[1-2]。

为了降低成本，许多养殖单位选用小规格中华绒螯蟹用于苗种繁育，甚至无序引进外水系蟹种和蟹苗用于苗种培育，因此长江水系中华绒螯蟹种质退化、混杂情况越来越严重[3-7]。

当前国内外有关中华绒螯蟹的报道多集中在用不同方法，如形态学测量、同工酶、SSR 等研究中华绒螯蟹系统分类及遗传多样性[8-13]，目前尚无关于人工选育对中华绒螯蟹遗传多样性影响的报道。

江苏省淡水水产研究所自2000年10月开始进行长江水系中华绒螯蟹良种选育工作，以固城湖国家级长江水系中华绒螯蟹原种场所保存的中华绒螯蟹作为起始选育群体，以长江水系中华绒螯蟹典型外部特征及生长性能作为主要选育指标,经过连续3代近交选择，6年提纯复壮，至2006年已初步获得具有优质、高产特性的F 3选育群体[14]。

本研究利用微卫星技术分析F 4选育群体、长江水系天然群体以及射阳土池苗种群体间的遗传差异，探讨人工选育活动对中华绒螯蟹选育群体遗传多样性的影响，旨在为该物中华绒螯蟹人工选育群体的遗传多样性李晓晖1，2，许志强2，潘建林2，杨家新1，葛家春1，2，柏如发2，朱清顺2（1.南京师范大学 生命科学学院，江苏 南京210097；2.江苏省淡水水产研究所，江苏 南京210017）摘要：利用10对微卫星引物对中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis ）长江水系天然群体、人工选育F 4A 级群体、F 4B 级群体以及江苏射阳群体共95个体进行遗传多样性分析。

中华绒螯蟹微卫星单引物扩增产物的初步分析张菁;陆仁后;邱涛【期刊名称】《中国水产科学》【年(卷),期】2002(009)001【摘要】采用人工合成的6个串联重复寡聚核苷酸单引物,以及2个加锚的二核苷酸引物,利用SPAR和ASSR技术,对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)基因组进行PCR扩增,结果发现,对于GC含量丰富的三、四核苷酸引物如(CGA)5、(GACA)4,在不同退火温度的PCR反应中,都能扩增出清晰的条带,可以作为PCR扩增引物;反之,GC含量<50%的(CATA)4和(GATA)4很难检测到扩增产物;在基本PCR条件下,2个加锚的二核苷酸引物能扩增出可分辨的条带,但随着退火温度的升高,其中部分条带消失;对于不加锚的二核苷酸引物如(AC)8、(GA)8,无论怎样改变退火温度,终难形成清晰条带.将不同引物扩增产物分别克隆到T-Vector上,选取其中9个阳性克隆进行序列测定,发现在(GACA)4引物扩增的2个片段中,序列结构相似,除引物序列外,都出现了2～3个内部重复序列和高含量的AT;其余7个片段在引物序列间都未见内部重复序列.【总页数】5页(P5-9)【作者】张菁;陆仁后;邱涛【作者单位】中国科学院,水生生物研究所,湖北,武汉,430072;中国科学院,水生生物研究所,湖北,武汉,430072;中国科学院,水生生物研究所,湖北,武汉,430072【正文语种】中文【中图分类】Q78;Q959.223【相关文献】1.中国鲎微卫星引物扩增圆尾鲎DNA的PCR反应体系优化 [J], 莫然;谢仰杰;肖志群;翁朝红2.微卫星跨物种交叉PCR扩增的一个新问题:扩增非同源产物 [J], 岳根华;Balazs Kovacs;Laszlo Orban3.使用林鹳微卫星引物对东方白鹳基因组DNA进行交叉扩增 [J], 张伟;张保卫;周立志4.检测PCR产物的新途径—非扩增性单链尾引物技术 [J], 徐湘民5.大鼠及小鼠微卫星引物在社鼠中的跨种扩增 [J], 孙波;鲍毅新;张龙龙;赵庆洋;许婧因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

荧光标记微卫星分析人工饲养中华绒螯蟹的遗传多样性朱泽远;王亚菊;施用晖;乐国伟【期刊名称】《中国海洋大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2007(037)004【摘要】分析中华绒螯蟹的遗传多样性,采集来自无锡、苏州和上海人工养殖样品102个,运用毛细管电泳检测荧光标记(FAM或HEX)的10个中华绒螯蟹微卫星DNA位点.在所有的3个群体中,单一位点等位基因数从15～42个,平均值为22.9;多态信息含量(PIC)和有效等位基因数(E)分别高达0.826和7.699.结果表明10个位点均为高度多态位点,中华绒螯蟹人工养殖群体具有较高的遗传多样性.欧氏遗传距离、遗传相似性和群体各亚群体内固定系数(Fst)平均值分别为0.439,0.825和0.099,结果显示不同的人工养殖群体之间也存在较大的遗传多样性.除上海群体在同步突变模式(SMM)下,近期不会有瓶颈(P=0.35);所有群体在SMM和无限等位基因模式(IAM)下均有显著或极显著的瓶颈(P＜0.01或0.05),结果说明科学的品种保护计划的迫切性.本研究首次选择遗传标记微卫星DNA评估中华绒螯蟹的遗传多样性,并采用高精度的毛细管电泳检测技术,将对中华绒螯蟹的品种保护和合理利国提倡科学依据.【总页数】6页(P591-596)【作者】朱泽远;王亚菊;施用晖;乐国伟【作者单位】江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏,无锡,214122;新加坡国立大学医学院生理系,新加坡,117579;江南大学食品学院,江苏,无锡,214122;江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏,无锡,214122【正文语种】中文【中图分类】S917【相关文献】1.用微卫星荧光标记分析小麦及其近缘属种的遗传多样性 [J], 张海泉;杨虹;张宝石2.微卫星标记在人工养殖小体鲟种群的数据分析方法比较和遗传多样性分析 [J], 董颖;杨瑞;姜志强;胡红霞3.利用微卫星分子标记分析四个中华绒螯蟹群体的遗传多样性 [J], 马海涛;常玉梅;于冬梅;孙效文4.微卫星荧光标记分析坝上长尾鸡与3个地方品种鸡遗传多样性 [J], 关学敏;耿立英;贺英;李祥龙5.运用荧光标记微卫星分析6个肉山羊品种遗传多样性 [J], 凌英会;张晓东;丁建平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。