植物表达载体转化农杆菌操作步骤

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农杆菌转化法原理农杆菌转化法是一种常用的植物基因转化技术，它利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）作为载体，将外源基因导入植物细胞内，从而实现对植物基因的改造。

这一技术在农业、园艺和生物学研究领域有着广泛的应用，其原理和操作流程值得我们深入了解和掌握。

农杆菌转化法的原理主要包括以下几个步骤，识别、转移DNA、整合DNA和表达DNA。

首先，农杆菌通过感知植物产生的信号物质识别寄主细胞，然后将其T-DNA（转移DNA）片段转移到植物细胞内。

T-DNA片段携带了外源基因和一些调控基因，一旦被转移到植物细胞内，这些基因就会被整合到植物基因组中。

最后，这些外源基因就会在植物细胞内表达，从而产生相应的表型变化。

在实际操作中，农杆菌转化法需要进行一系列的步骤。

首先，要选择适合的农杆菌菌株，并将目标基因插入到适当的植物转化载体中。

然后，将植物组织暴露在含有农杆菌的培养基中，使农杆菌能够侵染到植物细胞内。

接下来，将植物组织转移到含有适当激素和抗生素的培养基中，促使转化的植物细胞再生成整株植物。

最后，对转化后的植物进行筛选和鉴定，确保外源基因的稳定整合和表达。

农杆菌转化法的优点在于其操作简单、适用范围广泛、转化效率高和转化植物种类多样。

同时，它也存在一些局限性，比如对植物种类的依赖性强、转化后植物的表达水平不稳定等。

因此，在实际应用中需要根据具体情况选择合适的转化方法。

总的来说，农杆菌转化法作为一种重要的植物基因转化技术，为我们研究植物基因功能、改良农作物品质和培育新品种提供了重要的手段。

通过深入了解其原理和操作流程，我们可以更好地掌握这一技术，为农业生产和科学研究提供更多可能性。

植物抗体制备
植物抗体制备是一种生物技术方法，用于从植物中收集和纯化特定目标蛋白的抗体。

下面是一种常见的植物抗体制备方法：
1. 选择表达载体：选择适合在植物中表达目标蛋白的表达载体，并将目标蛋白的编码序列插入该载体中。

2. 转化植物细胞：将表达载体导入植物细胞中，可以通过基因枪法、农杆菌介导法等方法进行。

3. 筛选转化植株：通过对转化植株进行筛选，例如利用抗生素选择性培养基，筛选出携带目标蛋白表达载体的转化植株。

4. 扩大培养：将筛选得到的转化植株进行扩大培养，使其生长成成熟植株。

5. 收获植物材料：收获植物材料，包括根、茎、叶等组织，用于提取目标蛋白。

6. 蛋白提取：利用蛋白提取缓冲液等方法，将目标蛋白从植物材料中提取出来。

7. 抗体纯化：利用亲和层析、凝胶过滤、电泳等方法，对提取的目标蛋白进行纯化，得到纯化的目标蛋白。

8. 免疫原制备：将纯化的目标蛋白用于免疫动物（如小鼠）以制备抗体。

9. 抗体收集：从免疫动物中收集得到的抗体，可以通过抗体纯化和浓缩等步骤进行进一步纯化和处理。

10. 抗体检测：利用收集到的抗体，可以进行免疫组化、免疫印迹、ELISA等方法对目标蛋白进行定量和定位分析。

植物表达载体转化农杆菌操作步骤第一部分：农杆菌介导转化水稻1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif或Str；EHA105：Rif或 Str；GV3103：庆大霉素。

如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/ml。

28℃培养。

3、农杆菌感受态细胞的制备：1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600=0.5。

2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min；5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化；制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。

使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。

4、DNA直接转化农杆菌：1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min；2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr；4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。

2天左右菌落可见。

（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）5、重组农杆菌鉴定：1）挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。

（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）2）小量提取质粒DNA，加GTE同时加5μL溶菌酶（50μg "ml -1，贮藏浓度为50mg/ml或10mg/ml）。

农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素农杆菌介导植物转化是一种常用的基因转化技术，利用农杆菌转化DNA进入植物细胞，使其表达目的基因。

在这个过程中，农杆菌的外源DNA会被单胞菌分泌物（Vir）基因编码的蛋白质工具分子T-DNA结合酶（VirD2）切割成目标T-DNA片段，然后T-DNA和Vir蛋白质工具分子挤进被切开的植物细胞，最终整合入植物细胞的染色体中。

1.农杆菌菌株：农杆菌菌株的选择对转化效率有重要影响。

通常选择具有较高转化效率的农杆菌菌株，如LBA4404、GV3101等。

不同的菌株对于不同的植物种类和品种可能有不同的适应性，因此需要根据具体情况进行选择。

2.感受性植物：不同植物对农杆菌介导植物转化的感受性各不相同，高度感受性的植物容易进行转化。

除了感受性外，植物的再生能力也是影响转化效率的因素之一、通常来说，拥有较高再生能力的植物对转化更加容易。

3.T-DNA载体：T-DNA载体是构建农杆菌介导植物转化载体的关键。

在农杆菌介导植物转化过程中，目标基因的载体必须经过农杆菌系统与植物细胞进行相应的介导，进而整合到植物细胞基因组中。

选择合适的T-DNA载体进行构建，可以提高转化效率。

此外，T-DNA载体中导入基因的拷贝数、插入位点的选择等也会对转化效率产生影响。

4.辅助物质：除了基础的转化体系以外，辅助物质也是影响转化效率的一个重要因素。

辅助物质主要包括感受性缓解物质、抗生素等。

感受性缓解物质主要用于保护不同类型的植物细胞免受农杆菌侵染造成的伤害，提高细胞存活率；抗生素主要用于抑制农杆菌菌落的生长，避免菌落过度生长对植物细胞的负面影响。

辅助物质的添加可以有效增加转化效率。

5.转化条件：转化温度、菌液浓度、转化时间等转化条件也会对转化效率产生影响。

具体条件需要根据植物种类和品种的特点进行优化。

总之，农杆菌介导植物转化主要是通过农杆菌菌株和植物的相互作用引发变化，其转化效率受多个因素的综合影响。

农杆菌转化法及转基因植物检测方法摘要：近年来，植物基因工程技术飞速发展，转基因植物在很多领域的研究推广取得了令人瞩目的成绩。

植物基因工程中常用的转化方法一般是通过土壤农杆菌系统、植物病毒系统和DNA直接导入法这三种方法进行。

另外，转基因技术快速发展的同时转基因植物检测技术也在不断地进歩和完善，目前被广泛应用的转基因植物检测方法有三类：整合水平上的检测、转录水平上的检测和表达水平上的检测。

本文着重对农杆菌介导的植物转化方法和转基因植物的检测两方面进行综述。

关键词：农杆菌，转化，转基因植物，检测方法伴随着生命科学的飞速发展，植物组织培养技术以及植物组织分化、植物基因重组等技术发展迅速并得到广泛应用。

1984年转基因烟草的诞生[1]，使外源基因导入植物细胞从而获得转基因新品种的设想成为现实。

随后，转基因技术被广泛应用于各个方面如：植物新品种的改良、植物性状改良、植物抗性的提高以及植物基因功能的研究等[2-4]。

新型转基因大豆、转基因番茄及转基因玉米等转基因新品种陆续面世[5]。

植物转基因技术不但能够打破植物的物种界限，还能够使物种基因彼此进行交流。

使植物育种年限缩短，植物育种进程加快，植物抗性也在一定程度上得到很大提高，使来自于不同生物种类的优良目的基因导入植物并得到优良植物新品种。

同时，运用转基因技术研究植物自身基因结构组成及其基因功能调控等方面也取得了一定成果；运用转基因技术还研制出生物反应器和雄性不育系[6]。

目前，利用转基因技术将目的基因导入植物基因组中的常用方法主要有：土壤农杆菌介导的基因转化、DNA直接导入和植物病毒系统介导法。

本文着重介绍土壤农杆菌介导的目的基因转化法，同时也对目前转基因植物的检测进行适当总结。

1 土壤农杆菌介导系统的种类土壤农杆菌中的发根农杆菌和根癌农杆菌能够侵染植物伤口并形成与土壤农杆菌中大质粒有关的植物肿瘤和冠瘿。

能够诱发此类肿瘤的根瘤农杆菌中常常带有分子量为200-250kb的Ti质粒。

转基因的方法和原理转基因的方法和原理 1目的基因制备和载体系统 2几种有效的转基因方法 3定点突变和受体系统简介转基因研究技术的中心环节即为DNA重组技术，其最终目的是将DNA片段转入为一个生物体，从而使该生物体具有表现某种性状。

转基因通过获取基因、重组基因和表达基因等过程来实现。

转基因打破了物种的界限，使不同种的生物的遗传物质在分子水平上重新组合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的，实现对生物体的改造。

基本步骤 1.分离获得目的基因； 2.在体外进行DNA重组，将外源DNA 连接到能自我复制又带有选择标记的载体上； 3.将重组DNA转移入受体细胞；4.筛选出含有目的DNA的受体细胞克隆；目的基因制备和载体系统目的基因来源：基因组DNA分离、化学合成、PCR扩增、cDNA文库及DNA文库中制得。

载体：质粒、λ噬菌体、柯氏质粒、YAC载体等工具酶：限制性内切酶、连接酶、DNA聚合酶等 PCR反应 PCR技术就是在体外通过酶促反应或自发地扩增一段目的基因的技术。

PCR要求反应体系具有以下条件： 1、要有与被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的DNA引物约20个碱基左右； 2、具有热稳定性的酶如Taq DNA聚合酶； 3、4种dNTP； 4、作为模板的目的DNA序列。

PCR反应可扩增出100～5000bp的目的基因。

PCR反应过程 1、变性，即将模板DNA置于95℃的高温下，使双链DNA的双链解开变成单链DNA；2、退火，将反应体系的温度降低至55℃左右，使得一对引物分别与变性后的两条模板链相配对；3、延伸，将反应体系温度调整到Taq DNA聚合酶作用的最适温度72℃，然后以目的基因为模板，合成新的DNA链。

反复进行约30个循环左右，即可扩增得到目的DNA序列。

利用cDNA法由于真核生物的mRNA具有poly A这一结构特点，可以用结合长度大约为15bp的短链多聚DT的纤维素填充的柱子，根据碱基配对原则，将其吸附，从真核细胞的总RNA中提取出来，再用能打断A-T氢键的缓冲液洗脱。

植物遗传转化步骤植物遗传转化是一种通过改变植物的遗传物质来实现特定目的的技术。

这一技术已经被广泛应用于植物育种、基因工程和农业生产中。

下面我们将介绍植物遗传转化的具体步骤。

一、选择目标植物和目标基因在进行植物遗传转化之前，首先需要确定目标植物和目标基因。

目标植物通常是经济作物或者重要的研究对象，而目标基因则是具有特定功能的基因，如抗病性、耐旱性等。

二、构建载体构建载体是进行植物遗传转化的重要步骤之一。

载体是将目标基因导入植物细胞的媒介，通常由DNA序列构成。

在构建载体时，需要将目标基因插入到适当的表达载体中，并加入其他必要的DNA片段，如启动子、终止子和选择标记基因等。

三、转化载体到植物细胞将构建好的载体导入植物细胞是植物遗传转化的核心步骤。

目前常用的转化方法有农杆菌介导的转化和基因枪法。

农杆菌介导的转化是将构建好的载体转化到农杆菌中，然后利用农杆菌侵染植物组织，将载体导入植物细胞。

基因枪法则是利用高压气体将载体直接“射击”到植物细胞中。

四、筛选转化植株在转化植物细胞后，需要进行筛选以获得含有目标基因的转化植株。

为了区分转化植株和未转化的植株，常常会在载体中加入选择标记基因。

选择标记基因通常会使转化植株对某种抗生素或除草剂具有耐受性，在培养基中添加相应抗生素或除草剂后，只有含有目标基因的转化植株能够生长下去。

五、培养和繁殖转化植株筛选出含有目标基因的转化植株后，需要进行培养和繁殖。

通常会将转化植株移至含有适当营养物质的培养基中进行生长，以获得足够数量的转化植株。

六、鉴定转化植株在培养和繁殖转化植株后，需要对其进行鉴定，确认其是否成功转化。

鉴定方法包括PCR扩增、Southern印迹和Western印迹等。

通过这些方法，可以检测目标基因在转化植株中的存在和表达情况。

七、后续分析和应用一旦确认转化植株成功，就可以进行后续的分子生物学和生理学分析，如基因表达分析、蛋白质功能研究等。

此外，转化植株也可以用于基因工程和农业生产中，如改良作物品质、提高产量等。

农杆菌转化法又名农杆菌Boletus介导转化法。

农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物,从而使农杆菌移向这些细胞)，并诱导产生冠瘿瘤或发状根农杆菌转化法。

根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti(Tumour including)质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA(Transferring DNA)，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。

我们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。

本段步骤1、获取目的基因。

用限制酶切割下目的基因。

2、基因表达载体的构建。

将目的基因与载体(大多数选用质粒)用DNA连接酶连接起来。

3、将目的基因导入受体细胞。

将含目的基因的重组质粒导入农杆菌(农杆菌为受体细胞)。

4、目的基因的检测与鉴定。

用DNA分子杂交技术/分子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学水平鉴定(这个方法需要导入重组后的细胞的植物体，详见第五步) 几种方法进行检验(根据要求选取不同方法)。

5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物体进行个体生物学水平鉴定。

整个转基因体系的建立步骤大致可以归纳为:目的载体的构建---载体的农杆菌转化---农杆菌与植株共培养---转化植株的筛选---转化植株的鉴定。

在每一步中都涉及到很多的方法与技术。

目的载体的构建，包括目的基因的克隆，载体的酶切，连接，以及测序分析。

载体的农杆菌转化，目前有很成熟的方法，试验中应注意热激和冷激的时间。

农杆菌与植株的共培养，即为植株转化实验，在溶液中加入促进植株愈伤生长的激素能一定程度提高转化率。

植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定1. 引言植物基因转化是一种重要的生物工程技术，利用这种技术可以引入外源基因或修改内源基因，从而改变植物的性状和功能。

转基因植物是通过植物基因转化技术获得的具有外源基因的植物，具有重要的应用价值。

本文将介绍植物基因转化的基本原理和方法，并探讨转基因植物的分析与鉴定方法。

2. 植物基因转化的基本原理和方法2.1 基本原理植物基因转化利用穿透细胞壁的技术，将外源DNA导入植物细胞，通过细胞的内源机制使其稳定地表达。

常用的植物基因转化方法包括农杆菌介导的转化、生物弹射法和基因枪法等。

2.2 基本方法2.2.1 农杆菌介导的转化农杆菌介导的转化是最常用的植物基因转化方法之一。

基本步骤包括构建表达载体、感受剂的处理和遗传转化的选择和鉴定。

构建表达载体时，将目标基因插入适当的载体上，并添加转录和翻译的调控序列，如启动子和终止子，以确保目标基因的表达。

感受剂的处理是将表达载体导入农杆菌中，并通过培养条件的优化，使农杆菌中的表达载体得到高效表达。

遗传转化的选择和鉴定是将感受剂经过适当的处理后，转化到植物细胞中，并通过筛选和鉴定来确定转化成功的细胞株。

2.2.2 生物弹射法生物弹射法是将DNA以高速撞击植物细胞，使其穿透细胞的质壁和细胞膜，进而将外源基因导入细胞内。

生物弹射法通常使用微粒子加速器或毛发管射击法进行。

微粒子加速器是一种将金属微粒或微球与外源DNA一起加速，并将其发射到目标细胞上的设备。

通过微粒的高速撞击，外源基因能够穿透细胞的质壁和细胞膜。

毛发管射击法是将DNA包裹在微小的金属颗粒上，然后使用高压气体将金属颗粒射击到目标细胞上。

这种方法也能够使外源基因穿透细胞膜进入细胞。

2.2.3 基因枪法基因枪法是将外源DNA包裹在金粒或微米级金属颗粒上，并使用高压气体或炮发射器将其穿过细胞质，进入植物细胞。

基因枪法不需要依赖转化菌或细胞融合等辅助手段，直接将外源DNA送入目标细胞，因此具有较高的成功率。

农杆菌转化法过程农杆菌转化法是一种常用的基因工程技术，用于将外源基因导入植物细胞中。

下面将详细介绍农杆菌转化法的过程。

我们需要准备一株带有所需外源基因的农杆菌。

这个外源基因可以是来自同一物种的不同个体，也可以是来自不同物种的基因。

通过将外源基因插入到农杆菌的载体中，并利用细菌的复制机制使其扩增，最终得到大量带有外源基因的农杆菌。

接下来，我们需要准备待转化的植物材料。

通常情况下，可以使用植物的离体组织，如叶片、茎段或种子等。

这些组织通常需要经过一定的前处理，如表面消毒和切割等，以提高转化效率。

然后，将农杆菌和植物材料进行共培养。

首先将农杆菌培养物与植物材料接触，使其充分吸附在植物细胞表面。

然后，将植物材料转移到含有适当培养基的培养皿中，并在适当的条件下进行培养。

培养基通常含有一些必需的营养物质和激素，以促进植物细胞的再生和分化。

在培养过程中，农杆菌会通过其特殊的转运系统将外源基因导入植物细胞中。

这个转运系统包括几个关键的基因，它们共同参与了农杆菌转化的过程。

其中最重要的是T-DNA区域，它是农杆菌载体中的一个特殊片段，负责将外源基因导入植物细胞。

当外源基因成功导入植物细胞后，我们需要进行筛选和鉴定。

一种常用的筛选方法是利用选择性培养基，其中含有抗生素或其他毒性物质。

只有带有外源基因的植物细胞才能在这样的培养基上生长，而未转化的细胞则会死亡。

我们需要对转化后的植物进行进一步的分析和验证。

这包括检测外源基因的存在和表达，以及评估转化植株的性状和遗传稳定性等。

这些分析可以通过PCR、南方杂交、蛋白质表达分析等技术手段来完成。

总结起来，农杆菌转化法是一种可靠、高效的基因工程技术，广泛应用于植物遗传改良和基因功能研究等领域。

通过合理设计实验方案和选择适当的材料，可以实现外源基因的稳定导入和表达，为植物的改良和创新提供了有力的工具和手段。

农杆菌的转化流程方案一1.农杆菌的培养及感受态的制备①农杆菌菌株划YM平板，26-28℃培养48 h；②挑取单菌落接种到40 ml 无抗生素的YM液体培养基中，250 r/min，26-28℃悬浮培养12-16 h；③将菌液转入灭过菌的50 ml离心管中，4℃，8000 r/min,离心8 min；④弃上清，加入用100 mM NaCl (4℃预冷)重悬收集的农杆菌；⑤4℃，8000 r/min, 离心8 min；⑥弃上清，加入原始菌液1/50体积（800μ l/管（此时的感受态农杆菌可以直接用于转化）并分装成100μ l）的20 mM CaCl2重悬菌体；⑦置液氮中10 s，放入-20℃冰箱中保存备用。

2.农杆菌的转化（冻融法）将感受态农杆菌置于冰上，加入1μg质粒DNA（体积不宜超过10 μ l），充分混匀，冰上放置30 min；②置液氮中快速冷却约1min后迅速转入37℃水浴中，待其融化；③加1 ml 无抗生素的YM 液体培养基于28℃，230 r/min 培养2-4 h；（或直接用1 mlμl，留500 μ l于管中④3000 r/min 离心2 min收集菌体，将上清吸去500 培养菌直接涂布含抗生素的YM平板）；⑤重悬菌体并涂布到含有适当抗生素的YM平板上吹干, 28℃培养48 h；⑥挑取单菌落接种到筛选液体YM培养基中，28℃，250 r/min 培养48 h，将菌液用于保存或转化；注：EHA105抗利福平霉素，LBA4404抗硫酸链霉素。

在转化前后的所有培养基中均可加入相应的这两种抗生素，以防止杂菌污染。

以上挑菌及抗生素加入工作均在超净台上进行。

3．转基因烟草体系的建立⑴烟草无菌苗的培养：①70%乙醇消毒烟草种子30 s后，用无菌水清洗两次，更换NaClO处理25-30 min，无菌水清洗四次；②将灭菌后的种子移至1/2 MS固体培养基（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4）、1.0 mg/L 维生素、2.0 mg/L 苷氨酸、3% 蔗糖、0.6-0.7% 琼脂（KOH 调至pH 5.7-5.8），于25-26℃，14 h光照/10 h黑暗条件下萌发；③14天后，将萌发出的烟草幼苗转移至含有相同1/2 MS培养基的组织培养盒中，同样条件下继续培养4-6周，小苗长出后可用于叶盘转化。

农杆菌转化法详细过程
一、质粒的构建
1、结合胞外表达载体DNA片段：根据需要，挑选合适的质粒载体，通常是常用的pUC18或pUC19，然后从受体DNA片段中提取事先选择好的促进脱附酶及其他酶结合位；
2、PCR扩增：使用上述质粒模板进行PCR扩增，以获得清洁的受体片段；
3、克隆：把扩增片段和质粒模板克隆到同一质粒中，然后克隆到载体存储库中，以创建定向载体用于后续研究。

二、原核转化
1、准备转化粒菌：在装满氯化物的快速离心管中，将转化菌株(一般为质粒转录系) 用冰凉的悬浮液制成2X数量的悬淋液；
2、增加plasmid 质粒：在用有抗生素控制的细菌方法中，增加转换用材料，如plasmid质粒，磷酸二钙和CaC1₂，以及可能的其他试剂；
3、原核转化：将上述的悬浮液（AP出水液）添加到悬淋液中，然后加入CaC1₂和磷酸二钙，用低频超声处理混合液使其充分作用10分钟；
4、选择转化的细胞：将处理过的转化液投入加有抗生素的培养基中，然后将这些细胞培养到辅助抗生素中，以选择转化的细胞，在抗生素抑制剂中，该细胞会死亡；
5、筛选和鉴定：原核基因转换后，体外状态选择一般会获得若干转换抗性的菌株，最终进行PCR、测序或其他方法以鉴定突变体，以确定该菌株具有最终突变基因。

一、实验目的1. 掌握农杆菌介导的植物基因转化方法。

2. 学习基因转化过程中的操作技巧。

3. 研究农杆菌介导的基因转化在植物遗传育种中的应用。

二、实验原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种土壤细菌，它具有将T-DNA（转移DNA）片段转移到植物细胞中的能力。

在植物基因转化实验中，利用农杆菌将目的基因导入植物细胞，进而实现基因的遗传转化。

本实验采用农杆菌介导的方法，将目的基因导入拟南芥（Arabidopsis thaliana）细胞中。

三、实验材料1. 拟南芥植株2. 农杆菌菌株（E. coli DH5α和Agrobacterium tumefaciens C58）3. 载体DNA（含目的基因）4. 限制性内切酶和连接酶5. 载体质粒（含T-DNA序列）6. 抗生素（卡那霉素和壮观霉素）7. 培养基和试剂四、实验方法1. 构建重组载体：将目的基因克隆到载体质粒中，并构建重组载体。

2. 农杆菌转化：将重组载体与农杆菌共同培养，使目的基因转移到农杆菌中。

3. 农杆菌感染：将转化后的农杆菌与拟南芥植株进行共培养，使农杆菌感染拟南芥细胞。

4. 抗性筛选：将感染后的拟南芥植株在含有抗生素的培养基上培养，筛选出含有目的基因的植株。

5. 基因表达检测：通过PCR、RT-PCR等方法检测目的基因在转化植株中的表达情况。

五、实验结果与分析1. 重组载体的构建：通过PCR和测序验证，成功构建了含目的基因的重组载体。

2. 农杆菌转化：经过共培养和感染，拟南芥植株表现出明显的抗性。

3. 抗性筛选：在含有抗生素的培养基上，成功筛选出含有目的基因的植株。

4. 基因表达检测：通过PCR和RT-PCR实验，证实目的基因在转化植株中得到了表达。

六、实验结论1. 成功构建了含目的基因的重组载体。

2. 农杆菌介导的基因转化方法在拟南芥中取得了较好的效果。

3. 通过抗性筛选和基因表达检测，验证了目的基因在转化植株中的稳定遗传和表达。

将重组质粒导入农杆菌的方法
重组质粒导入农杆菌的方法通常有以下几种步骤：
1. 选择合适的质粒：根据研究需要选择合适的载体质粒，例如pCAMBIA系列质粒。

该质粒含有T-DNA插入位点，能够容纳外源基因和选择标记基因。

2. 提取质粒DNA：从重组质粒制备DNA，可以使用各种DNA提取试剂盒或自制方法进行DNA纯化。

3. 制备农杆菌：培养农杆菌，通常使用Agrobacterium tumefaciens或Agrobacterium rhizogenes，选择需要转化的菌株和培养条件。

4. 细胞密度调整：充分培养菌株，根据要转移的植物种类调整细胞密度。

5. 细胞混悬液制备：将细胞沉淀物悬浮在含有过渡物质（例如辛烷基胺或凯蒂拉酸）的接种液中。

6. 加入质粒DNA：将质粒DNA加入到细胞混悬液中，通过渗透脆化细胞壁，使质粒DNA能够转移到农杆菌细胞内。

7. 培养菌株：调节培养条件，使细胞继续生长并表达外源基因。

8. 选择转化菌株：利用抗生素或草甘膦等筛选选择标记基因，筛选质粒已成功导入的转化菌株。

9. 验证外源基因转化效果：利用PCR、Southern blotting、Western blotting 等技术检测外源基因是否已经顺利导入并表达。

目前外源基因导入叶绿体基因组的方法主要有基因枪转化法、PEG介导转化法、显微注射及激光注射法、转运肤介导的叶绿体间接转化法、电击法等。

(1)基因枪转化法基因枪法是20世纪80年代后期发明的，它是将外源DNA(通常是带有目的基因的质粒载体)如附在金属颗粒(如钨、金等)表面，然后通过高压动力装置将金属颗粒轰击到受体细胞中的特定部位。

基因枪法是目前己被验证的叶绿体基因组转化转化效率最高、采用最多的方法。

大多数己经成功的叶绿体基因组转化都是用这种方法实现的。

它可以通过人为控制，将外源DNA导入到细胞核及细胞器(如叶绿体体、线粒体等部位)中。

基因枪法不受物种和基因型的限制，转化后的组织可以迅速再生成植株，并且这一方法适合于不同种类的植物，其缺点是成本较高，操作复杂，不易普及到所有实验室。

(2)PEG介导转化法PEG介导转化法是在PEG存在的情况下将去壁的受体细胞原生质体暴露在纯化过的外源DNA中，由于PEG的存在，原生质体会先缩水，然后细胞膜结构会发生重构，在细胞膜结构到达不可逆破坏之前除去PEG，细胞膜结构又会回复到原先的自然稳定状态。

在此过程中，外源DNA有机会进入胞内及质体内，从而实现外源基因的转化。

Golds等用PEG介导转化法成功地实现了烟草的原生质体转化，为质体转化提供了一条新的途径。

该方法虽然成本较低，但原生质体的制备和再生比较困难，使得转化植株的再生频率较低，从而限制了这一方法的普遍应用。

到目前为止，只有PEG法在烟草质体转化中获得成功的报道。

(3)显微注射及激光注射法显微注射及激光注射法就是利用能量很高、直径很小的激光微束引起细胞膜可逆性穿孔，从而使处于细胞周围的外源DNA随之进入细胞的转基因方法。

早在1987年，webe等就利用微束激光照射油菜细胞，将用荧光素标记的外源DNA 导入叶绿体，观察到荧光显示，并且发现这一处理对叶绿体的光合能力和细胞的分裂能力影响较小。

由于激光微束穿刺技术操作简便，转化频率高，从而引起了许多科学家的重视，由此带动了此项技术在原生质体遗传转化中的应用与发展。