实验 亲和层析纯化IgG教学内容

四、实验步骤
1. Protein A纯化：
1）装柱：固定好层析柱，柱保持垂直，夹上出入口止水夹，量取 20ml蒸馏水加入柱内，在柱外做一体积为20ml的标记，然后打开止 水夹赶去出口内气泡，最后在柱内保留0.5-1m的水。ProteinA填料 中加入适量平衡缓冲液，小心搅起凝胶，尽量一次加入柱内，待上 层有一水层后打开止水夹，再用20-40ml平衡缓冲液不断加入柱内 洗脱，最后待胶床表面仅有1-2厘米液层时，旋紧止水夹。装好的胶 柱应符合无气泡、无节痕、床面平正。
用 rProtein A Sepharose™ 分离IgG Column: HiTrap™ Protein A FF 结合缓冲液: 20 mM 磷酸钠, pH 7.0 洗脱缓冲液: 0.1 M 甘氨酸- HCl, pH 3 注意: 为了保护抗体的活性，将洗脱组分收 集于 1 M Tris-HCl, pH 7.5中
6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）
7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加 蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存 ，临用前稀释10倍（减半配制）。
8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于 200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到 250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。
二、实验原理蛋白 A 和 蛋白 G 的结合特异性
种属
人
IgA IgD IgE IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgM* 鸟类蛋黄 IgY† 牛 狗 山羊 豚鼠
IgG1 IgG2 仓鼠 马 考拉 骆驼
蛋白 A 结合
可变的 -
++++ ++++ ++++ 可变的
++ ++ -
++++ ++++ + ++ -
标记为S.
三、实验材料——SDS-PAGE
试剂：
1. 2x样品缓冲液
2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺 0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml，过滤。
3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸 水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。 4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸 水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。 5. TEMED（四乙基乙二胺）原液
四、实验步骤
2.SDS-PAGE 纯度测定
分离胶及浓缩胶的制备：
1 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净， 用ddH2O 冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干； 2 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，按照 说明书提示装好玻璃板；
器材：
电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。
三、实验试剂——浓度测定
考马斯亮蓝G-250蛋白染色液 (1)牛血清白蛋白标准液（100ug/ml） 精确称取0.010g牛血清白蛋白，溶于约50ml蒸馏 水，定容到100ml. (2) 考马斯亮蓝G-250试剂
取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 90%乙 醇中，加入85%正磷酸100ml，最后用蒸馏水定容 到1000ml，此试剂在常温下可放1个月。
实验 亲和层析纯化IgG
实验（三）血清中抗体纯化（16学时）
二、实验原理
ຫໍສະໝຸດ Baidu
抗体纯化配基类型
配基
族特异性 专一特异性
Protein A Protein G Antigen Anti-IgG
特异性
许多IgGs 的Fc 片断 许多IgGs 的Fc 片断 特异的抗体 特异免疫球蛋白
二、实验原理
低 pH下洗脱
三、实验材料——纯化
缓冲液： 平衡液：20mM磷酸二氢钠，150mM氯化钠，pH7.2；(1L) 冲洗液：20mM磷酸二氢钠，0.5M氯化钠，10mM EDTA二钠，
pH7.2；(1L) 洗脱液：0.1M Glycine-HCl，pH3.5；(1L) 清洗液：6mM氢氧化钠。(1L)
稀释血清： 取2ml血清，用平衡缓冲液稀释5倍，0.45um针头滤器过滤。
2）上样：血清让胶床表面几乎不留液层，然后小心注入床面 中央~2ml稀释血清，待样液几乎全部进入胶床表面后，关止 水夹，室温下样品与填料结合15min。
实验步骤
1. Protein A纯化：
3）冲洗：加2倍柱体积冲洗缓冲液，打开止水夹，控制流出 速度为2ml/min，并用试管收集流出液(记为W)，在床表面仅 有1毫米左右液层时，关止水夹，再加入2倍柱体积平衡缓冲 液冲洗填料，床表面仅有1毫米左右液层时，关止水夹， 。 4）洗脱收集：取刻度试管2支编号，柱床上面加3倍柱体积 洗脱缓冲液，控制止水夹流出1倍柱体积洗脱液后，关止水 夹，室温下柱料与洗脱液孵育15min，打开止水夹控制流出 速度为1ml/min收集2倍柱体积（记为E1），待床表面仅有1 毫米左右液层时再加入3倍柱体积洗脱缓冲液， 收集2倍柱体 积记为E2。 5）收集结束后，加入清洗液（6M NaOH）洗涤2cv，平衡 液5cv。
+ +/-
+ 相对结合强度 – 弱或不结合
蛋白 G 结合 ++++
++++ ++++ +++ +++ +++ +++
+ ++++ ++ ++ ++
三、实验材料——纯化
试剂：磷酸二氢钠、磷酸氢钠、氯化钠、异地酸二 钠、枸橼酸、精氨酸、盐酸胍、氢氧化钠、95%乙 醇；均为分析纯。 容器：50ml烧杯/三角瓶/试管10个；15ml收集试管 5个；100ml三角瓶 5个；250ml烧杯5个 填料：Protein A 层析柱：XK10或预充柱 装柱体积：~2ml 血清：~2ml 滤器： 0.45μm针头式滤器5个； SDS-PAGE:
蛋白 G 结合
-
++++ ++++ ++++ ++++ -
++++ + ++
++ ++ ++ ++++ + +
种属
恒河猴 大鼠
IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgM* 猪 兔 小鼠
IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 绵羊
蛋白 A 结合 ++++
+ ++++ +++ ++ 可变的 +++ ++++