(完整word版)酶工程简答

1固定化酶和游离酶相比，有何优缺点？
解：优点（1）易将固定化酶和底物，产物分开产物溶液中没有酶的残留简化了提纯工艺（2）可以在较长的时间内连续使用（3）反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化（4）提高了酶的稳定性（5）较能适于多酶反应（6）酶的使用效率高产率高成本低
缺点（1）固定化时酶的活力有损失（2）比较适应于水溶性底物（3）与完整的细胞相比，不适于多酶反应
2、为什么酶制剂的生产主要以微生物为材料？
解：（1）微生物种类多，酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样（2）微生物生长繁殖快，酶易提取，特别是胞外酶（3）来源广泛，价格便宜（4）微生物易得，生长周期短（5）可以利用微电脑技术控制酶的发酵生产，可进行连续化，自动化，经济效益高（6）可以利用以基因工程为主的分子生物学技术，选育和改造菌种，增加产酶率和开发新酶种
3、在生产实践中，对产酶菌有何要求？
一般必须符合下列条件：a)不应当是致病菌，在系统发育上最好是与病原菌无关b)能够利用廉价原料，发酵周期短，产酶量高c)菌种不易变异退化，不易感染噬菌体
d)最好选用产胞外酶的菌种，有利于酶的分离纯化，回收率高
在食品和医药工业上应用，安全问题更显得重要
4、对酶进行化学修饰时，应考虑哪些因素？
解：（1）被修饰酶的性质，包括酶的稳定性，酶活性中心的状况，侧链基团的性质及反应性
（2）修饰反应的条件，包括PH与离子强度，修饰反应时间和温度，反应体系中酶与修饰剂的比例等
5、列出用共价结合法对酶进行固定化时酶蛋白上可和载体结合的功能团
解：（1）酶蛋白N端的α氨基或赖氨酸的∑氨基（2）酶蛋白C端的羧基及天冬氨酸的β羧基或谷氨酸的γ羧基（3）半胱氨酸的巯基1分（7）丝氨酸骆氨酸苏氨酸上的羟基（8）苯丙氨酸和骆氨酸上的苯环（9）组氨酸上的咪唑基色氨酸上的吲哚基
6、
7 举出四例，说明酶在医学上有广阔的用途。

（1）医药用酶：a.消化用酶：α、β－淀粉酶、胰酶、胰蛋白酶 b.消炎用酶：木瓜蛋白酶、菠萝酶 c.溶纤维酶：尿酸酶、链激酶、溶栓酶 d.肿瘤用酶：L－天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶（2）诊断用酶：a.尿酸酶：用于检测血液和尿液中的尿酸含量 b.甘油激酶：由于检测血液中甘油三酯的含量
（3）检测用酶：a.脱羧酶：由于检测L－赖氨酸和L－谷氨酸b.虫荧光素酶：用于检测ATP
8、培养基设计的一般步骤？
答：1.根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分；2.通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分； 3.当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。

9、培养基成分选择考虑的问题？
答：1.菌种的同化能力2.代谢的阻遏和诱导3.合适的C、N比4.pH的要求
10、写出三种分离纯化酶蛋白的方法，并简述其原理
方法透析与超虑离心分离凝胶过滤盐析等电点沉淀共沉淀吸附层析电泳亲和层析热变性酸碱变性表面变性等
离子交换层析原理：根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。

凝胶层析原理：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。

大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。

等电点沉淀法原理：蛋白质在等电点时溶解度最低；不同的蛋白质具有不同的等电点使用方法：单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白），多与其它方法联使用（如盐析法、有机溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度. 亲和层析原理:利用生物大分子间特异的亲和力来纯化生物大分子.体通过适当的化学反应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，从层析柱流出，变换洗脱条件，即可将分离的物质洗脱下来，实现分离提纯
11、如何检查一种酶的制剂是否达到了纯的制剂？试用所学过的知识加以论述。

要检测酶的制剂是否达到纯的制剂（即不含杂质及杂质酶），可以有以下几种方法：（1）层析法：包括纸层析、凝胶层析、柱层析及亲和层析（2）电泳法：包括SDS凝胶电泳法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法（3）超离心法：不同的酶分子大小不同，在重力场中具有不同的沉降系数，从而可以通过超离心方法分离目的酶与杂质酶。

（4）免疫反应法：由于酶分子可作为一种抗原物质，而抗原与抗体之间具有专一的亲和力，故可选用目的酶的抗体与酶制剂进行免疫扩散或免疫电泳，从而判断酶的制剂是否纯净。

（5）氨基酸序列分析法：采用特定的化学物质从酶的N末端将氨基酸残基逐个水解下来，最终可获知该酶的氨基酸序列，从而也可以判断出酶制剂是否纯净。

12、今欲生产糖化酶结晶产品，试拟出合理的工艺步骤，并说明下游工程的主要工艺条件。

生产糖化酶的结晶产品，可采用盐析结晶法。

得到糖化酶粗酶液后，须进行分离纯化，使其达到一定的浓度和纯度（﹥50％），向浓酶液中缓慢加入饱和中性盐溶液（（NH4）2SO4），至出现稍浑浊，于低温下（0－4oC）静置，待溶液中有晶体析出，可向溶液中补充少量饱和盐溶液。

（操作过程中保证PH≈4.5），也可采用有机溶剂法结晶。

向浓酶液中缓慢加入有机溶剂，混合均匀，于低温下静置一段时间，离心去除沉淀物，取上清液静置于低温下，可析出晶体。

发酵生产糖化酶工艺流程：斜面菌种小米三角瓶孢子悬浮液种子罐发酵罐糖化酶粗酶液
13、.酶生物合成法生产的主要工艺过程包括那几个步骤？
(1)用作培养菌种及扩大生产的发酵罐的培养基的配制(2)培养基、发酵罐以及辅助设备的消毒灭菌
(3)将已培养好的有活性的纯菌株以一定量转接到发酵罐中
(4)接种到发酵罐中的菌株控制在最适条件下生长并形成代谢产物(5)将产物抽提并进行精制
(6)回收或处理发酵过程中产生的废物和废水
14、如何控制微生物发酵产酶的工艺条件？
答：发酵过程中，为了能对生产过程进行必要的控制，需要对有关工艺参数进行定期取样测定或进行连续测量。

参数中，对发酵过程影响较大的有温度、ＰＨ、溶解氧浓度等。

(1)温度:温度对发酵的影响是多方面的，主要表现在对细胞生长、产物形成、发酵液的物理性质和生物合成方面。

例如：枯草杆菌的最适温度为34--37℃，黑曲霉的最适温度为28--32℃(2)pH:发酵过程中pH的变化取决于所用的菌种、培养基的成分和培养条件。

微生物生长和生物合成都有其最适和能够耐受的pH范围，大多数微生物生长的最适pH6.3-7.5，霉菌和酵母生长的最适pH4-6，放线菌生长的最适pH7-8。

(3)溶解氧浓度:对于好氧发酵，溶解氧浓度是最重要的参数之一。

好氧性微生物深层培养时，需要适量的溶解氧以维持其呼吸代谢和某些产物的合成，氧的不足会造成代谢异常，产量降低
15、定点突变技术在酶分子修饰中有何应用？
答：定义：指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。

是蛋白质工程和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。

应用：新的酶分子结构的设计；突变基因碱基序列的确定；突变基因的获得；新酶的获得
16、联系实验教学举例说明菌种分离的一般过程。

菌种分离的一般过程：土样的采取，预处理，培养，菌落的选择，产品的鉴定。

以枯草芽胞杆菌的分离为例：
②带菌土壤的热处理：称取1g带菌土壤湿润后放入80℃烘箱处理30min。

②配制分离选择培养基，灭菌备用。

③稀释制备菌液：取5支灭菌带帽15ml离心管，各加入无菌水9ml 备用；将热处理过的土壤放入无菌50ml烧杯中，加入无菌水50ml，搅拌后静置片刻，上层液体为微生物悬液，按下法稀释微生物悬液：在第一支试管中加入1ml微生物悬液，混合均匀后再取1ml到第二支试管中混合，从第二支试管中再取1ml到第三支试管中，以此类推。

④配制斜面培养基，灭菌备用。

⑤涂布培养：取10-3、10-4、10-5、10-6稀释菌液各0.2ml，采用涂布和混合法形成8个平板，倒置后在37℃培养24-48小时，观察水解圈的形成，在无菌条件下将水解圈最大的菌落(水解圈/菌落最大者)转接种于斜面试管中在37℃培养。

16、结合实验阐述一种固定化菌体的方法和步骤。

答：以酵母细胞的固定化为例，本实验固定化的方法是把细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，滴进氯化钙溶液中，形成海藻酸钙凝胶小球。

细胞包埋在凝胶的小孔中，制成固定化细胞。

通过包埋法，对酵母活细胞进行固定。

并对麦芽汁进行发酵实验。

操作步骤①调取活化培养24h的酵母斜面菌种一环，接种于10ml麦芽汁试管中，25℃摇瓶培养48h。

②取酵母菌体悬浮液10mL，悬浮在10mL4%海藻酸钠溶液（冷却到约50度不太烫手）中混合均匀。

③用灭过菌的注射器吸取上述悬浮液，逐滴滴入到50mL氯化钙溶液中，浸泡30~120min使之形成凝胶珠。

④待凝胶珠在溶液中泡30min后，滤出凝胶珠得到固定化细胞。

转到200ml三角瓶中，用无菌水洗涤3次，胶珠转入用75%乙醇消毒过的可乐瓶中注入约2/3体积的无菌麦芽汁，密闭在25℃下发酵7-9天，注意适当放气勿使其爆炸。

17、哪些因素影响微生物发酵产酶？如何提高微生物产酶量?
培养基营养物质：碳源、氮源、无机盐、生长因子、产酶促进剂、微量元素以及发酵条件：pH值、温度、溶解氧、泡沫、湿度均影响微生物发酵产酶。

提高微生物产酶量的方法主要有：通过条件控制提高产酶量，如添加诱导物、降低阻遏物浓度；通过基因突变提高产酶量，如使诱导型转变为组成型、使阻遏型转变为去阻遏型；其他方法，如添加表面活性剂、使用其他产酶促进剂
18、.酶生物合成的模式有哪些？阐述理想的酶合成模式。

答：酶生物合成的模式分为4种类型。

即同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。

同步合成型：霉合成与细胞合成生长同步。

当细胞进入对数生长期，酶大量产生；细胞进入平衡期后酶合成停止。

其生物合成可被诱导，不受分解代谢产物和尾产物阻遏，对应的mRNA不稳定。

延续合成型：酶合成伴随着细胞生长开始，但在细胞进入平衡期后，酶还可延续合成较长的一段时间。

可诱导，不受尾产物阻遏和降解代谢产物阻遏，其对应mRNA 相对稳定。

中期合成型：酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而进入细胞平衡期之后合成终止。

受尾产物阻遏，其对应的mRNA不稳定。

滞后合成型：只有当细胞生长进入平衡期之后酶才开始回成并大量积累。

可能受分解代谢产物阻遏，阻遏解除后，酶合成开始。

其对应的mRNA稳定性高。

其中最理想的合成模式是延续合成型。

属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。

因为属于延续合成型的酶，在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。

细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期以后，酶还可以继续合成一段较长的时间。

对于其他合成模式的酶，可以通过基因工程\细胞工程等先进技术，选育得到优良的菌株，并通过工艺条件的优化控制，使他们的生物合成模式更加接近于延续合成型。

19、.酶的非水相催化有何优点，它们的主要类型有哪些？
答：优点：①提高脂溶性底物的溶解度，有利于高浓度底物连续生物转化②水解酶能催化合成反应，如脂的合成和肽的合成. ③可以控制由水引起的副反应④酶不溶于有机介质，易于回收再利用⑤酶的固定化简单，可以只沉积在载体表面⑥从低沸点的溶剂中分离纯化产物比水中容易⑦酶的热稳定比水高，而且没有微生物污染
类型：⑴有机介质中的酶催化：有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。

适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。

⑵气相介质中的酶催化：酶在气相介质中进行的催化反应。

适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。

⑶超临界介质中的酶催化：酶在超临界流体中进行的催化反应。

超临界流体是指温度和压力超过某物质超临界点的流体。

⑷离子液介质中的酶催化：酶在离子液中进行的催化作用。

离子液是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。

酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。

20、.水在酶的非水相催化中有什么作用？
答：水的作用：⑴必需水与低水系统。

严格的说，酶在绝对无水的条件下，是不可能具有催化活力的。

酶的催化功能与它的空间结构紧密相关，破坏其空间构象，酶便失去其催化功能。

维持酶蛋白空间构象的主要作用力是氢键，疏水作用和范德华力。

在水溶液中，水分子直接或间接地通过这些化学键来维持酶分子催化活力所必需的构象，而且水在酶的稳定性及动力学性态的决定上起着重要的作用。

含水量与酶的稳定性有关。

酶在脱水条件下异常稳定。

⑵必需水对酶活性影响，不是所有水溶液中的水分子都与酶催化活性有关。

实际上只有必需水才重要。

在水合过程中酶蛋白结构没有明显的变化。

必须水量也决定于有机溶剂
21、简述乳糖操纵子模型
答：操纵子的结构：调节基因、启动子、操纵基因、结构基因。

乳糖操纵子模型中一次排列着启动子、操纵基因和阻遏子三个结构基因，她们分别编码β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷透过酶和β-半乳糖苷转移酶，三个基因受同一个基因控制。

当没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态。

阻遏蛋白阻碍RNA聚合酶与启动子P的结合，阻止启动基因上的RNA聚合酶进行转录，这是一种负调节作用。

当有乳糖存在时，乳糖与阻遏蛋白的边沟位点结合，使之发生变构而失去活性，因而不能与操纵基因结合，于是RNA聚合酶能够转录，产生上述三种酶，使大肠杆菌能利用乳糖。

当培养基中有葡萄糖存在时，葡萄糖的降解产物能降低细胞内cAMP的含量，影响CAP与启动子结合，也影响RNA聚合酶与启动基因结合，因
此，β-半乳糖苷酶等三种酶也不能产生。

这是一种正调控作用。

22、简述常用的固定化方法及其应用范围
答：A吸附法：利用各种固体吸附剂将酶或细胞吸附在其表面上，而使酶或者细胞固定的方法。

常用吸附剂有活性炭、硅胶等。

吸附法操作简便，条件温和。

B包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。

包埋法分为网格型和微囊型。

常用包埋剂为琼脂凝胶、明胶等。

C结合法：通过离子键或共价键使酶与载体结合的固定化方法。

离子键法常用DEAE-纤维素等条件温和，结合力较弱。

共价键法常用载体纤维素等。

此法结合牢固，但操作复杂，有可能影响酶活。

而且必须首先激活载体。

D交联法：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。

常用试剂：戊二醛等。

结合牢固酶活损失大
23、以纤维素酶为例说明如何从环境微生物中如何分离提取纯化得到纤维素酶
答：首先，利用CMC-Na刚果红培养基从土壤或者稻草秸秆等粗纤维含量丰富的堆肥中分离出高产纤维素酶的菌株，将该菌株接种到产酶培养基进行发酵。

一般来说，微生物产酶分胞内酶和胞外酶。

再测定内外酶活性的前提下决定分离纯化胞内或胞外酶，酶的分离纯化一般有三步，即，抽提（选择性的从粗酶液中除去杂质或者分离出酶，可以选择离心的方法），纯化（常采用凝胶过滤层析，离子交换层析等方法），结晶（采用真空冷冻抽滤等手段制备酶成品）
24、什么是酶的体外定向进化，什么是DNA改组（DNA shuffling）
所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。

DNA改组（DNA shuffling）又称有性PCR DNA或DNA重排，是运用随机突变技术，对某种感兴趣的蛋门质或核酸进行快速的改造，并定向选择所需性质的生物分子的方法
25、微生物、动物和植物细胞之间的差异主要有那些？
三者之间的差异主要有：a植物细胞>动物细胞>微生物细胞。

b动物细胞、植物细胞的生产周期比微
生物长。

c植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。

d植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。

e植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。

f植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。

26、简述细胞破碎的主要方法和特点？
答：机械破碎法：通过机械运动产生剪切力使组织细胞破碎.a捣碎法：常用于动物内脏、植物叶芽、细菌的细胞b研磨法：常用于微生物和植物细胞c匀浆法：常用于易于分散、比较柔软、颗粒细小的组织细胞
物理破碎法：通过各种物理因素作用，使组织细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。

常用于微生物细胞的破碎.1.温度差破碎法;2.压力差破碎法（渗透压突变）;3.超声波破碎法
化学破碎法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎.1.有机溶剂处理：破坏膜磷脂结构，常用丙酮、丁醇、氯仿等。

2.表面活性剂处理：常用非离子型表面活性剂。

酶促破碎法：通过细胞本身酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎。

1.外加酶法：根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶。

2.自溶法:细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发生溶解的现象。

27、简述金属离子置换修饰的主要修饰过程和作用？
主要修饰过程：a.酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。

b除去原有的金属离子。

经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，
如EDTA等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。

然后通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。

c加入置换离子.上述已去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，就可得到经过金属离子置换的酶。

作用：a.阐明金属离子对酶催化作用的影响b.提高酶活力c.增强酶的稳定性d.改变酶的动力学特性
27、动物细胞培养与微生物培养的不同点:
a.动物细胞无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差；
b.生长速度缓慢，
易受微生物污染，培养时需要抗生素；c.大多数动物细胞需附着在固体或半固体的表面生长；
d.对营养要求严格；
e.大规模培养时，不可简单地套用微生物培养的经验
28、简述酶活力测定的基本原则
①提供最适底物：由于酶的底物专一性，测定酶活力时，提供的底物必须是最适底物，当同时有几种底物时，以Km值最小的为最适底物。

②测定时酶量适当。

③确定反应时间适宜。

④反应条件应是最适反应条件，主要包括反应温度、pH值和基质的离子环境
29、简述分子筛层析分离酶蛋白的基本原理
凝胶过滤法是以不同蛋白质的分子量大小差异来将不同蛋白质分开的方法。

最常用的凝胶是葡聚糖凝胶（Sephadex),是由葡聚糖和3-1,2环氧化丙烷（交联剂）相互交联而成的中央带有微孔的球状凝胶颗粒，根据凝胶分子的交联程度的不同，共有SephadexG10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200等8种型号，G50以下的为硬胶，G75以上的为软胶。

G10的交联度最高，分子内的网孔最小；G200的交联度最低，分子内网孔最大。

根据蛋白质分子大小不同，在通过层析柱时，走的路程不同，从而分开
30、结合酶制剂的应用论述酶分子定向进化的酶工程意义
⑴提高酶分子的催化活力；⑵改善酶蛋白的稳定性；⑶改善酶蛋白的底物专一性；
⑷通过酶蛋白分子对应用环境的适应能力。