PCR快速检测食品中志贺氏菌方法的建立

文章编号:1002-2694(2008)02-0150-04
PCR 快速检测食品中志贺氏菌方法的建立3
蔡亦红
摘　要:目的　本研究根据福氏志贺菌(S hi gella lex ner i )侵袭性质粒抗原H 基因(invasion plasmid antigen H ,ipa H ),设计了一对特异性引物,预计PCR 扩增的目的基因片段为435bp 。

对PCR 的特异性、敏感性分析以及建立L16(43)正交试验对
PCR 扩增条件如引物浓度、dN TP 浓度和Tm 值等的优化,建立了快速检测福氏志贺菌的稳定的PCR 方法。

该方法检测的灵
敏度为可以检测到食品中7ng/ml 福氏志贺菌的基因组DNA 。

并且模拟检测食品中的细菌,结果很稳定。

该方法操作简单、检验周期短、特异性和灵敏度高,能够快速地实现对食品中的志贺菌的诊检和监控。

关键词:PCR ;微生物;检验;福氏志贺菌 中图分类号:R378.2　文献标识码:A
A rapid PCR assay for the detection of Shi gell a f lexneri in food samples
CA I Y i 2ho ng
(A nhui Medical Universit y ,Hef ei 230032,China )
ABSTRACT :According to the invasive plasmid antigen H gene (i pa H )of S hi gella f lex neri ,one pair of primers was de 2signed ,and the anticipated target f ragment of PCR product was assumed to be 435bps.The conditions for specificity and sensi 2tivity analysis of PCR for single gene and the condition for optimization reaction by orthogonal experiment design L16(43),such as concentration of primers and dN TP and the Tm value were optimized.In this way ,a rapid and stable method of PCR assay for the detection of S.f lex neri was established.The sensitivity of this method was found to be 7ng/ml genomic DNA of S f lex neri in food samples.In addition ,bacteria could be detected in the mimic samples of food with the stable results.This
method of PCR assay appears to be simple ,rapid ,highly sensitive and specific ,and quite valuable for the detection and surveil 2lance of S.f lex neri infection.
KE Y WOR DS :PCR ;microorganism inspection ;S hi gella f lex ner i
3安徽医科大学校科研基金资助项目(No.522562) 作者单位:安徽医科大学,合肥　230032;
Email :kitycyh @
福氏志贺菌(S hi gell a f lex neri )是引起食源性疾病的常见病原。

人体在感染后都可能出现恶心、呕吐、腹痛等症状,对于症状不典型者,极容易被误诊为沙门菌、致泻性大肠埃希氏菌或霍乱弧菌感染,影响治疗而导致慢性感染或带菌者,这一方面延误了患者的早期治疗,另一方面扩大了病原体的传播。

因此,迫切需要对病因进行准确而快速的诊断。

目前,包括我国在内的许多国家对这类致病菌的检验,大多仍沿用传统的细菌培养及鉴定方法,步骤繁琐,检验周期长,有的须1w 以上且易污染,远不能满足应对突发公共卫生事件上,及时诊断、结果准确、敏感性和特异性高的要求〔1〕。

为此,本研究以福氏志贺菌侵袭性质粒抗原H 基因(invasion plasmid an 2tigen H ,ipa H )为研究对象建立一种稳定的、高敏感性和特异性的PCR 体系,力图快速、准确检测食品中志贺菌感染。

1　材料与方法
1.1　菌种　福氏志贺菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧
菌、副溶血弧菌由安徽医科大学微生物教研室和合肥市疾病预防控制中心提供。

1.2　主要试剂及仪器PCR 扩增试剂购自上海Promega 公司,DNA 提取试剂盒购自上海赛百盛基因技术公司,100bp DNA ladder marker 购自Taka 2ra 宝生物工程(大连)有限公司,751型紫外分光光度计购自上海光谱仪器有限公司,D YY 25型电泳仪由北京市六一仪器厂生产,Mastercycler 梯度PCR 仪购自Eppendorf 公司。

1.3　细菌培养和基因组DNA 的提取　将福氏志贺菌接种于GN 增菌液〔2〕中进行增菌,然后接种于
EMB培养基上进行纯培养。

挑一单个菌落复接种到30ml相应增菌液内增菌,提取1ml菌液用甘油保存于-80℃备用。

其余菌液与培养有金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌和副溶血弧菌的培养液分装于离心管中,5000r/min离心1min,收集沉淀,用细菌DNA提取试剂盒提取细菌的DNA,用紫外分光光度计测定DNA浓度,分装数管,-20℃保存备用。

福氏志贺菌基因浓度为70μg/ml。

1.4　扩增的目的基因及引物设计　以福氏志贺菌的ipa H基因为研究对象,根据GenBank中基因序列,NCBI注册号为NC008258,应用Primer5.0引物设计软件设计如下一对特异性引物:
上游引物F:GC GGGCA TA GT GAACA TAAA G;下游引物R:C GGTAA GAC GT TCAACAC。

预期目的基因长度为435bp(引物由上海生工合成)。

1.5　PCR扩增　初步PCR反应体系:模板DNA1μl,上、下游引物各1μl(10p mol/L),dN TP1.5μl (2.5mmol/L),Taq酶0.5μl(单位为5U/μL),10×Taq酶buffer2.5μl,MgCl2溶液1.5μl,其余用无菌的去离子水补足,总体积25μL。

PCR扩增条件: 95℃变性3min,94℃变性50s、54℃退火50s、72℃延伸50s,共进行30个循环,最后72℃延伸10 min,PCR产物在1.5%的凝胶上进行电泳。

将PCR扩增产物进行回收,然后进行核苷酸序列测定,并与GenBank中发表的相应序列进行比较。

1.6　PCR扩增条件的优化　对影响PCR扩增条件如dN TP浓度、退火温度和引物浓度等进行优化,以确定最佳的PCR反应条件。

通过PCR敏感度试验初步摸索出最佳模板浓度,根据多次试验和经验,对影响较大的因素:引物浓度、dN TP浓度和Tm值,先初步确定了一定的范围然后设计了一个L16(43)的正交试验。

1.7　PCR扩增的特异性和敏感性分析
1.7.1　特异性试验　将金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌和副溶血弧菌菌液等量分别与志贺菌液混合后然后利用试剂盒提取模板DNA,用ipa H的引物进行PCR,测定PCR扩增的特异性。

1.7.2　敏感性试验　将已经测定浓度的细菌的模板DNA按100～10-10倍稀释,按照相同的上述条件分别进行PCR扩增,测定PCR扩增的敏感性。

1.8　人工模拟样品检测　将志贺菌培养液计算菌落总数,使细菌的含量>104cf u/mL,接种于志贺菌为阴性的2g生鸡蛋、奶粉、米粉、碎猪肉、鸡肉、鸭肉、牛肉、酱菜、苹果、白菜、香蕉中培养一段时间后,取样品进行PCR检测。

2　结　果
2.1　福氏志贺菌的ipa H基因的PCR扩增和核苷酸序列分析　利用初步PCR反应体系,对ipa H基因进行扩增,在435bp处可以见到明亮的目的基因的条带,见图1。

扩增的ipa H基因片段与GenBank 中公布的基因序列同源性均达到98%以上。

图1　福氏志贺菌的i pa H基因的PCR扩增结果
泳道1:福氏志贺菌;泳道2:阴性对照;泳道3:100bp
DNA ladder marker
Fig.1　PCR results of the S.f lexner i ipa H
1:S.f lex neri;2:negative control;3:100bp DNA
ladder marker
2.2　PCR扩增条件的优化　对扩增的条件进一步优化。

对影响较大的因素:引物浓度、dN TP浓度和Tm值,分别设计在一定范围内的L16(43)正交试验(表1、图2)。

根据Bandscan5.0软件分析图像灰
表1　L16(43)正交试验相对DNA含量测定结果
T able1　Prthogonal experimental design L16(43)and contents of DNA
试验号
Number
引物浓度
Concentration
of primer
(pmol/ml)
dN TP浓度
Concentration
of dNP T
(μmol/μl)
Tm值
Value
of Tm
(℃)
相对DNA含量
Contents
of DNA
(ng)
10.20.1552320.24
20.40.258587.05
30.60.258524.71
40.80.1554344.27
50.20.256396.89
60.40.152478.42
70.60.152362.24
80.80.256469.53
90.20.152388.59
100.40.256584.98
110.60.256461.03
120.80.152467.29
130.20.2554457.98
140.40.1558415.32
150.60.1554416.63
160.80.2558614.07
图2　福氏志贺菌ipa H PCR 扩增条件优化L16(43)正交试验结果
1:试验号15;2:试验号14;3:试验号13;4:试验号12;5:试验号11;6:试验号10;7:试验号9;8:试验号8;9:试验号7;10:试验号6;11:试验号5;12:试验号4;13:试验号3;14:试验号2;15:试验号1;16:试验号16;17:100bp DNA ladder marker
Fig.2　R esults of optimal multiple PCR for S.f lexner i by orthogonal experimental design L16(43)
1:No15;2:No14;3:No13;4:No12;5:No11;6:No10;7:No9;8:No8;9:No7;10:No6;11:No5;12:No4;13:No3;14:No2;15:No1;16:No16;17:100bp DNA ladder marker
度值,并以100bp DNA ladder marker 中500bp 处条带的灰度值与DNA 含量的比值为标准,计算扩增的目的基因片段的相对扩增水平。

结果显示50
μl 的PCR 反应体系中的其他影响较小的因素不变:Taq 酶1μl ,10×Taq 酶buffer 5μl ,MgCl 2溶液3
μl 。

最适引物浓度为0.4p mol/μl ,最适dN TP 浓度为0.25
μmol/μl ,最适Tm 值为52℃,此时的DNA 相对含量可以达到614.07ng ,并且无非特异性条带和引物二聚体的产生。

2.3　福氏志贺菌PCR 扩增的特异性分析　将金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌和副溶血弧菌菌液等量分别与志贺菌液混合后然后利用试剂盒提取模板DNA ,用ipa H 的引物进行PCR ,结果只有在含有志贺菌的模板中扩增出大小约为435bp 的特异性片段,见图3。

对照菌模板中均未扩增出目的基因。

图3　福氏志贺菌的i pa H 基因的PCR 特异性扩增结果
1:阴性对照;2:金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌;3:福氏志贺菌;M :100bp DNA ladder marker Fig.3　Specif icity of PCR for S.f lexner i i pa H
1:negative control ;2:S taphy lococcus aureus ,V ibrio cholera ,V ibrio parahaemol yticus ;3:S hi gella f lex 2neri ;M :100bp DNA ladder marker
2.4　福氏志贺菌PCR 扩增的敏感性分析　PCR
检测志贺菌的灵敏度为7ng/ml ,见图4。

2.5　人工模拟样品检测　取人工模拟样品进行PCR 检测,均可以在435bp 处看到明亮的目的条带,见图5。

实验证明人工污染的食品中都可以同时的准确地检测出所接种的致病菌,并且无非特异性扩增,证明该PCR 检测方法对食品中存在的福氏志贺菌有很好的特异性和敏感性。

图4　福氏志贺菌PCR 灵敏度检测结果
1:7fg/ml ;2:70fg/ml ;3:0.7pg/ml ;4:7pg/ml ;5:70pg/
ml ;6:0.7ng/ml ;7:7ng/ml ;8:70ng/ml ;9:0.7
μg/ml ;10:7μg/ml ;11:70μg/ml ;12:100bp DNA ladder mark 2er
Fig.4　R esults of PCR sensitivity for S.f lexner i
1:7fg/ml ;2:70fg/ml ;3:0.7pg/ml ;4:7pg/ml ;5:70pg/ml ;6:0.7ng/ml ;7:7ng/ml ;8:70ng/ml ;9:0.7
μg/ml ;10:7μg/ml ;11:70μg/ml ;12:100bp DNA ladder marker
3　讨　论
近年来,随着以核酸为基础的微生物分子检测的发展,特别是PCR 技术的应用,使致病菌检验发展到一个新的水平。

多种单一致病菌的PCR 快速检验方法被建立起来,如沙门氏菌〔324〕,单核细胞增
图5　人工模拟样品检测福氏志贺菌PCR结果
1:阴性对照;2:接种志贺菌的生鸡蛋;3:接种志贺菌
的奶粉;4:接种志贺菌的米粉;5:接种志贺菌的碎猪
肉;6:接种志贺菌的鸡肉;7:接种志贺菌的鸭肉;8:接
种志贺菌的牛肉;9:接种志贺菌的酱菜;10:接种志贺
菌的苹果;11:接种志贺菌的白菜;12:接种志贺菌的
香蕉;13:100bp DNA ladder marker
Fig.5　R esults of PCR for S.f lexner i in simulate examina2 tions
1:negative control;2:egg with S.f lex ner i;3:milk
powder with S.f lex ner i;4:rice flour with S.f lex2
ner i;5:pork with S.f lex ner i;6:chicken with S.
f lex ner i;7:duck with S.f lex ner i;8:beef with S.
f lex ner i;9:pickle with S.f lex ner i;10:apple with S.
f lex ner i;11:cabbage with S.f lex ner i;12:banana
with S.f lex ner i;13:100bp DNA ladder marker
生性李斯特氏菌〔5〕,大肠埃希氏菌0157〔6〕等。

但目前还未建立一种稳定的、优化的、特异性和敏感性高的检测福氏志贺菌的PCR方法。

本研究中选取的福氏志贺菌的侵袭性质粒抗原H基因(invasionplasmidantigen H,ipa H)是编码侵袭性质粒的基因,存在于所有志贺菌属的质粒和染色体上,有大量的拷贝数,基因具有高度特异性,比其他毒力因子ipaB、C、D基因有更高的灵敏度,是侵袭力的特异标志〔7〕。

赵丽华等以ipa H基因为目的基因,利用分子信标PCR的方法检测20份样本,准确率和特异性均为100%〔8〕。

PCR的影响因素复杂,不同的引物之间、模板和引物浓度及其比例、dN TP的浓度、Tm值的大小、Mg2+的浓度等都会对PCR结果造成不同程度的影响。

通过本研究表明,在本体系中Taq酶、10×Taq酶buffer、MgCl2溶液等对PCR扩增的结果影响不大。

对扩增结果影响较大的是模板浓度、引物浓度、dN TP浓度和Tm值。

不同的模板浓度会影响产物量的多少,本研究中PCR中最低能检测到反应体系中7ng/ml福氏志贺菌的DNA。

随着模板浓度的提高可以明显的看到产物条带亮度明显提高。

对引物浓度、dN TP浓度和Tm值,分别设计在一定范围内的L16(43)正交试验。

根据Bandscan 5.0软件分析图像灰度值,并以100bp DNA ladder marker中500bp处条带的灰度值与DNA含量的比值为标准,计算扩增的目的基因片段的相对表达水平。

再通过方差分析,结果显示在这三个因素中,引物浓度对PCR扩增结果的影响明显大于dN TP和Tm值。

以100bp DNA ladder marker中500bp的DNA片段含有DNA量为150ng,优化后PCR扩增后的DNA量可以达到614.04ng,并且无非特异性条带和引物二聚体的产生。

在人工模拟样品检测中,随机选取的11种食品的基因组对于检测福氏志贺菌无干扰,进一步证明了该体系的特异性和稳定性,能够快速地实现对食品中的福氏志贺菌的诊检和监控。

参考文献:
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热带医学杂志,2006.6(5):4992502.
收稿日期:2007207224;修回日期:2007209228。