DNA测序常见问题分析及解决办法总结

结果完全不对
请提供详细资料我们会根据结果具体分析。
模板GT二级结构区后
测反向互补序列，AC结构不影响测序
严重的重复结构
测反向互补序列
模板特性决定的
根据具体情况决定
信号极弱或无信号
模板质量差
重新提供菌液或纯化PCR产物
质粒样品：引物不符
尽量提供载体详细信息，核查引物
引物不适宜测序
测序引物比PCR引物要求高，随机引物和简并引物不能用于测序，较长的PCR引物也不能用于测序。重新设计引物测序，对PCR产物而言建议克隆到载体上用通用引物进行测序
质粒测序时整个结果双峰
引物特异性不好，序列中存在通用引物的同源序列；改用其他引物测序。
质粒和PCR产物测序出现双峰
引物不纯，测序时只要单一引物，请不要将双向PCR引物混合；合成的引物没有纯化，或纯化不好。重新合成引物测序。
信号迅速衰减或中断
模板GC二级结构区后
难以得到好的测序结果，亚克隆成较小的片段进行测序
质粒产量极低
客户自己提供2ug纯化好的质粒
PCR产物定量极低
重新电泳检测已纯化的PCR产物，确认有足够的量，或提供PCR原液由公司进行纯化
测序结果正常，与预期不符
找不到引物
质粒模板
检测是否为空载体，从其互补链上寻找，克隆位点离测序引物太近，长插入片段未测通。
PCR模板
不可能找到所用的测序引物，短片段可以从互补链上找到另一段的引物，长片段由于测不通，无法找到相应序列想得到全序列，短片段可以从两端进行测序，长片段需要经克隆后进行测序。
用反向引物测互补链。
此类问题主要与样品有关
质粒测序在插入序列中出现套峰
可能是样品非单克隆，挑其他克隆测序。
PCR产物测序中，某一点后序列变乱
可能是存在移码突变，这是正常的，也可以克隆后测序。
PCR产物中一个或多个位置有套峰
序列中存在突变，这是正常的，也可以克隆后进行测序。
PCR产物测序前部分双峰
引物二聚体污染或产物不纯，克隆后测序。
常见问题
具体情况
可能的原因
处理办法
备注
样品准备问题
菌培养不来自百度文库或失败
抗性不对或菌已死
核对抗性，尽可能提供载体信息。
或菌培养条件特殊
重新提供菌液，或提供2ug纯化质粒。
质粒提不出
质粒拷贝数极低或
客户自己采取大量提取的方法提供2ug纯化质粒。
培养方式不当
质粒产量很低
低拷贝数质粒或
客户自己采取大量提取的方法提供2ug纯化质粒。
培养方式不当
自带质粒或已纯化PCR产物量极低
是否为电泳法定量，
质粒：电泳检测浓度大于100ng/ul，体积大于20ul。
测OD值法不可靠,电泳检测
总量是否足够
已纯化PCR产物：根据片段长度提供足够量的模板，一般要求是100ng/反应/Kb，进行多个反应的应相应增加量。
测序出现双峰或信号中断
双峰
重复序列，如polyT、polyA或几个碱基重复