石蜡切片时间表

石蜡切片免疫组化步骤1.石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟。

2.脱蜡和水化：二甲苯(20min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(10min)→95%乙醇(10min)→90乙醇(10min)→80%(10min)4.抗原修复：柠檬酸钠缓冲液95度，10分钟. (枸橼酸三钠3g枸橼酸0.4g然后加水到950毫升左右，然后用NaOH或HCI调pH值6.0，最后定容在1000ml)5. PBS浸洗2次各5min6.加3%H2O2孵育5min(室温或37度，避光)。

肝组织过氧化物酶含量高。

需增加浓度或增长时间。

蒸馏水洗2minx3次8.pbs-曲拉通通透（pv法不需要）9.与二抗种属一致的血清封闭非特异位点。

（pv法不需要）9.滴加一抗4℃过夜10.PBS浸洗3次各5min11.滴加二抗室温或37℃孵育30min12.PBS洗3次各5min15.DAB显色5~20min，自来水充分涮洗16.苏木素复染2~3min，自来水充分涮洗17.氨水反蓝，过蓝可用盐酸酒精分化2s，自来水充分涮洗.用稀氨水返蓝，自来水里加几滴稀氨水，就行了，返蓝时间5分钟左右，就很好看了;淡氨水有人用50ml自来水＋三四滴的氢氧化铵；18.脱水、透明80%(5min)→90%(5min)→95%(5min)→100%(5min)→ 100%(5min)→二甲苯(10min)→二甲苯(10min)19.封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干二、操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片放在60℃恒温箱中烘烤2h以上，然后按以下流程进行：二甲苯Ⅰ（1h）、二甲苯Ⅱ（30min）、100%酒精（30min）、95%酒精（15min）、70%酒精（15min）、50%酒精（15min）、蒸馏水（15min）2、3%H2O2，室温封闭5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。

3、甩去H2O2，蒸馏水洗2min×3次。

转基因实生苗石蜡切片的制作与染色1.固定组织固定即杀死并保存组织内细胞的形态、结构及组成，使其与生活时相似。

本实验采用FAA固定液（70％乙醇：冰醋酸：福尔马林＝90：5：5）分别固定若干野生型和转基因实生苗的叶片、幼茎和老茎3~4d，中间换一次固定液。

2.冲洗冲洗目的是除去材料中的固定液。

本实验采用70%酒精洗涤法，材料取出后直接投入适度酒精的小瓶中，材料与酒精体积比为1:10左右。

开始换洗两次，分别30min和60min，最后在70%酒精中过夜。

3.脱水脱水是因为植物组织中含有大量的水分，不能直接浸入石蜡，所以必须脱去组织中的所有水分。

本实验以乙醇为脱水剂，各级浓度为70%、83%、95%和100%。

开始每级停留时间为30min，脱水至纯酒精时，需要脱水2~3次，每次30~60min，注意此时瓶盖必须干燥。

4.透明组织经非石蜡溶剂脱水后，一定要经过透明剂（石蜡溶剂）透明，才能浸石蜡。

这一方面可增强组织的折光系数，并能使石蜡顺利进入组织，还可与最后的滴加的封藏剂混合进行切片的封藏。

最常用的透明剂为二甲苯，它透明力强，可与乙醇互溶，又是石蜡的溶剂，但不溶于水。

本实验采用二甲苯作为透明剂，中间经过两个级度为1/2二甲苯和二甲苯，每次时间为60~120min，纯二甲苯中更换2~3次。

5.浸蜡与包埋所谓石蜡切片法，即用石蜡包埋组织块，再进行切片和染色的制片法。

因此，脱水透明之后，接下来就是浸蜡、冷却将组织块包埋在石蜡中。

植物材料用的石蜡熔点为54～58℃之间。

5.1 熔腊取旧蜡、新蜡和蜂蜡（比例约为20：4:1）盛于大烧杯中，放入65℃烘箱中融化，然后放置室温中凝固，反复三次后过滤备用。

注意摇晃溶解。

5.2 浸蜡和换蜡植物组织的透蜡过程必须缓慢进行，所需的时间比较长，约需1～2d。

其方法如下：①将组织连同1/3二甲苯一起倒入小青霉素瓶中；②轻轻倒入熔解的石蜡（熔点52～54℃）。

这样，石蜡就在二甲苯的上层凝固起来；③将小青霉素瓶放入37℃左右的温箱中，使石蜡徐徐熔解到饱和为止，约需2d；④将小青霉素移入56～60℃的恒温箱内，待石蜡熔解后，倒去含有二甲苯的石蜡，以后每隔1h左右换已熔化的纯蜡一次，共换纯蜡3次即可进行包埋。

石蜡切片免疫荧光染色方法GE GROUP system office room 【GEIHUA16H-GEIHUA GEIHUA8Q8-对于石蜡切片：1、烤片：60℃ 60分钟2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟→蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。

3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入0.01mol/l柠檬酸钠，pH6.0(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。

修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。

2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H2O22(2ml H2O22加入18ml蒸馏水中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。

（也可不用去除内源性酶）。

3. 封闭(Blocking)加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。

如果背景较高，可以4℃封闭过夜。

不用洗，用滤纸吸干周边水分。

从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。

4. 一抗孵育(Primary antibody incubation)参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。

立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。

PBS洗3次，每次5分钟。

5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。

PBS洗涤3次。

每次5分钟。

如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

6. 蛋白检测(Detection of proteins)对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观察。

天津天士力集团研究院药理所 文件编号：1 烘烤切片-常规石蜡切片制作切片的烘烤看似简单，只在烘烤箱或干燥箱一放，让其烘烤就行了，但从某种意义上讲，它也是一个关键，如果切片烘烤不好，到染色的时候，便会使切片脱离载玻片（掉片），使整个过程毁于一旦，因此，认真烤好切片是制好切片的前提。

怎样才能使切片烘烤得好呢？我们的做法如下：当切片裱于载玻片后，于烘烤箱边竖立起来，控干水份，然后平放于烘烤箱的烤板上烘烤，温度可调至70℃。

当最后一个蜡块切完后，前面的切片也烤得差不多了。

关于切片的烘烤，尤其是需做免疫组化切片的烘烤，要特别的注意对抗原的保存，使它们能在合适的烘烤切片时间内既不受到破坏，又能尽量地显示出现，经多组多次的实验认为，温度和时间是极为重要的。

温度过高能使蛋白变性，抗原失活至丧失，时间过长，也会致使其失活和丧失。

最初有人主张切片在60℃以下烘烤30-60min ，然后进行染色，依此法进行实验，结果切片脱片率高，切片松动的占100%，由于切片附贴不牢，染色时不敢用PBS 充分冲洗，造成背影染色加深，鉴别特别困难。

又由于脱片严重，重染次数增多，延误了诊断，也造成人力物力的浪费。

究竟什么样的温度及时间才能做到既使切片附贴牢固，又不会对抗原造成影响的呢？经实验证明：切片在60℃恒温箱中连续烘烤3-5小时最为合适。

这种时间和温度烘烤出来的切片，可以用于抗原修复，PBS 的冲洗，可满足做免疫组化的一切需要。

切片在上述的烘烤时间和温度是否对抗原有影响呢？笔者认为，不必为此而担心。

因为活检组织块浸蜡时，浸蜡箱的温度都调在65℃左右，组织块在这样的温度中起码要浸泡2小时以上，才能达到浸蜡较为彻底的要求。

组织中的抗原，经过65℃的考验，保留下来的，基本上都已具有耐热性，因此，几小时的烘烤，不会对抗原有影响，实验证明，上述的理论完全正确。

一：步骤石蜡切片（骨组织）1：PFA固定，4℃冰箱过夜后，用10%的EDTA脱钙，时间3-5周，鉴定脱钙完成的标志是：用细针可以刺进骨头。

脱钙完成后开始做实验前需要把骨头放到70%的酒精24h。

2：脱水：70％酒精（1h）→ 80％酒精（30min）→ 95％酒精Ⅰ（20min）→无水乙醇Ⅰ（15min）→无水乙醇Ⅱ（15min）。

3：透明：二甲苯（15min）（如果组织小（例如小鼠和大鼠的组织）就15min，如果透明时间过长组织易脆，如果组织大（例如兔子、人、狗等)时间就可以稍微长一些。

4：浸蜡：恒温56℃～58℃（不超过60℃）。

→石蜡Ⅰ（1-2h）→石蜡Ⅱ（1-2h）。

（如果组织大浸蜡时间可以延长，可以达6-8h。

）5：包埋：待石蜡稍微凝固以后放到4℃冰箱过夜。

6：切片与展片：切片的时候要保持包埋好的蜡块的硬度，如果蜡块软的话切片的时候组织就会碎，所以要把蜡块放在冰上。

在42℃温水中展片（如果组织太脆，就先把组织浸泡在甘油中，几分钟？后在把组织放在冰块上，一段时间后再取出来重新切片。

）7：捞片：捞片时，载玻片45°倾斜，然后将片置于载玻片2/3处。

8：收片子，37℃保存。

HE染色1：脱蜡和脱水：二甲苯，10min×3（不常换，脱蜡用），酒精5min（100%Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ；95%；70%），蒸馏水Ⅰ，Ⅱ5min（如果在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。

如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长）2：染色：苏木精-2-3min3：蒸馏水冲洗（起反蓝的作用）：大概1h-2h4：伊红染色-2min4:脱水 70%→80%→95%Ⅰ→100%ⅠⅡ、Ⅲ酒精各一分钟5：二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各3min（脱水用，最好是用一次换一次，脱水用的二甲苯要透明干净，质量才好）6：封片用树胶∶二甲苯=3:1（1∶1，3∶2）{现配现用}，树胶多一些，用铅笔或者其他工具赶气泡。

实验时间石蜡切片及染色过程
石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。

苏木素与伊红对比染色法（简称H.E.对染法）是组织切片最常用的染色方法。

这种方法适用范围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存。

经过HE染色，细胞核被苏木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。

实验步骤及注意事项
一、石蜡切片
1. 取材: 刀片要求锋利而薄,组织厚度约2—3mm, 大小1.5×1.5×0.2～0.3cm 为宜. 取材时间越快越好.
2. 固定: 组织取下后应立即放入 10%福尔马林(相当于 4%甲醛)固定.
注意：
(1) 固定液量应为组织块体积的 40 倍.
(2) 固定时间固定时间与使用的固定液种类和组织块大小, 温度等
有关. 一般为 3—24h.
(3) 固定温度大多可在室温固定, 在低温(4℃)时间应延长.
(4) 固定容器应大些.
3. 漂洗: 流水冲洗 2—10h.。

石蜡切片制片流程（番红固绿滴染）1.鲜样FAA（18：1：1）抽气固定24h以上。

2.易碎的材料可用甘油酒精软化剂（1：1）软化1周以上（乙二胺软化剂容易导致颜色变深）。

3.70%酒精浸泡1h。

4.80%酒精浸泡1h。

5.95%酒精浸泡1h。

6.吸水纸迅速吸干，100%酒精浸泡1h。

7.100%酒精浸泡1h。

8.含1/2酒精+二甲苯的溶液浸泡1h。

（若有浑浊，即脱水不完全，需要重新从95%酒精再脱水一次）。

9.纯二甲苯浸泡1h。

10.纯二甲苯浸泡1h。

11.加入约1/4二甲苯体积的碎蜡，放置约半小时，再加入1/4体积碎蜡（也可一步到位）。

12.视混合物熔点而定，40-50℃液体状态渗蜡1-2d。

13.视石蜡熔点而定，50-65℃（高于熔点3-5℃），含1/2二甲苯+石蜡的蜡锅浸蜡2h。

14.含1/3二甲苯+2/3石蜡的蜡锅浸蜡2h。

15.纯石蜡锅浸蜡2d以上。

16.包埋（若材料大、中间有空气可调高温度再抽气）（新蜡不易凝固，可在新蜡锅抽气再用老蜡包埋）。

17.空气中冷却（急剧冷却容易收缩不均而变形），削块成棱台形蜡块。

18.切片（8-20µm，若太薄易碎则调高厚度）。

19.40℃水中展片，用涂有粘片剂的载玻片捞片（展片时间不宜太短，易产生褶皱）（捞片的展片效果优于滴水展片，气泡少），40℃烘干。

20.40-50℃烤片2-3d（比石蜡熔点低5℃左右），让蜡带充分贴在玻片表面。

21.铅笔做好标记，二甲苯浸泡脱蜡20-30min。

22.二甲苯透明10-20min。

23.取出，滴加含1/2酒精+二甲苯的溶液，放置数秒，倾去。

（需要过渡酒精至与染色剂的酒精含量相同的浓度，染色）（以50%番红酒精溶液和95%固绿为例）。

24.滴加100%酒精，放置数秒，倾去。

25.滴加95%酒精，放置数秒，倾去。

26.滴加80%酒精，放置数秒，倾去。

27.滴加70%酒精，放置数秒，倾去。

28.滴加50%酒精，放置数秒，倾去。

波恩氏固定液:苦味酸饱和液（0.9-1.2%） 75ml冰醋酸5ml 40%甲醛（也就是100%福尔马林） 25ml 一．石蜡切片的主要流程为：1）取材与固定：将两年龄的各种样本的性腺组织放入干净的EP 管中，然后倒入波恩氏固定液，固定3～4个小时；2）脱水：组织经固定后，去除固定液，然后逐级脱水，70%→80%→90%→纯酒精（I）→纯酒精（II），每级脱水处理40分钟左右；3）透明：脱水后，用二甲苯置换组织中的酒精，纯酒精（II）→1/2纯酒精+1/2二甲苯→二甲苯（I）→二甲苯（II），同样的每级处理40分钟左右。

4）浸蜡：将已透明的样本放入放置在60摄氏度左右的恒温箱的液体石蜡中，浸蜡4小时左右；5）包埋：用牛皮纸折叠成合适大小的小盒，然后将熔化的石蜡和样本材料倒入盒中，用在酒精灯上略热的镊子将样本材料安放整齐，直至冷却；6）切片：首先用单面刀片把石蜡块修整好，然后将其固着在台木上，最后固定在石蜡切片机上开始切片；7）贴片：将切片机切下的蜡带按载玻片大小分割成小段粘贴在载玻片上，为使粘贴牢固先在在玻片上滴一小滴蛋白甘油，涂抹均匀，然后再滴一滴干净的水在上面，将分割好的蜡带轻轻的放在上面，然后移到烫板上；8）染色：以粘贴牢固的切片脱蜡下降至水（每级处理2~5分钟）→苏木精中染色4分钟左右→水洗→氨水中“蓝花”1~3分钟，蒸馏水漂洗一次→0.2%署红水溶液半分钟左右→70%的酒精过一下→95%的酒精浸几下→纯酒精（I）2分钟→纯酒精（II）2分钟→1/2纯酒精+1/2二甲苯2分钟→二甲苯2分钟；9）封片保藏：将染色好的切片封藏于中性树胶中。

透射电镜技术材料准备的主要流程为：1）用干净的镊子和剪刀剪取合适大小的性腺组织，用3%的戊二醛固定4~5小时；2）用磷酸缓冲液清洗几次后用锇酸固定；3）系列丙酮对其梯度脱水后用Epon812包埋；4）超薄切片机60~70 nm厚度超薄切片，然后用醋酸双氧铀–枸掾酸铅染色；5）利用日本H–600透射电子显微镜对其进行观察；6）参照刘筠等采用的鲤科鱼类的分期标准对其进行性腺分期。

实验时间石蜡切片免疫组化实验（含详细步骤）
免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。

根据标记物的不同分为：免疫酶法、免疫荧光法、亲和组织化学法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。

其中前三种最常用。

实验原理
根据聚合酶技术把辣根过氧化物酶抗鼠或/和抗兔 IgG 分子结合在多聚酶上形成多聚物分子，其与待检的抗原特异性的结合后，加入底物显色。

实验步骤
1. 石蜡切片置于67 ℃ 烘箱中，烘片 2 小时，脱蜡至水，用 pH 7.4 的 PBS 冲洗三次，每次 3 分钟（3 × 3'）。

2. 取一定量 pH = 6.0 柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理 10 分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用 PBS 冲洗2 × 3'（注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具体情况而定）。

快速石蜡切片操作规程
快速石蜡切片操作步骤：
1、接到标本后快速取材固定；
2、快速脱水、透明、浸蜡、包埋；
3、迅速切片、染色；
4、封片时不得有气泡，不得有树胶外溢；
5、标签必须贴于玻片左侧，编号字迹必须清楚；
6、制片后剩余组织应做常规石蜡包埋切片染色，进一步诊断。

快速石蜡切片相关要求：
1、制片工作一般应在10—20分钟内完成，诊断报告应在30分钟内出具。

2、为了尽量缩短制片时间，必须预先做好有关准备工作。

3、用于组织固定、脱水、透明的试剂和浸蜡用的石蜡应及时过滤、更换。

*注：丙酮、乙醇、二甲苯等为易燃物，进行上述各项流程时，2米距离内不得存在明火；加温脱水和浸蜡过程必须应用隔水温箱，不得使用干烤箱操作。

石蜡切片免疫组化实验步骤石蜡切片免疫组化实验是一种常用的实验方法，用于研究细胞或组织中特定蛋白质的表达情况。

下面将详细介绍该实验的步骤。

一、标本固定1.1 选取需要研究的组织标本，如肿瘤组织或正常组织。

1.2 将组织标本进行固定，常用的固定剂有4%的中性缓冲福尔马林溶液。

固定时间一般为24小时。

二、脱水和浸渍2.1 将固定的标本进行脱水，使用不同浓度的酒精进行逐渐脱水，通常是从低浓度到高浓度的酒精。

2.2 脱水后，将标本进行浸渍，使用石蜡和酯类溶剂混合制备浸渍剂，将标本浸渍在浸渍剂中，使其逐渐渗透。

三、石蜡包埋3.1 将浸渍的标本放入石蜡溶液中，使其充分浸泡。

3.2 使用石蜡包埋机将标本置于石蜡中，使其被石蜡完全包裹。

3.3 将石蜡包埋的标本放置于冷冻台上，使石蜡迅速凝固。

四、切片4.1 使用切片机将石蜡包埋的标本切成薄片，通常厚度为4-6微米。

4.2 将切好的标本片放入温水中，使其展开。

4.3 使用载玻片将标本片捞起，放置于载玻片上。

五、脱脂5.1 将载玻片上的标本片放入脱脂剂中，去除石蜡。

5.2 脱脂时间根据实验需求而定，一般为10-20分钟。

六、抗原修复6.1 标本片上的抗原可能在脱脂过程中被破坏，需要进行抗原修复，以使其恢复原有的形态和免疫反应性。

6.2 常用的抗原修复方法有热处理法和酶解法。

热处理法是将标本片放入缓冲溶液中，进行高温加热处理；酶解法是使用特定的酶对标本进行酶解处理。

七、抗体反应7.1 将修复后的标本片进行抗体反应。

首先将载玻片上的标本片加入抗体溶液中，使其与目标蛋白质结合。

7.2 抗体反应时间一般为1-2小时，温度一般为室温或4摄氏度。

7.3 抗体反应后，使用洗涤缓冲液洗涤标本片，去除未结合的抗体。

八、检测与显色8.1 将洗涤后的标本片加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗溶液中，使其与一抗结合。

8.2 二抗结合后，使用显色底物，如DAB（3,3'-二氨基联苯）溶液，进行显色反应。

石蜡切片操作步骤植物组织石蜡切片的制作方法：（1）固定：用50%或70% FAA固定液（50%或70%酒精：甲醛：冰乙酸=16:1:1; 幼嫩材料用50 % FAA；老的材料用70%的FAA），置于4℃固定24 h。

（2）脱水：将固定液倒去，加入50%乙醇，室温静置30 min ；重复一次，室温静置20 min。

换成1%番红溶液(用70%酒精配制)，室温脱水染色过夜。

次日继续脱水，酒精浓度梯度和时间依次为：80% 乙醇1h、95% 乙醇1h、无水乙醇1h、40min（2次）。

（3）透明：1/2无水乙醇+二甲苯混合液1h，纯二甲苯1h、40 min（2次）。

最后加入少量二甲苯（浸没材料即可）和碎蜡，放入38℃温箱中过夜。

（4）浸蜡：将温箱温度调至56℃，计时1h；换成二级蜡1h；三级蜡（3次）各1h、1h、40min（从温度上升到56℃开始计时）。

（5）包埋：将带有材料的液体蜡倒入叠好的纸槽中，迅速放入冰水中使蜡凝固，防止气泡产生，以及凝蜡不匀。

（6）切片：修整蜡块，用Lica RM2126切片机切片，厚度5-10 μm。

（7）贴片: 在载玻片上涂少许粘片剂，将切好的蜡带放入温水中，捞至载玻片上，最后置于37℃恒温箱过夜烤片。

（8）脱蜡及染色：①番红-固绿对染ⅰ脱蜡：二甲苯60min，二甲苯5 min、1/2无水乙醇+1/2二甲苯混合液5 min、无水乙醇5 min、无水乙醇5 min、95%乙醇5 min、80%乙醇5 min、1%番红室温过夜。

ⅱ染色：80%乙醇5 min，1%固绿（用95%酒精配制）迅速蘸一下，大约10s，直接放到95%乙醇5min 、无水乙醇5min、无水乙醇5min、1/2无水乙醇+1/2二甲苯混合液5min、二甲苯5 min（2次）。

②甲苯胺蓝染色ⅰ脱蜡：二甲苯60 min、二甲苯5 min、1/2无水乙醇+1/2二甲苯混合液5 min、无水乙醇5 min、无水乙醇5 min、95%乙醇5 min、80%乙醇5 min、70%乙醇5 min、50%乙醇5 min 、30%乙醇5 min、蒸馏水5 min。

石蜡切片制作超详细步骤1．取材颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织（或其他组织）。

切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。

取下所需要的肝组织，切成一小块2－3mm厚。

注意事项：（1）取材动作要迅速，不宜拖太久，以免组织细胞的成分、结构等发生变化。

（2）切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。

2．固定将切好的肝组织用生理盐水洗一下，立即投入中性福尔马林固定液中固定30－50min。

注意事项：（1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。

（2）有些混合固定液的成分之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。

（3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。

（4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外贴上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免混淆。

标签上注明固定液、材料来源、日期等。

标签上的文字，用黑色铅笔写。

3.洗涤材料经固定后,流水冲洗，数小时或过夜。

4.脱水材料依次经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95%、100%各2次，每次20min。

注意事项：（1）脱水必须在有盖的玻璃瓶中进行，防止吸收空气中的水分。

（2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。

（3）在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。

（4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。

（5）如需过夜，应停留在70%酒精中。

（6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象5．透明纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ15min （至透明为止）。

石蜡切片DAB1、烤片56-60度2h2、二甲苯60度至少20min 100%酒精5min 90%酒精5min80%酒精5min 70%酒精5min 蒸馏水5min3、微波修复：将玻片加入枸橼酸钠缓冲液的烧杯内，微波加热<中高火7min，停2min，再高温2min，切不可高温拿出，慢慢冷却>。

<PBS洗3*5min>微波修复液配方0.5M 10.5g柠檬酸—100ml A液14.7g柠檬酸三钠—100ml B液用时： A液9mlB液41ml450ml H2O4、洗后，切片放入湿盒，滴加3%H2O2，常温孵10min（脑，脾：3%H2O2，10min；肝：20%H2O2，30min），PBS洗3*5min5、用5%羊血清（PBS配），37℃，封闭30min。

6、滴一抗（PBS+0.5%triton配），37℃孵2h或4℃过夜（次日需37度复温20min）。

7、第二天取出，PBS洗3*5min。

加B液37℃，30min→洗3*5min8、加C液37℃，30min，PBS洗3*5min。

9、配制DAB显色剂（稀释液中取1ml加一滴DAB显色液，现配现用），切片上滴加DAB显色液，镜下控制显色时间，1~10min，流水终止反应。

10、苏木素复染，约5-10min，盐酸酒精分化约数秒（可以不用），用自来水缓慢冲约20min,蓝化。

11、脱水10-20min<直接放在烘箱里烤干>，二甲苯透明10min（或更久）12、中性树胶封片，烤片至黏稠。

13、显微镜下观察，拍照。

房产管理处工作总结及工作打算[房产管理处工作总结及工作打算] 今年以来，房产管理处在建设局党委和上级业务主管部门的领导下，经兄弟科室的密切配合，严格按照新时期房产管理工作的总体要求和部署，不断更新思想观念，积极拓展工作思路，与时俱进，扎实工作，造就一支“团结奋进，求实创新，廉洁勤政，高效严谨”的房管队伍，圆满完成了局党委年初下达的各项任务目标，促进了**区房产管理事业各项工作的整体发展，为我区的经济建设和社会各项事业的顺利开展作出了贡献，房产管理处工作总结及工作打算。

一、石蜡切片1. 固定：将新鲜组织切成小块，固定于4%多聚甲醛过夜。

凝固组织中的物质成分，尽可能保持其活体时的结构。

同时能使组织硬化，有利于切片的进行。

2.脱水：为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1小时。

固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响后期的染色效果。

3.透明：常用的透明剂有二甲苯，二甲苯是石蜡的溶剂。

纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的溶剂，替换出组织内的酒精。

材料块在透明剂浸渍过程称透明。

4.浸蜡：先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1小时。

先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍1小时左右。

5.包埋：以少许热蜡液将其底部迅速贴附于包埋盒内上，然后置于速冻台，让石蜡固定。

6.切片：切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当都直接影响切片质量，可将蜡块至于冷水中改变蜡块硬度。

通常切片厚度为3-5um，用毛笔轻托轻放在37度水浴中展片。

7.贴片与烤片：一般使用恒温水浴锅，温度控制在37-40℃左右，有利于石蜡切片的展开，贴好的切片置于60℃恒温箱内干燥2小时，蛋白质凝固后即可染色。

8.切片脱蜡及水化：干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95%、85%、70%进行水化。

9.染色：经典的苏木精和伊红：细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。

实验操作简单。

免疫组化：指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应。

二、冰冻切片1.取材：应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。

2.速冻：1）将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）。

2）如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。

3）当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。

石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法1、组织的采集、固定和保存：采取组织后，方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4?C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜方法二：采用bouin’s固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 过夜（成年tesis）PBS缓冲液洗三次，每次5min，4?C保存于70%乙醇中。

2、组织的包埋、切片、展片及保存：：固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54?C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10?m，贴于处理过的干净载玻片上，37?C烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT密封保存。

石蜡包埋：保存于4?C 70%乙醇中的组织样品?80%乙醇15 min?95%乙醇15 min?100%乙醇15min ? 2?1/2乙醇1/2二甲苯15 min?二甲苯透明5-10 min?1/2二甲苯1/2石蜡30 min?石蜡（1） 1.5hr?石蜡（2） 1.5-2.5hr?石蜡（3）包埋?RT保存3、石蜡组织切片的免疫组化方法：密封保存于RT的组织切片?二甲苯(1) 20 min?二甲苯(2) 20 min?100%乙醇20min?95%乙醇10 min?80%乙醇10 min?通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈?切片在PBS中浸泡 5 min*2?0.4%Tritonx RT 10 min?切片在PBS中浸泡 5 min*33%H2O2 RT 10min切片在PBS中浸泡 5 min*30.25%胰酶RT 10min切片在PBS中浸泡 5 min*3Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT 60min倾去blocking buffer，勿洗一抗4?C overnight in blocking buffer取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3二抗in blocking buffer GAR1：200 （GAM1：100），RT 1h切片在PBS中浸泡 5 min*3DAB显色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2）如果是增强型DAB只要1min即可。