B.9. 重复剂量(28 天) 毒性(皮肤)
1. 方法
1.1. 引言
见综合引言部分B(A).
1.2. 定义
见综合引言部分B(B).
1.3. 标准物质
无.
1.4. 测定方法原理
测定物以递增的剂量，每天被分别涂抹在几组动物样品样品的皮肤上，每一组一种剂量，为时28 天。
在测定期间，动物每天都被观测毒性表现。
在测定中死去的动物要被解剖，在实验结束时仍存活的动物也要被解剖。
1.5. 质量标准
无.
1.6. 测定方法的描述
1.6.1. 预备
早于测定开始前至少五天，动物应处于与测定室住宿和饲养同样的条件下。
在测定之前,健康年轻动物被随机分配到测试和对照组。
在测定前不久，动物背部的毛发应被剪除一部分。
也可选用刮的方法，但必须在实验开始前24小时内完成。
重复的剪除或刮除毛发的工作应以周为间隔进行。
当进行这些操作的时候，应尽量小心以避免磨损皮肤。
至少10% 的身体表面应清洁以便于测定。
当决定清除覆盖的毛发面积时，应对动物样品称重。
测定固体经过合适的方法被粉碎，测定物在研碎后应用水充分润湿，或在必要的地方用一种合适的媒介物来确保其与皮肤的充分接触。
液体测定物质通常不用稀释。
日常测定每周要进行五到七天。
1.6.
2. 测定情况
1.6.
2.1. 动物样品
可以选用成年的老鼠，兔或天竺鼠。
也可使用其它的物种，但是使用它们需要合适的理由。
在研究开始时，所选用动物样品的重量变化范围应不超过正常平均值的 20%。
1.6.
2.2. 数目和性别
每个剂量标准至少有10只具有健康皮肤的动物（5雌5雄）。
雌性应该是未生育过的和非怀孕的. 如果实验中的死亡也被考虑的话，所需动物总数中应该增加到实验结束之前预定死亡的动物数目。
除此之外，后继的包括10只动物样品的小组（5雌5雄）应该加大剂量进行28天的测定，并在测定完成后观察毒效的可逆性，持续性，或延缓发生性14
天。
10只动物组成的对照组也被应用。
1.6.
2.
3. 剂量水平
在一个对照组至少需要三种剂量水平，如果有采用媒介物进行测定时，每组也至少要有三种剂量水平。
每天，测定动物应该被放出来至少6小时。
被测药物每天需在相同的时间涂抹到动物身上，并且要根据动物样品的体重变化每周或每两周对药量进行调整。
除了使用相同的药物外，测定组与对照组的动物应该处于相同的管理模式之下。
借助于媒介物来辅助药效的对照组，应该按与治疗小组同样的方法施与药剂。
所用药量应与治疗小组的最高药量相同。
最高药量应能产生毒性反应，但又不会造成或造成很少的死亡。
最小药量应不产生任何明显迹象或毒性。
最低剂量应比接触人的预计用药量大。
理论上，中间药量应产生可观测到的最小毒性反应。
如果不止一种中间药量，它们的具体药量需要按照毒效逐渐加深来确定。
在最低和中间药量组以及对照组，死亡比率要低，从而允许得到有价值的结果评定。
如果测定物会产生严重的皮肤刺激效应，就应该降低浓度。
浓度的降低可能造成其他毒效的减弱或消失，即使用高剂量，也会产生减弱现象。
此外，如果皮肤遭到了严重的损伤，就需要停止现行测定，改用低浓度进行新的测定。
1.6.
2.4. 极限测定
如果在1000 毫克/公斤的剂量或比已接触的以人作为实验对象的实验数据稍高的剂量标准下进行的初步研究中，未产生毒效反应，就没
有必要进行更深入的测验。
1.6.
2.5. 观察周期
每天都要对动物进行毒效反映的观察。
应对动物样品的死亡时间，毒效反应出现和消失的时间进行记录。
1.6.3.实验过程
动物样品应被单独圈养。
理论上，应以每周七天，28天为一周期，对动物进行药物测定。
辅助小组中用于后药效观察的动物应在不用药的条件下继续被观察14天，以观测对毒性的恢复能力与抵抗性。
动物与外界的接触时间每天应至少为6小时。
测定药物应均匀地被涂于大约占动物样品体表面10%的皮肤上。
对于高毒性的物质，所涂的面积可以减小，但应将药物涂得尽量薄，尽量均匀。
在动物样品与外界接触的时候，应用多孔渗水纱布和无刺激性带子将测定物固定于皮肤上。
测定部位应以合适的方式进行进一步的包扎，从而固定纱布和测定物，以及确保测定物不被动物摄入体内。
可以用抑制剂制止动物摄入药物，但用药物完全控制不是一种好的方法。
也可选择颈圈作为保护措施。
所有的动物都要每日观察并记录下因为毒性所发出的呻吟及毒性发作的时间，程度及持续时间。
观察应该包括皮肤和毛发，眼睛及黏膜，呼吸器，循环器，植物性和中枢神经系统，躯体运动和行为方式的变
化。
动物样品的重量需要每周进行测量。
同时食物消耗量也需要每周测量。
定期的对动物样品的观察是必要的，它可以确保动物没有因为被同伴吃掉，组织分解，遗忘等原因而丢失。
在研究的最后时期，所有的幸存者在治疗组中被验尸。
垂死的和遭受严重精神错乱或痛苦的动物应该在观察到时就被移走，人道宰杀并验尸。
应该在实验结束时对包括对照组在内的所有动物进行以下的测定：1）血液学，至少包括血液的，血红蛋白凝结，红血球数，总数和差别的白血球数量，血液凝结潜力的测定。
2）临床血液生化学至少应包括肺和肝功能的参数：血清丙胺酸转氨酶（谷氨丙酮转氨酶），血清天(门)冬氨酸盐(或酯) 转氨酶（谷氨草酰乙酸转氨酶），尿素氮，白蛋白，血肌氨酸酐，蛋红素总量，血清蛋白质总量；
另一项可能是一项充分的毒性评价所必须的决定因素包括钙，磷，氯，钠，钾，禁食葡萄糖，脂质分析，激素，酸碱平衡，正铁血红蛋白和胆碱脂酶活性。
为进一步扩展有效作用的研究，可能应用补充的临床生化学。
1.6.4.完整验尸
应该对在研究中的所有动物进行完整的验尸。
至少要测定肝，肺，肾上腺，睾丸应该在解剖后立即弄湿，防止干枯。
器官和组织，例如正常的和处理过的皮肤，肝，肺，睾丸，脾，肾上腺，心脏和目标器官
（那些在大小上表现出总的损伤和变化的器官），应该在合适的介质中保存为了以后可能的组织病理学的测定。
1.6.5.组织病理学测定
在高剂量的组和对照组中，组织病理学的测定应该在保存的器官和组织中进行。
表现出缺陷的组织和器官可归于高剂量的实验物质应该在所有低剂量的组中检验。
在附属组中的动物应该在组织测定时特别注意那些在其他处理的组中表现出损伤的器官。
2.实验数据
实验数据要用列表的形式总结表示出测定开始时动物样品的数目，表现出各种损伤的动物样品的数目。
所有的观察结果都要用适当的统计方法评估。
任何已知的统计方法都可以使用。
3实验结果报告
3.1. 实验结果报告
如果可以的话，实验结果报告应该包括下列信息：
-动物样品数据（例如种类，种属，来源，环境条件，食谱）；-实验条件（包括敷料类型，封闭的或不封闭的）；
-药剂标准（包括媒介物，如果使用的话）和浓度；
-无效的水平，如果可能的话；
-不同性别和药剂的毒性反应；
-研究过程中的死亡时间或者动物生存到实验结束；-毒性或其他影响
-每次不正常现象观察到的时间和它随后的过程；-食物和体重实验数据；
-要进行血液测量，并记录结果；
-要进行临床生化实验并记录结果；
-验尸结果；
-组织病理学的发现的详细描述；
-如果可以的话，进行实验结果的统计学处理；
-结果讨论；
-结果解释说明；
3.2. 实验结果的评价和分析
参照综合引言B（D）部分。
4参考文献
参照综合引言B（E）部分。
