第一章绪论
1、什么是发酵
狭义“发酵”定义:在生物化学或生理学上发酵是指微生物细胞将有机物氧化释放的电子直接交给底物本身未完全氧化的某种中间产物，同时释放能量并产生各种不同的代谢产物。
如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用生成乙醇并放出二氧化碳,同时获得能量；丙酮酸被还原为乳酸而获得能量等等。
广义“发酵”的定义:工业上所称的发酵是泛指利用生物细胞制造某些产品或净化环境的过程。
2、什么是发酵工程
定义:应用微生物学等相关的自然科学以及工程学原理，利用微生物等生物细胞进行酶促转化，将原料转化成产品或提供社会性服务的一门科学。
3、发酵工程的特点
主要特点：以高产量、高转化率和高效率及低成本为目标的发酵过程
(1)发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学反应，反应安全，要求条件也比较简单。
(2)所用原料主要是农副产品及其加工产品
通常以淀粉、糖蜜或其它农副产品为主，只要加入少量的有机和无机氮源就可进行反应。
因不同的类别可以有选择地去利用它所需要的营养。
(3)发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的，反应的专一性强，因而可以得到较为单一的代谢产物。
(4)发酵过程中对杂菌污染的防治至关重要。
必须对设备进行严格消毒处理和空气过滤外，反应必须在无菌条件下进行。
如果污染了杂菌，生产上就要遭到巨大的经济损失，要是感染了噬菌体，对发酵就会造成更大的危害。
(5)由于生物体本身所具有的反应机制，能够专一性和高度选择性地对某些较为复杂的化合物进行特定部位地氧化、还原等化学转化反应，也可以产生比较复杂的高分子化合物。
(6)微生物菌种是进行发酵的根本因素，通过变异和菌种筛选，可以获得高产的优良菌株并使生产设备得到充分利用，也可以因此获得按常规方法难以生产的产品。
4、发酵工程的主要问题
发酵工程的主要问题过程优化与放大:在高产菌株的基础上，如何把高产菌种在培养过程中进一步考察它的生理生化特性，稳定或改进微生物反应工艺过程，要求对生物物性的动态有详尽的了解，对生化反应做定量的和动力学方面的考察。
第二章菌种选育
1、与筛选营养缺陷型有关的三类培养基？
答：基本培养基、补充培养基、完全培养基
2、诱变育种的步骤？
出发菌株的选择
处理菌悬液的制备
诱变处理
中间培养
分离和筛选
3、什么叫营养缺陷性菌株？它的筛选步骤？
营养缺陷型是指因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、氨基酸、维生素和碱基等的能力，无法再基本培养基上正常生长繁殖的突变类型，称为营养缺陷型。
筛选步骤：诱变
淘汰野生型
检出缺陷型
确定生长谱
4、工业微生物有哪些要求
①营养特征：能在廉价或来源丰富的原料制成的培养基上迅速生长；
②培养条件：生长速度较快，发酵周期较短，易于控制，抗噬菌体及杂菌污染的能力强,生长温度应高于40℃，降低冷却成本；
③产物得率和浓度：生成的目的产物产量高、易于回收；
5、从自然界分离筛选新菌株需哪些步骤
定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。
采样：有针对性地采集样品。
增殖：人为地通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。
分离：利用分离技术得到纯种。
发酵性能测定：进行生产性能测定（形态、营养要求、生理生化特性、发酵周期、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值等）。
6、富集培养：根据目的微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利于目的微生物生长的条件，使目的微生物迅速地生长繁殖，数量增加，由原来的劣势种变的优势种，以利分离到所需要的菌株。
7、利用平皿的生化反应进行分离
①透明圈法：平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基浑浊。
②变色圈法：在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。
③生长圈法:生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。
④抑菌圈法
抑菌圈法是抗生素筛选常用的初筛方法。
8、工业微生物育种目的
防止菌种退化
解决生产实际问题
提高目标产物的能力
提高产品质量
开发新产品
9、自然选育: 称为菌种的分离纯化在生产过程中,不经过人工处理,利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程叫自然选育.
10、菌种衰退（degeneration）：由于自发突变的结果，而使某物种原有的一系列生物学性状发生量变到质变的现象。
11、菌种保藏原理：根据菌株生理生化特性，人工创造条件（低温、干燥、真空）使菌体的代谢活动休眠期状态。
12、菌种保藏的目的要求：经长期保藏后菌种存活健在，保证菌种不改变表型和基因型，特别是不改变菌种代谢产物生产能力
13、菌种保藏的方法
1、冷冻保藏
冷冻保藏（-20℃以下）：将菌种加入菌种保护剂（甘油或二甲基亚砜）通过冷冻，使微生物代谢活动停止。
冷冻温度愈低，效果愈好。
同时要掌握好冷冻速度和解冻速变。
冷冻保藏的缺点运输较困难。
主要冷冻保藏方法：普通冷冻保藏技术(-20℃)
超低温冷冻保藏技术(-60－-80℃)
液氮冷冻保藏技术（-130－-150℃）
2、冻干保藏
保藏方法：将混有保护剂冰冻至-60℃菌种迅速转移至-40℃时启动真空泵，使真空度减压到2.67～4.00Pa条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使菌种干燥成粉，分装密封安瓿，低于5℃下保藏。
是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。
保藏期限：10年以上
注意事项：冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，如脱脂乳和蔗糖，冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。
3、其他保藏方法
①传代保藏
②矿物油中浸没保藏
第三章微生物培养基
一、培养基的分类：
按纯度合成培养基: 原料其化学成分明确、稳定
天然培养基: 采用天然原料
按状态固体培养基半固体培养基液体培养基
按用途孢子（斜面）培养基种子培养基发酵培养基
二、孢子、种子、发酵培养基的用途及要求：
孢子（斜面）培养基
供菌体繁殖产孢子的一种常用固体培养基，要求使菌体生长快，产生较多优质的孢子。
要求：1、营养不要太丰富（特别是有机氮源）；
2、无机盐浓度要适量，否则影响孢子的颜色和数量；
3、要注意培养基的pH和湿度。
种子培养基：是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长得粗壮，成为活力强的种子
要求：1、营养要求比较丰富和完全;
2、氮源和维生素含量要求高，供菌体生长和繁殖；
3、最后一级种子培养基的成分要接近发酵培养基。
发酵培养基：供菌体生长、繁殖和合成产物之用。
要求：1、满足菌体生长必需的元素和化合物；
2、有合成产物所需的特定元素、前体和促进剂；
三、碳源作用：提供微生物菌体的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳骨架；
氮源作用：氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。
生理酸性物质：经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源，如硫酸铵；
生理碱性物质：经微生物生理作用（代谢）后能产生碱性物质的无机氮源，如硝酸钠。
生长因子：凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。
前体：某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。
四、培养基成分选择的原则
1、菌种的同化能力
2、代谢的阻遏和诱导
3、合适的C、N比100∶0.2～2.0
4、pH的要求
第四章灭菌
一、湿热灭菌的原理
高温的蒸汽使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子等大分子发生变性，使微生物死亡。
热阻:不同种类的微生物对热的抵抗力不同，微生物对热的抵抗力称为热阻。
噁3
二、湿热灭菌理论时间的计算(书121-125)
升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果，考虑到灭菌的可靠性主要在保温阶段进行，故可以简单地利用式
㏑(N/N0) =-kt
来粗略估算灭菌所需时间。
有一发酵罐内装40m3培养基，在1210C温度下实罐灭菌，原污染程度为每1ml有2×105个耐热细菌芽孢，已知1210C时灭菌速度常数k=1.8min-1，求灭菌失败机率为0.001时所需时间。
解：N0=40×106×2×105=8×1012(个)
Nt=0.001(个) k=1.8(min-1)
㏑(Nt/N0)=-kt
t=2.303/k[lg(N0/Nt)]=2.303/1.8[lg(8×1015)]
三、培养基分批灭菌的优缺点(书122)
优点：无需专门的灭菌设备,设备投资少,灭菌效果可靠,对灭菌用蒸汽要求低
缺点:对培养基成分破坏大,升温时间长,难以实现自动控制.
四、培养基连续灭菌的优缺点
连续灭菌的优点：（适用于大型罐）
1、可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率；
2、发酵罐利用率高；
3、蒸汽负荷均衡；
4、采用板式换热器时，可节约大量能量；
5、适宜采用自动控制，劳动强度小；
6、可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同温度下分开灭菌，减少营养成分的破
坏。
缺点：
1、对小型罐无优势，不方便，对设备要求高；
2、蒸汽波动时灭菌不彻底；
3、当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时，以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。
五、热阻定义：是指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。
可用比死亡速率常数k来表示。
六、空气除菌的方法
1、辐射灭菌
原理
α射线、X射线、β射线、γ射线、紫外线、超声波等能破坏微生物的核酸或蛋白质，从而起
到杀菌作用。
2.加热灭菌
加热方法可用蒸汽、电和空气压缩机产生的热量
3、静电除菌
原理
高压产生电晕，电晕使空气分子电离为带正电和负电荷的空气离子，遇到空气中固体微粒和液体微粒，使后者带上电荷分别向两极运动，利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘、除菌的目的
4.介质过滤除菌法
原理:利用有孔介质从气体中除去微生物。
空气中的微生物菌体是依靠气流通过过滤介质时，由于滤层纤维的层层阻碍，迫使空气在流动过程中多次改变气流速度大小和方向的绕行运动，从而导致微生物微粒与滤层纤维间的产生撞击、拦截、布朗运动、重力及静电引力等运动，从而把微生物微粒截留、捕捉在纤维表面上，实现过滤的目的。
第五章种子扩大培养
一、什么是种子扩大培养
指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定发酵产量高、数量充足、无污染的生产菌种的过程。
二、种子扩大培养的目的和要求
目的：接种量的需要、菌种的驯化、缩短发酵时间、保证生产水平。
要求：应根据菌种的生理特性选择合适的培养条件获得代谢旺盛、数量足够的种子。
三、制备种子的准则
1、细胞生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；
2、生理性状稳定；
3、菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；
4、无杂菌污染；
5、保持稳定的生产能力。
四、种子罐的级数的概念
种子罐级数：指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；所采用发酵罐的容积
五、接种量：移入种子的体积除以接种后培养液的体积的值。
六、种龄：指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。
7双种: 两个种子罐接种到一个发酵罐中。
七、倒种: 一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。
第六章种子扩大培养
一、什么是种子扩大培养
指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定发酵产量高、数量充足、无污染的生产菌种的过程。
二、种子扩大培养的目的和要求
答：目的：接种量的需要、菌种的驯化、缩短发酵时间、保证生产水平。
要求：应根据菌种的生理特性选择合适的培养条件获得代谢旺盛、数量足够的种子。
三、制备种子的准则
答：1.细胞生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；
2.生理性状稳定；
3.菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；
4.无杂菌污染；
5.保持稳定的生产能力。
第七章发酵工艺控制
一、分批发酵：指在一封闭系统一次性投料、接种直到发酵结束的发酵方式
分批发酵过程中，微生物生长通常要经历延滞期、对数生长期、衰减期、稳定期（静止期）和衰亡期五个时期。
二、分批发酵优缺点：
优点：操作简单、投资少；运行周期短；染菌机会减少；生产过程、产品质量较易控制
缺点：1、不利于测定过程动力学，存在底物限制或抑制问题，会出现底物分解阻遏效应及二次生长现象。
2、对底物类型及初始高浓度敏感的次级代谢物如一些抗生素等就不适合用分批发酵（生长与合成条件差别大）
3、养分会耗竭快，无法维持微生物继续生长和生产
4、非生产时间长，生产率较低
三、连续发酵：在发酵过程中，连续向发酵罐流加培养基，同时以相同流量从发酵罐中取出培养液。
连续培养与发酵的特点
①属于稳定状态下发酵方法，环境条件（温度、
pH、培养物浓度、产物浓度、溶解氧、氧化还原电位）不发生变化，可以无限期延长分批培养中微生物的对数生长期，保持微生物稳定的生长速率和比生长速率，维持发酵罐中细
胞浓度、总菌体量和培养基的体积恒定不变；
②可以减少分批培养与发酵中每次清洗、装料、消毒、接种、放罐等作业时间，节省人力物力，降低成本，提高生产效率；
③设备体积缩小，投资减少，可采用多级连续培养与发酵，便于机械化、自动化控制； ④产品性能稳定；
⑤便于进行微生物生理生化和遗传特性的研究；
⑥易发生菌种变异、退化、杂菌污染；
单级连续培养两个稳态方程是：
()S S Y x D
S X -==0/μ
优点：添加新鲜培养基，克服养分不足所导致的发酵过程过早结束，延长对数生长期，增加生物量等；
缺点：在长时间发酵中，菌种易于发生变异，并容易染上杂菌；
如果操作不当，新加入的培养基与原有培养基不易完全混合。
四、补料分批发酵：分批发酵过程中补充培养基，不从发酵体系中排出发酵液，使发酵液的体积随着发酵时间逐渐增加 。
优点：1、可以解除底物的抑制、产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应。
2、避免在分批发酵中因一次性投糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多，以至通风搅拌设备不能匹配的状况。
3、菌体可被控制在一系列连续的过渡态阶段，可用来作为控制细胞质量的手段。
与连续发酵相比，补料分批发酵的优点在于：①无菌要求低；②菌种变异，退化少；③适用范围更广。
稀释率：表示单位时间内新鲜培养基流入培养器的体积与培养器中培养基总体积之比。
分批发酵过程中，微生物生长通常要经历延滞期、对数生长期、衰减期、稳定期（静止期）和衰亡期五个时期。
分批发酵动力学
细胞生长动力学
基质消耗动力学
产物形成动力学
率系数:指得消耗单位营养物所生成的细胞或产物数量。
其大小取决于生物学参数（µ,x ）和化学参数（DO,C/N,磷含量等）
产物得率系数：消耗每克营养物（s ）或每克分子氧(O2)生成的产物(P)、ATP 或CO2的克数。
专一性得率
专一性用于生长的底物量△S’不含用于维持能耗及产物形成部分的用量。
根据发酵时间过程分析，微生物生长与产物合成存在以下三种关系：
●与生长相关→生长偶联型
●与生长部分相关→生长部分偶联型
●与生长不相关→无关联
初级代谢物：一类低分子量的终点产物及这些终点产物的生物合成途径中的中间体。
次级代谢产物:是指生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该生物无明显生理功能，或并非是该生物生长和繁殖所必需的物质，如抗生素、毒素、激素、色素等。
不同种
次级代谢的特点及与初级代谢的关系
次级代谢酶的特异性较初级代谢酶的特异性低，故受遗传及环境因素的影响大。
次级代谢物的合成途径比初级代谢的种类多，但大多数次级代谢物都是由少数关键中间代谢物组装的。
次级代谢产物的合成一般是在生长期后，即培养基中的养分快耗尽，菌的比生长速率降低时才合成类的生物所产生的次级代谢产物不相同，它们可能积累在细胞内，也可能排到外环境中。
温度对发酵的影响
1.在其最适温度范围内，生长速率随温度升高而增加，当温度超过最适生长温度，生长速率随温度增加而迅速下降。
2.不同生长阶段的微生物对温度的反应不同
处于延迟期的细菌对温度的影响十分敏感。
对于对数生长期的细菌，如果在略低于最适温度的条件下培养，即使在发酵过程中升温，则升温的破坏作用较弱。
处于生长后期的细菌，其生长速度一般主要取决于溶解氧，而不是温度。
3.酶本身很易因过热而失去活性，表现在菌体容易衰老，发酵周期缩短，影响最终产量。
大题:温度对发酵的影响：
1.温度影响反应速率
发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一个最适温度。
从阿累尼乌斯方程式可以看到 K 与温度有关
E 越大，温度变化对K 的影响越大
2.温度影响发酵方向
影响发酵过程中各种反应速率，从而影响微生物的生长代谢与产物生成。
最适温度的选择:
1.根据菌种
微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。
2.生长阶段选择
在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；
在中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。
因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成。
发酵后期，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。
3.根据培养条件选择
温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。
通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。
培养基稀薄时，温度也该低些。
因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。
4.菌种的生长情况
菌生长快，维持在较高温度时间要短些；
菌生长慢，维持较高温度时间可长些。
发酵热:所谓发酵热是发酵过程中释放出来的净热量。
1、生物热Q 生物
2、搅拌热Q 搅拌
3、蒸发热Q 蒸发
4、辐射热Q 辐射
Q 发酵＝Q 生物＋Q 搅拌－Q 蒸发－Q 辐射(填空)
一、发酵过程pH 变化的原因
1、基质代谢
（1）糖代谢 特别是快速利用的糖，分解成小分子酸，使pH 下降。
糖缺乏，pH 上RT
E e A K /∆-⋅=
升，是补料的标志之一。
（2）氮代谢当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。
（3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降。
2、产物形成
某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。
如有机酸类产生使pH下降，红霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。
3、菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升。
2、pH对发酵的影响
（1）pH影响酶的活性。
当pH值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻。
（2）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行。
（3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用。
（4）pH影响代谢方向
(5)pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响
三、pH的控制
1、调节好基础料的pH。
基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。
若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要调到6.5~6.8
2、在基础料中加入维持pH的物质，如CaCO3 ,或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等
3、通过补料调节pH
在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。
在补料与调pH没有矛盾时采用补料调pH 4、当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH
５、发酵的不同阶段采取不同的pH值
临界氧浓度（CCr）：指不影响菌体呼吸所允许的最低氧浓度。
二. 溶解氧对发酵的影响
（1）溶解氧对生长的影响
（2）溶解氧对产物合成的影响
（3）CCr与Cm比较：通常Cm与CCr不一致
呼吸商（RQ）：指菌体呼吸过程中，CO2释放率和菌的耗氧速率之比，RQ反映菌的代谢情况。
补料的目的
解除基质过浓的抑制
解除产物的反馈抑制
解除分解代谢物阻遏作用
避免因一次性投糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多而造成波谷现象。
在生产上，补料还经常作为纠正异常发酵的一个重要手段。
第八章发酵工艺控制及发酵动力学
一、分批发酵：指在一封闭系统一次性投料、接种直到发酵结束的发酵方式
优点：操作简单、投资少；运行周期短；染菌机会减少；生产过程、产品质量较易控制
缺点：
1、不利于测定过程动力学，存在底物限制或抑制问题，会出现底物分解阻遏效应及二次生长现象。
2、对底物类型及初始高浓度敏感的次级代谢物如一些抗生素等就不适合用分批发酵（生长与合成条件差别大）
3、养分会耗竭快，无法维持微生物继续生长和生产
4、非生产时间长，生产率较低
二、连续发酵：在发酵过程中，连续向发酵罐流加培养基，同时以相同流量从发酵罐中取出培养液。
特点：
1、属于稳定状态下发酵方法，环境条件（温度、pH、培养物浓度、产物浓度、溶解氧、氧化还原电位）不发生变化，可以无限期延长分批培养中微生物的对数生长期，保持微生物稳定的生长速率和比生长速率，维持发酵罐中细胞浓度、总菌体量和培养基的体积恒定不变；
2、可以减少分批培养与发酵中每次清洗、装料、消毒、接种、放罐等作业时间，节省人力物力，降低成本，提高生产效率；
3、设备体积缩小，投资减少，可采用多级连续培养与发酵，便于机械化、自动化控制；
4、产品性能稳定；
5、便于进行微生物生理生化和遗传特性的研究；
优点：添加新鲜培养基，克服养分不足所导致的发酵过程过早结束，延长对数生长期，增加生物量等；
缺点：在长时间发酵中，菌种易于发生变异，并容易染上杂菌；
如果操作不当，新加入的培养基与原有培养基不易完全混合。
三、补料分批发酵：分批发酵过程中补充培养基，不从发酵体系中排出发酵液，使发酵液的体积随着发酵时间逐渐增加。
特点：
1、与分批发酵相比，解除了由于营养物质浓度过高而形成的阻遏效应；避免了由于代谢产物积累过渡而造成的反馈抑制作用；使菌体浓度和细胞浓度生长量控制在适当的水平上，防止菌体大量生长而供氧不足；在某些情况下，通过控制菌体的生长量，可以提高产物的转化率。
