3730测序常见问题分析

测序中经常遇到的问题及原因分析总结了测序中经常遇到的问题及原因分析，希望对大家有帮助！Q:测序结果中为什么找不到引物序列?A:找不到用来测序的引物，这是正常的，因为测序的方法是荧光标记测序法，仪器通过检测ddNTP 上的荧光来读取所测序列，而引物本身是不被标记的，所以仪器无法检测到；找不到所测片段的扩增引物，这种情况是因为您所采用的酶切位点离所用的测序引物距离太近，一般荧光燃料会干扰几十个碱基的读取，这部分碱基会损失掉，损失掉的序列很可能就包含引物的序列，所以引物的序列无法找到；测出的引物序列是原引物序列的反向互补序列，这是因为TA 克隆的插入没有方向性，如果插入片段是相反的，这时就要反向互补查找引物；测出的结果为空载体，这是因为由于某种原因导致质粒上没有插入外源片段，这时所测的为载体序列，所以就找不到引物了；存在单引物扩增，有一条引物的特异性不好，有多个结合位点，导致只有一条引物参与扩增。

Q:为什么测序结果中引物的序列有个别碱基不同了?A: 这是因为引物区同样存在错配的可能，出现这种可能性有两种: 合成错误和引物区有错配我们可以挑选同批次2个以上的克隆进行测序验证，如果结果完全相同，应该是合成错误；如果在引物的相同位置错误的碱基不一样那就应该是引物区有错配。

Q:哪些引物不适合作为测序引物?A:①兼并引物：简并引物要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果；②随机引物：如RAPD 引物，随机引物一般都比较短，所用退火温度低，在测序反应的条件下，不能很好地与模板结合；③过长的引物：一般要求测序引物不大于24bp，过长的引物在测序反应的较低的条件下容易在测序模板上有多个结合位点，导致测序结果背景增高。

另外，较长的引物纯度也将难以保证。

通常用于测序的引物纯度要在90%以上，引物纯度低时，测序反应的背景将明显增大，直接影响到测序结果；④有特殊标记的引物：该情况主要指荧光标记的引物。

我们测序反应的四种碱基都是荧光标记的，这样，荧光标记的引物将产生干扰。

测序结果说明1.测序完成后，我们用对每个样品提供一份测序报告，其中包括：测出的序列彩色峰图（请用Chromas软件打开）序列文件拼接后结果（需要测通的样品）2.在进行DNA测序时，紧接引物的10~30碱基有时不一定能完全读清楚。

3.正常情况下，3730测序仪保证800bp的有效长度，但是有时由于DNA结构上的原因，有时会出现反应中断无法进行的情况。

如：G/C rich；G/C Cluster；Poly A/T/C/G的连续结构等。

此外，另一种情况为反应中途出现的套峰现象，此种情况一般为DNA结构中的重复序列，造成测序用引物和模板之间有两个以上结合位点。

以上情况是由于DNA结构原因造成了无法正常进行DNA测序，对这种情况，我们会根据具体测序结果进行相应收费。

出现以上情况后，我们提倡从另一端进行测序，或者用高级试剂盒进行测序。

4.备注说明一般正常的菌液和质粒自收样日至发送报告日周期为二--三天，PCR产物（纯化及未纯化）为三--四天。

对于三个工作日内无法得到满意测序结果的，我们会用E-mail或电话与客户或代理商联系。

并不是所有的样品都能得到满意的测序结果，对于测序结果不好的，我们会尽力找到可能的原因，以建议进一步如何操作。

测序常见问题解答Q1.为什么提供新鲜的菌液？如何提供新鲜的菌液？A1.首先，新鲜的菌液易于培养，可以获得更多的DNA，同时最大限度地保证菌种的纯度。

如果您提供新鲜菌液，用封口膜封口以免泄露；也可以将培养好的4~5ml菌液离心沉淀下来，倒去上清液以方便邮寄。

同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中造成离心管挤压破裂。

Q2.DNA测序样品用什么溶液溶解比较好?A2.溶解DNA测序样品时，用灭菌蒸馏水溶解最好。

DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应，需要一个最佳的酶反应条件。

如果DNA用缓冲液溶解后，在进行测序反应时，DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件，造成Taq酶的聚合性能下降。

DNA测序过程可能遇到的问题及分析对于一些生物测序公司（如Invitrogen等），我们的菌液或质粒经过PCR和酶切鉴定都没问题，但几天后的测序结果却无法另人满意。

为什么呢？PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。

这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们所用的T载体克隆PCR产物就是应用该原理，通常PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿峰），也就是双脱氧核甘酸ddNTP 终止反应的位置之前的A,A后的信号会迅速减弱。

N值情况一般是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰。

该干扰峰和正常序列峰重叠在一起，有时机器377以下的测序仪无法正确判断出为何碱基。

有时，在序列的起始端的小片段容易丢失，导致起始区信号过低，机器有时也无法正确判读。

在序列的3’端易产生N值。

一个测序反应一般可以读出900bp以上的碱基（ABI3730可以达到1200bp），但是，只有一般600bp以前的碱基是可靠的，理想条件下，多至700bp的碱基都是可以用的。

一般在650bp以后的序列，由于测序毛细管胶的分辩率问题，会有许多碱基分不开，就会产生N值。

测序模板本身含杂合序列，该情况主要发生在PCR产物直接测序，由于PCR产物本身有突变或含等位基因，会造成在某些位置上有重叠峰，产生N值。

这种情况很容易判断，那就是整个序列信号都非常好，只有在个别位置有明显的重叠峰，视杂合度不同N值也不同。

测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的，所以就看不到引物序列。

有两种方法可以得到引物序列。

1.对于较短的PCR产物（<600bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测通，可以在序列的末端得到该引物的反向互补序列。

对于较长的序列，一个测序反应测不通，就只能将PCR产物片段克隆到载体中，用载体上的通用引物(T7/SP6)进行测序。

载体上的通用引物与所插入序列间有一段距离，因此就可以得到完整的引物序列。

3730XL 测序仪器操作指南开机：（1）打开显示器和电脑的电源开关，按键Ctrl+Alt+Delete ，输入密码125；（2）打开仪器电源开关，仪器初始化过程中电源旁指示灯由黄色闪烁20秒变为绿色；（3）双击打开桌面上Data Collection 软件，等待Service Console 窗口中的指示灯全部变成绿色后，DC 软件打开弹出。

关机：（1）与开机顺序相反，先点击Service Console 窗口上Stop ALL 按钮，等4个绿色小方框都变为红色圆圈时即可点击“X ”，关闭Run 3730 Data Collection 软件；（2）关闭仪器电源；（3）关闭电脑主机。

测序模板导入：（1） 当Data Collection 软件打开后，点击GA Instruments 3730, 点开“+”号；（2） 然后点击plate manager ，点击import 导入已经编辑好的模板（E:/plate manager ），最后点击open 就ok 了。

E: Plate manger (如何编辑模板)A. Copy 上一个编辑好的模板，按当天日期修改文件名（如20150630）B. 双击点击“是”（激活窗口点“关闭”）C. 将打开的EXCEL 表格中Container Name 和ID Plate 改为文件名（20150630）D. 将Sample Name 先修改为blankE.按列的顺序依次输入A1H1……A2H2，以此类推，空白孔不改，仍为blankF.点击左上角保存，点击是，跳出窗口G.点击右上角“X”关闭，跳出的窗口点击“不保存”运行程序：（1）打开Data Collection软件中的run schedule search advanced plate ID start with（例如20150630找到相应的测序表）点击add Done；（2）当软件左上方三角星由灰色变为绿色时，点击ok就开始运行程序，大约测序反应需要2.5小时，微卫星分析需要1小时。

测序常见问题分析1.图谱无信号1.1、质粒培养，转化或其他随机原因使质粒上引物序列发生变化，导致无结合位点1.1.1同一模板两端引物测序均无信号，浓度不好安排重抽，反之停止实验，建议客户确认后重新送样1.1.2同一模只一端无信号，确认不是空载体，安排重新实验或换同序列其他引物，两次测序无信号则停止实验，客户要求测通的安排单向测通。

反之建议客户单向测通1.1.3客户提供序列我司合成引物，二次实验仍无信号则停止实验，建议客户提供载体图谱或目的基因我处给他设计引物测序1.1.4客户提供序列我司设计并合成引物核实设计无误可安排重新实验，仍不成功则停止实验，请客户确认提供的序列是否和模板相匹配1.1.5我司设计并合成的步行引物核实设计无误可安排重新实验，仍不成功可重设引物或换另一端测通。

1.1.6某一通用引物测序无信号先查看当天该引物的其他实验或近期该引物的实验情况，均无信号则换管引物重新实验，当天该引物的其他实验有成功的，该反应重做1.1.7一订单多样品用同一对引物测序，某条引物测序均无信号，若为客户提供引物则停止实验。

若为通用引物有同序列其他引物，在确认不是空载载体的情况下，安排换引物试作三至四个反应，效果好全部安排用该引物测序；效果不好都停止实验。

客户要求测通的安排单向测通，反之建议单向测通。

1.1.8重摇重抽测序无信号则取消，建议重新提供样品1.1.9客户提供质粒直接测序无信号则停止实验，建议客户提供新鲜菌液1.1.10用PCR引物测序无信号可换备用引物测序，无备用引物停止实验，建议用载体上引物测序。

1.2、PCR 产物1.2.1同一模板两端引物测序均无信号则停止实验，建议客户克隆后测序1.2.2 同一模只一端无信号，安排重新实验, 仍无信号则停止实验，客户要求测通的安排单向测通，反之建议步行测通2. 图谱信号弱可参考原始峰图，对不能出报告的峰图的处理如下：2.1 同一模板某一端，可安排提高浓度梯度重新实验2.2 某一模板或一订单多个模板中的一个模板2.2.1 鉴定浓度正常可安排提高浓度梯度重新实验，效果仍不好可作弱stop处理2.2.2 一次抽提出的质粒亮度弱，可安排重新抽提质粒后测序2.2.3 二次抽提出的质粒亮度弱，可停止实验，建议重新提供样品3 双峰3.1 PCR 产物测序3.1.1 引物不纯，引物客户提供该结果可出，引物我司合成安排重合引物3.1.2 引物特异性差，有双或多结合位点，可换备用引物测序，无备用引物即出结果3.1.3 polyT/A/G/C 出结果，单向建议客户换另一端测序。

一．ABI 3730基因分析仪的硬件硬件：采用光栅分光，CCD摄像机成像技术，十年实现实时全波长荧光同时荧光检测。

（1）光栅全波长同时分析--灵敏度高，支持4色或5色荧光基因分析。

更换或增加荧光标记硬件无需调整。

（2）低温CCD检测成像系统，灵敏度更高，信躁比更好。

（3）全过程实时检测，灵敏度高。

试剂可16倍稀释使用。

（4）自动进样，48小时无人监管操作。

（5）ABI3100由于采用光栅CCD全波长实时检测因而可进行1小时一批的快速测序。

而其他公司仪器因滤光片转动造成检测时间损失，而无法加快电泳速度，以免造成碱基的漏检。

二．ABI 3730基因分析仪的软件ABI 公司有十几年的软件设计及应用经验，提供丰富的应用软件，为不同研究领域人员提供全面而专业的服务，且所有基本分析软件和高通量自动分析软件都已经在不同操作平台得到应用验证，确保分析的可靠性和准确性。

1、基本分析软件数据收集软件：Data Collection基因序列分析软件：Sequense Analysis基因片段分析软件：Genescan2、高通量自动分析软件（1）基因型自动分析软件：Genotyper（2）基因序列拼接及比较分析软件：SeqScape软件（3）高通量基因片段分析软件：GeneMapper 2.0数据库：内置Oracle 数据库。

三．ABI 3730基因分析仪的试剂1．ABI荧光标记技术的优势：（1）荧光强度，强度均一，具有能量转移功能，能保证试剂可稀释16倍使用（2）荧光光谱之间互不干扰（3）荧光分子的电泳行为的一致性（4）荧光稳定性强（5）四色荧光一个泳道或-五色荧光一个泳道，可升级至更多色荧光。

2．荧光分子：rodamine,d-rodamine,BigDye, BigDye 2.0, BigDye 3.0, dGTP Kit3．ABI专利的荧光标记分子：LIZ,VIC,NED,JOE.4．先进的专利荧光标记技术的应用（1）支持杂合子测序，SNP位点发现及外显子再测序。

测序常见问题分析主讲人: 张隽辉LOGO1. 序列结构对测序的影响图例：poly结构原因: 主要原因是在polyT结构后,测序酶容易在模板上 滑动，导致随后的峰型变乱 或者移码 解决办法: 此类样品通过对其反向互补序列进行测序，通过 拼接可以得到模板全长序列.图例：重复结构原因: 重复结构会导致测序复制框的滑移，另外测序试剂采用 了I, U 代替G, T, 与模板结合能力较弱, 测序酶很难延伸, 信号会迅速衰减或峰谱很乱 解决办法： 使用反向引物对模板进行测序，测到重复序列反向互 补位置时，即可完成模板全长的拼接,一般测A\C重复 序列比G\T要容易一些图例：回文结构位点94至137碱基前后互补, 形成回文结构，该结构导致 后面的信号衰减，出现错误的判读。

图例: 特殊结构现象: 信号在73bp（信号峰图2700处）突然中断， 测序PCR反应终止原因: 变性后的单链在该处很可能互补或在全序列中有大的 特殊结构，造成严重的二级结构，使dNTP 和 ddNTP不 能和模板结合, 测序酶无法正常延伸 解决方法: 酶切,做亚克隆测序2.测序常见图谱分析图例:双克隆1现象: T载体序列峰图正常, 连接位置处出现套峰原因: 1.有插入片段的载体和空载体同时存在 2.PCR产物用T载体进行连接时,其片段能以正反两个方向 插入T载体 解决办法： 重新挑取单克隆备注: 重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段， 并不足以证明模板的单一图例:双克隆2现象: 载体序列及插入片段前半部分峰图单一,套峰出现在插入片段中间原因: 1. pcr产物不纯,且产物的引物结合区以及峰图单一的序列 都一样 2. 部分模板碱基发生突变,双峰出现的位点是由碱基突变 的位置决定的,有时会一端正常一端双峰(插入片断超过一 个反应测序长度(800~900bp)), 或者两个反应都双峰 解决方法: 重新挑单克隆图例:非特异扩增现象: 峰图起始即双峰原因及解决方法: 1. 对于质粒样品, 引物在序列上有两个结合位点(载体上 和插入片段上),换一个引物测序 2.对于PCR产物,有两个模板,且两个模板都能和引物结合 扩增, 换引物或克隆测序图例:等位基因双模板现象:序列的80bp到120bp之间有两套峰存在，没有发生移码突变解决方法: 采取克隆的方法将两套模板分开，分别进行测序图例：碱基缺失碱基缺失常见在PCR产物中，特别是从基因组中扩增得到的PCR片段， 上图的186位缺失两个连续的T。

测序末端不准的原因-回复测序末端不准是指在DNA或RNA测序过程中，序列的末端部分存在较高的测序错误率。

这种错误率的增加可能对测序结果的准确性和可靠性造成一定的影响。

造成测序末端不准的原因是多方面的，包括样品质量、测序平台技术等因素的影响。

首先，样品质量是造成测序末端不准的一个重要因素。

在测序过程中，如果起始材料的质量不佳，例如DNA或RNA的纯度不高、含有污染物或存在降解等问题，都可能导致末端区域的测序结果不准确。

这是因为质量低劣的起始材料可能含有碎片、非特异性引物、杂质等，干扰了测序反应的进行，导致数据质量下降。

其次，测序平台技术本身的特点也对测序末端的准确性产生影响。

不同的测序平台具有不同的工作原理和技术特点，其测序的准确性和可靠性也有所区别。

例如，目前常用的高通量测序平台如Illumina HiSeq和ABI 3730XL等，其测序末端的错误率较高。

这主要是由于这些平台所采用的技术或方法对于末端序列的测定存在偏差或困难，导致了测序结果的不准确。

此外，测序末端不准还可能与测序反应中的特殊性有关。

测序反应中使用的引物和反应条件对末端序列的测定会产生一定的影响。

在PCR扩增测序中，通常使用末端修饰的引物，引物结合和扩增可能会受到末端修饰的影响，从而导致错误率增加。

另外，反向转录PCR测序中，逆转录引物结合和反向转录也可能对末端序列的测定产生一定的影响。

此外，测序末端不准也可能与序列反应的循环数有关。

由于末端序列在每个循环中会被读取多次，这导致了末端序列的重测多次。

由于循环数的增加，末端序列的错误率也可能增加。

这是因为末端序列的重复测序会造成技术误差的累积，从而导致错误率升高。

最后，环境因素以及实验操作等也可能对测序末端准确性产生一定的影响。

例如，温度波动、操作不规范、试剂质量等都可能对测序末端的准确性产生影响。

这些因素可能导致不同实验之间的测序结果存在差异，从而影响末端序列的准确性。

总结起来，测序末端不准的原因是多方面的，包括样品质量、测序平台技术、特殊性反应以及环境因素等的综合作用。

测序常见问题及其分析Collected by RobertoRun,12.10.2008(From: HTUTUUUTTH)1、PCR产物测序时出现重叠峰问题图1（模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序结果移码）图1-1图1-2解决方法：将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR 产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。

问题图2（PCR产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一）图2解决方法：主要原因是PCR产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解决。

问题图3（测序引物有碱基缺失）测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的碱基缺失即图1有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。

解决方法：重新合成引物，或将引物进行PAGE纯化2、克隆测序时出现峰形重叠原因：所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒；或是是送测序的菌液污染解决方法：重新挑单克隆的菌落（划线分离单菌落），提质粒或送菌液再次测序。

3、样品有杂合/突变位点模板中有杂合型突变，也就说模板本身在这个位点出现突变；或者是从基因组中扩增出来的杂合位点。

如果模板有杂合（突变或缺失），那么测序图形中其他的位點一般都是單一的峰形，然后突然在某一個位點出現重叠峰(如图中箭頭所示)。

解决方法：建议将DNA片段克隆到载体再测序。

4、poly A/T和C/G cluster导致的套峰和测序信号衰减图4-1图4-3图4-4RACE测序时经常遇到图4-1和图4-4的情形，解决方法：从另一端测序；但如果这样的序列出现在中间，呵呵，目前还没有很好的解决方法，要看测序公司的本事了。

测序常见问题解答1．为什么需要新鲜的菌液？首先，新鲜的菌液易于培养，可以获得更多的DNA，同时最大限度地保证菌种的纯度.2．如何提供菌液？如果您提供新鲜菌液，用封口膜封口以免泄漏；也可以将培养好的4—5ml菌液沉淀下来，倒去上清以方便邮寄。

同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中压破.3．如何制作穿刺菌？用灭菌过1.5ml或2ml离心管加入LB琼脂(7g/L)斜面凝固，用接种针挑取分散良好的单菌落穿过琼脂直达管底，不完全盖紧管盖适当温度培养过夜，然后盖紧盖子加封口膜，室温或4度保存。

4．PCR产物直接测序有什么要求？1)．扩增产物必须特异性扩增，条带单一.如果扩增产物中存在非特异性扩增产物，一般难以得到好的测序结果；.2）必须进行胶回收纯化；3）DNA纯度在16—2.0之间.浓度50ng/ul以上.5．为什么PCR产物直接测序必须进行Agarose胶纯化？如果不进行胶纯化而直接用试剂盒回收，经常会导致测序出现双峰甚至乱峰。

这主要是非特异性扩增产物或者原来的PCR引物去除不干净所导致。

大多所谓的PCR"纯化试剂盒"实际上只是回收产物而不能起到纯化的作用的。

对于非特异性扩增产物肯定无法去除，而且通常他们不能够完全去除所有的PCR引物，这会造成残留的引物在测序反应过程中参与反应而导致乱峰。

6．如何进行PCR产物纯化？PCR产物首先必须用Agarose胶电泳，将特异扩增的条带切割下，然后纯化。

使用凝胶回收试剂盒回收.产物用ddH2O溶解。

7．PCR产物直接测序的好处？A) PCR产物直接测序可以反映模板的真实情况.B) 省去克隆的实验费用和时间.C) PCR产物测序正确的片段进行下一步克隆实验使结果更有保障.D) 混合模板进行PCR的产物直接测序可以发现其中的点突变.8．对用于测序的质粒DNA的要求有哪些？对测序模板DNA的一般要求：1).DNA纯度要求高，1.6—2.0之间，不能有混合模板，也不能含有RNA，染色体DNA，蛋白质等；2).溶于ddH2O中，溶液不能含杂质，如盐类，或EDTA等螯合剂，将干扰测序反应正常进行。

一．ABI 3730基因分析仪的硬件硬件：采用光栅分光，CCD摄像机成像技术，十年实现实时全波长荧光同时荧光检测。

（1）光栅全波长同时分析--灵敏度高，支持4色或5色荧光基因分析。

更换或增加荧光标记硬件无需调整。

（2）低温CCD检测成像系统，灵敏度更高，信躁比更好。

（3）全过程实时检测，灵敏度高。

试剂可16倍稀释使用。

（4）自动进样，48小时无人监管操作。

（5）ABI3100由于采用光栅CCD全波长实时检测因而可进行1小时一批的快速测序。

而其他公司仪器因滤光片转动造成检测时间损失，而无法加快电泳速度，以免造成碱基的漏检。

二．ABI 3730基因分析仪的软件ABI 公司有十几年的软件设计及应用经验，提供丰富的应用软件，为不同研究领域人员提供全面而专业的服务，且所有基本分析软件和高通量自动分析软件都已经在不同操作平台得到应用验证，确保分析的可靠性和准确性。

1、基本分析软件数据收集软件：Data Collection基因序列分析软件：Sequense Analysis基因片段分析软件：Genescan2、高通量自动分析软件（1）基因型自动分析软件：Genotyper（2）基因序列拼接及比较分析软件：SeqScape软件（3）高通量基因片段分析软件：GeneMapper 2.0数据库：内置Oracle 数据库。

三．ABI 3730基因分析仪的试剂1．ABI荧光标记技术的优势：（1）荧光强度，强度均一，具有能量转移功能，能保证试剂可稀释16倍使用（2）荧光光谱之间互不干扰（3）荧光分子的电泳行为的一致性（4）荧光稳定性强（5）四色荧光一个泳道或-五色荧光一个泳道，可升级至更多色荧光。

2．荧光分子：rodamine,d-rodamine,BigDye, BigDye 2.0, BigDye 3.0, dGTP Kit3．ABI专利的荧光标记分子：LIZ,VIC,NED,JOE.4．先进的专利荧光标记技术的应用（1）支持杂合子测序，SNP位点发现及外显子再测序。

测序过程常见问题分析与解答1、DNA测序样品用什么溶液溶解比较好？答：溶解DNA测序样品时，用灭菌蒸馏水溶解最好。

DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应，需要一个最佳的酶反应条件。

如果DNA用缓冲液溶解后，在进行了测序反应时，DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件，造成Taq酶的聚合性能下降。

有很多客户在溶解DNA测序样品时使用TE Buffer。

的确，TE Buffer能增加DNA样品保存期间的稳定性，但TE Buffer对DNA测序反应有影响，根据我们的经验，我们还是推荐使用灭菌蒸馏水来溶解DNA测序样品。

2、提供DNA测序样品时，提供何种形态的比较好？答：我们推荐客户提供菌体，由我们来提取质粒，这样DNA样品比较稳定。

如果您要以提供DNA样品，我们也很欢迎，但一定要注意样品纯度和数量。

提供的测序样品为PCR产物时，特别需要注意DNA的纯度和数量。

PCR产物应该进行切胶回收，否则无法得到良好的测序效果。

有关DNA测序样品的详细情况请严格参照“测序模板的要求”部分的说明。

3、提供的测序样品为菌体时，以什么形态提供为好？答：一般菌体的形态有：平板培养菌、穿刺培养菌，甘油保存菌或新鲜菌液等。

我们提倡寄送穿刺培养菌或新鲜菌液。

平板培养菌运送特别不方便，我们收到的一些平板培养菌的培养皿在运送过程中常常已经破碎，面目全非，需要用户重新寄样。

这样既误时间，又浪费客户的样品。

一旦是客户非常重要的样品时，其后果更不可设想。

而甘油保存菌则容易污染。

制作穿刺菌时，可在1.5ml的Tube管中加入琼脂培养基，把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基（固体）中，37℃培养一个晚上后便可使用。

穿刺培养菌在4℃下可保存数个月，并且不容易污染，便于运送。

4、与测序引物有关的问题答：对于通用测序引物，只要正确使用，一般不会有太大问题，测序引物问题主要发生在客户自己提供的PCR引物上。

应该明确的一点是并不是所用的用于PCR的引物都可以用来作测序，以下几种PCR引物将是不适合用作测序引物的：（1）简并引物，简并引物必然要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果。