ATP荧光法在乳制品行业的应用研究报告

试论生物技术在乳制品加工中的应用摘要：由于市场经济体制的不断改革变化和生物技术的飞速发展,尤其是三鹿事件的爆发,人们越发重视乳制品的安全加工问题。

公众对和谐社会的构建、和谐环境的营造等呼声日益高涨。

企业如何运用合理的科学技术,来保证乳制品加工企业的健康和稳定的发展,早已成为企业可持续发展的关键。

本文通过介绍生物技术的应用在我国乳制品企业中的重要意义,并指出固定化技术、乳蛋白生物活性肽和乳制品免疫机能等生物技术在乳制品加工企业中的具体应用。

关键词：乳制品加工生物技术随着近年来市场经济体制改革和市场进程的日益深化,食品加工和风险已经受到了社会各界的强烈关注。

尤其是我国加入世界贸易组织之后,如何通过生物技术的引入,提高乳制品企业的市场竞争力,提高乳制品生产加工技术与质量,完成企业和国际的接轨,早已成为各企业关注的重要课题之一。

1、生物技术的含义生物技术就是利用先进的工程学技术、生物体系和先进的生物学,进而促进生物特性的改变达到物质的转化,以满足人们对各种产品的生产需求。

我们可将生物技术分为以下三个阶段:传统的生物技术阶段、近代生物技术阶段以及现代生物技术阶段。

传统的生物技术阶段主要以酿醋、酿酒和酱油的酿造等为主;而近现代的生物技术则是以生物标本和发酵技术等为主的;而新型的发酵工程、基因工程、现代生物的反应工程、酶工程、生化工程和细胞工程等等,均属于现代生物技术的阶段。

乳制品行业的各方面均有用到现代的生物技术,例如良种牧草和乳牛的选育、乳产品成分的改善、饲料生产和乳品质检、提高产奶量等均与现代生物技术密不可分。

2、在乳制品的加工中应用生物技术的重要意义2.1 生物技术的应用,有利于提高企业乳制品质量通过将生物技术引入到乳制品加工企业,有效的提高了我国的乳制品质量,增加了乳制品的产量。

生物技术的合理运用,实现了企业在可允许的范围内提高产品质量和产量的目的。

通常为了提高乳牛产奶量,可能会向乳牛注射某类激素比如牛生长激素（BST）这一新的生物技术的应用。

I 6,N FOO D S F TYGUID 5品或形象检测、不同类异物检测、异物大小测量、脱漏检测、图像重检、保全周期管理、图像自动保存、产品缩放、调整传送带速度等多种功能，最多允许记录10000个产品。

当然，照必斯也可根据企业的具体情况提供相匹配的解决方案。

X-ray 异物检测，安全设计很关键对于X-ray 异物检测设备来说，产品研发之初最需要考虑的就是设备的安全性能，这需要制造商考虑包括相关法规和标准、设备本身的性能、检测物品的特性等等。

针对这些问题，照必斯的产品完全参照美国FD A 和欧盟CE 相关标准和要求设计产品的基本规格，设备的漏流线量可达到1uSv/h 以下；另外，为保证检测机的安全，还配备了其它安全措施，比如X 射线指示灯、通道的开闭、应急停止设置、防止操作者将手伸进设备的传感器等等。

照必斯的X -ray 异物检测机的X 射线量值在0.001G y 以下，相对于WHO 规定的10K G y 以下的安全值小很多，因此，食品几乎不会受到X 射线的辐射，能够充分保证食品的安全性和品质，而其检测系统的流线量在1uSv/H r 以下，对人体的辐射非常之小。

因此，照必斯的检测机不但能够保障食品的安全，还可保障工作人员少受辐射之苦。

X-ray 异物检测，容易操作很重要对于异物检测来说，除了具有强大的功能、安全的设置外，还应该易于操作。

复杂的操作不但不能给企业带来成本的节约，还会增加企业人员培训的相关费用，给企业带来一定的负担，所以评价设备优劣或先进与否的一个重要标准就是设备的易操作性。

照必斯生产的X -ray 异物检测机基于半导体精密技术，采用优质材料及配件，能够保证设备的持续运转，并且可根据企业的要求，实现完全自动化检测，检测系统在设定相关参数之后便可自动运行，并且能够保证极小的故障率，为企业省去了很多人力的投入。

随着消费者对食品安全重视程度的不断提高，X-ray 异物检测在食品行业将大有作为。

ATP生物发光技术用于食品接触表面清洁效果评价的验证研究摘要：腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine Triphosphate,ATP）又称三磷酸腺苷。

ATP是一切生命体能量的直接来源，普遍存在于动植物、细菌、真菌细胞和食物残渣中，而无生命的碎屑物质中不存在ATP。

生物活性物质中的ATP含量是相对恒定的，借助“荧光素-荧光素酶”发光反应可对ATP进行定量测试，从而反映出生物细胞量的残留。

ATP与荧光素反应发出的荧光强度（Relative LightUnit,RLU）与活细胞数量基本呈正比例关系。

荧光值越高，表明ATP的量越多，也就意味着表面的残留物越多，清洁状态越差。

因此，ATP检测法就被用来快速检验物品表面是否洁净。

关键词：ATP生物发光技术；食品接触表面RLU值越高代表存在微生物污染风险的可能性越大，但ATP不能替代微生物涂抹检测，一般ATP的灵敏度可达到10-15 mol ATP标准物质（有的品牌甚至更高），以细菌为例基本也要达到103才能达到ATP的检测灵敏度。

研究表明，只有纯微生物培养物而没有任何食物残渣的情况下，荧光强度（RLU）和菌落数（Colony-Forming Units,CFU）呈很好的正相关关系。

ATP生物发光技术由于具有操作简单、快速、方便的特点，能够简单快速验证清洁消毒效果而被广泛应用于食品、制药、医疗和养殖等行业。

随着ATP生物发光技术的普及，市场也涌现了大量的ATP卫生监测系统品牌，如3M、海净纳、龟甲万、天隆、美正、巅峰、绿洲等品牌，其价格和性能差异较大，也造成了用户选择的困惑。

1 材料与方法1.1 仪器与试剂两个品牌ATP卫生监测系统（包括ATP荧光检测仪和表面ATP采样拭子）；Pipet-lite移液枪（美国RAININ公司）；sx500高压灭菌锅（日本TOMY公司）；ATP标准品（Merck，货号：A1852-1VL）、金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、大肠杆菌（ATCC25922）、啤酒酵母菌（ATCC 10231）。

《化妆品微生物检验方法ATP生物荧光增幅法》编制说明编制说明一、标准起草的基本情况（包括简要的起草过程、主要起草单位、起草人等）近年来我国化妆品行业规模蓬勃发展，人民群众的消费需求不断升级，除了对产品功效、使用体验和品牌服务的追求，产品微生物安全问题日益受到社会重视。

国务院于2020年6月颁布《化妆品监督管理条例》，鼓励和支持化妆品生产经营者采用先进技术和先进管理规范，提高化妆品质量安全水平，为引领行业健康有序发展提供了更加明确的政策法规指引和依据。

目前我国对化妆品中微生物的检验主要依据《化妆品安全技术规范》（2015年版）（以下简称《规范》）中的传统培养法。

随着我国化妆品市场迅速发展，行业迫切需要更加先进高效的微生物检测新技术，以提高检测效率和自动化程度，改进生产过程质量控制，加快产品安全流通。

基于生物荧光素酶技术促进生物体内三磷酸腺苷（ATP）荧光信号释放和增幅的原理，针对增菌培养基配方、培养温度、培养容器、霉菌破壁方法等关键性条件重点攻关，创建了一套ATP生物荧光增幅法，可实现化妆品中微生物的48小时定性检验。

参考《中华人民共和国药典》（2020版），对ATP生物荧光增幅法与《规范》微生物检验方法开展等效性验证研究和方法适用性研究，研究结果表明ATP生物荧光增幅法与《规范》中的标准方法具有部分等效性，即证明ATP 生物荧光增幅法检验结果为阴性时，与标准方法具有等效性，表明化妆品产品不含微生物污染；检验结果为阳性时，则需采用标准方法进行检验，以确定微生物数量是否符合指标限值要求。

该方法具有灵敏度高、通量大、检测效率高、检测周期短等技术优点，可推广应用于化妆品及相关领域生产过程监控及出厂放行检验中微生物污染样品的快速筛选。

为推动新技术在化妆品微生物检验的应用、提高化妆品微生物安全控制水平，拟制定《化妆品微生物检验方法ATP生物荧光增幅法》，对化妆品微生物ATP生物荧光增幅法的适用范围、操作步骤、检验结果判定等内容进行标准化规范。

ATP荧光检测仪市场分析报告1.引言1.1 概述概述：ATP荧光检测仪是一种用于快速检测和监测生物污染的先进技术，它通过测量生物细胞中的三磷酸腺苷（ATP）来确定水和表面的卫生状况。

随着全球卫生意识的不断提高和食品安全标准的不断加强，ATP荧光检测仪市场迅速发展。

本报告将对该市场的概况、主要参与者分析以及市场趋势和预测进行深入分析。

1.2 文章结构文章结构部分的内容如下：本报告分为三个部分，包括引言、正文和结论。

引言部分首先对ATP荧光检测仪市场进行概述，介绍市场的基本情况和现状。

接着说明本文的结构，包括各部分的内容和安排。

然后阐明本报告的目的，即对ATP荧光检测仪市场进行深入分析和研究。

最后对本报告的内容做出总结。

正文部分将对ATP荧光检测仪市场进行详细分析，包括市场概况、主要市场参与者分析以及市场趋势和预测。

结论部分将总结ATP荧光检测仪市场的现状，展望未来的发展趋势，并提出相关建议和建议。

"1.3 目的"部分:本报告的目的是对ATP荧光检测仪市场进行深入分析，了解当前市场的概况、主要参与者的情况以及市场的趋势和预测。

通过本报告，读者将能够更全面地了解ATP荧光检测仪市场的发展现状，为相关从业者提供市场趋势分析和业务决策指导。

希望通过本报告，可以为ATP荧光检测仪市场的发展提供参考和借鉴，帮助相关企业更好地把握市场机遇，制定合理的市场战略，促进市场的健康发展。

1.4 总结在本文中，我们对ATP荧光检测仪市场进行了深入分析和研究。

通过概述了市场的概况、主要参与者的分析以及市场趋势和预测，我们对市场现状有了全面的了解。

通过对市场的详细分析，我们可以看到ATP荧光检测仪市场正处于快速发展阶段，市场需求持续增长，并且竞争格局也在不断变化。

随着技术的不断更新和市场的不断扩大，ATP荧光检测仪市场将会面临更多的机遇和挑战。

在展望未来发展方面，我们认为ATP荧光检测仪市场有着巨大的潜力，但也需要面对技术创新、市场竞争等方面的挑战。

论著·防保康复CHINESE COMMUNITY DOCTORS 中国社区医师2017年第33卷第24期食品卫生关乎人们的身体健康与生命安全，是人们普遍关注的一个社会问题。

随着人们对食品卫生质量要求的不断提高，食品卫生检验技术也在不断地完善和进步。

微生物检验是确保食品安全卫生的一个重要环节，是对食品质量的重要保障。

但是，在食品微生物检验的过程中，影响检验质量的因素是多方面的，如果不能很好地对这些影响因素进行有效控制，检验结果就可能有很大的偏差，使得食品卫生无法得到保证。

因此，对食品微生物检验的质量控制进行全面的探究是非常重要的。

食品检验中现代生物技术应用的重要性一个较高品质的食品安全方面的检验能够在一定程度上保证食品的安全性。

最近这些年我们国家对于食品安全的问题越来越重视，借助了现代生物理论作为基础，现代生物技术能够应用到的领域也变得越来越广泛了。

除此以外，生物技术在近些年越来越有优势，有更加安全并且环保、能够精准地进行测试和检验等特点，在食品的安全检验当中运用得十分顺手。

要保证食品的安全性，传统的生物以及食品的检验技术是不具有相关的优势的，现代生物技术具有良好的发展前景。

为此，本文以ATP技术为例对其检测方法进行深入探究。

ATP 生物发光法分析ATP 生物发光法是一种较为高效且操作便捷的检测方法，只需几分钟便可得到检测结果[1]。

技术原理为将细菌内的ATP从自由可溶解的状态中释放出来，在有荧光素酶、镁、氧气存在的条件下和虫荧光素发生反应产生荧光，通过对荧光信号的判断对ATP 的含量进行推测和计算，以检测样品中的含菌量。

其反应过程如图1所示。

以往ATP 生物发光仅用于细菌、酵母以及其他真菌的检测工作中。

但其缺陷是灵敏度不高，对于细菌数量也有严格限制，一般在103～104CFU/mL。

相关技术人员以及学者研究开发了ATP 再生系统，提高了此方法的灵敏度，从而有效弥补了传统ATP 发光法的缺陷。

浅析食品微生物检验中ATP发光法的应用摘要：本文就atp生物发光法的检测原理、检测步骤、特点、检测的影响因素及在食品工业中的应用进行了综述，并提出了目前atp生物发光法检测中存在的问题。

关键词：atp 生物发光法；荧光素；提取剂；温度；检验1 atp 的理化性质1.1 atp广泛存在于各种活的生物体中,活的菌体中也含有atp。

细菌死亡后,在细胞内酶的作用下,atp将很快被分解掉。

atp是高能磷酸化合物的典型代表。

atp 是由一分子腺嘌呤、一分子核糖和三个相连的磷酸基团构成的核苷酸，其分子结构式如图1所示。

图1 atp分子结构式1.2 atp有两个高能磷酸键，一个低能磷酸键。

每个高能磷酸键水解时，可产生30．54kj／mol的能量。

atp是细胞内特殊的自由能载体，广泛地存在于细胞内，如细胞核、细胞溶胶、线粒体等。

易水解，且水解时可释放出大量的能量，但水解易受细胞内环境的ph、mg2+浓度等的影响。

2 atp生物发光法检测的原理及一般步骤2.1 atp普遍存在于所有活的生物体中，被用来贮存和传递化学能，称作为“能量货币”。

当生物体死亡后，在细胞内酶的作用下，atp很快被分解掉。

因此，测定样品中的atp浓度，即可推算出活菌数。

atp生物发光技术产生于20世纪70 年代中期。

1983年，moyer 等最早提出细胞内源性atp的含量可以反映细胞的活性和活细胞的数量。

同年gronroos等也证实该技术是一种可靠、灵敏度高的确定细胞活性度的检测方法。

mcelroy[最先引入荧光素酶．atp检测法，其反应机理为：在mg2+存在下，萤火虫荧光素酶以d-荧光素酶、atp、o2为底物，将化学能转化为光d-荧光素+atp+o2 oxy-荧光素+amp+ppi+h2o能，发出光量子，其发光强度(i)与atp浓度(catp)符合下列函数关系。

式中，imax为最大发光强度；km为1×1o-4。

由上式可知，当catp远小于km时，i正比于样品中的catp。

Promicol ATP微生物快速检测系统在UHT灭菌奶商业无菌检测上的应用研究林木娣;黄诗韵;杨爱君;何瑛【摘要】介绍一种微生物快速检测系统,利用活体微生物中的三磷酸腺苷(ATP)作为标记分子,通过检测超高温(UHT)灭菌奶中微生物的ATP在反应过程中产生的荧光强度,可以间接测定样品中的微生物含量.该方法具有简便、快速、灵敏度高的优点,经验证能与国标法商业无菌检测达到一样的筛查检验目的,能够对UHT产品进行快速放行,在UHT灭菌乳与乳制品的质量监控中具有重要的意义.【期刊名称】《中国乳业》【年(卷),期】2017(000)006【总页数】6页(P69-74)【关键词】三磷酸腺苷(ATP);商业无菌检测;超高温(UHT)灭菌奶;快速检测【作者】林木娣;黄诗韵;杨爱君;何瑛【作者单位】广东燕塘乳业股份有限公司;广州中实生物科技有限公司;广东燕塘乳业股份有限公司;广东燕塘乳业股份有限公司【正文语种】中文（1 广东燕塘乳业股份有限公司；2 广州中实生物科技有限公司）乳与乳制品是大家公认的营养全面的食品，对改善居民的营养、平衡膳食结构、补钙和增强体质均有重要的作用。

超高温（UHT）灭菌奶是其中的一种，因其保存方便、保质期长的特点，受到广大消费者的喜爱。

按照国家安全标准的要求，所有经过UHT灭菌的食品都需要经过商业无菌检验合格才能出售，因商业无菌的微生物检验[1]需耗时10 天以上，检验周期长给企业的仓储、资金回笼等带来较大的压力，越来越多的企业迫切需要一种可靠的、稳定的、快速的微生物检测方法来替代传统的商业无菌检验方法，从而达到快速筛查放行的目的，为抢占市场及内部经营提供便利。

三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）生物发光检测方法具有简便、快速、灵敏度高的优点，已广泛应用在微生物检测[2]、食品卫生监控[3]等领域，而欧洲、澳洲等地近年也致力于ATP微生物快速检测系统在UHT灭菌奶的商业无菌检验的研究及推广。

乳制品加工新技术研究作者：李明何玉梅来源：《食品界》2018年第10期随着生活质量的提高，人们对乳制品数量及质量要求也逐渐提高，这给现代乳制品企业生产带来了压力与考验。

我国是乳制品生产和消费大国，如何引入新的加工技术使乳制品加工实现高产量、高质量、高营养的目标，成为当今研究的热点问题。

本文通过探讨当前主流高新技术在乳制品加工生产中的应用，为乳制品加工生产改革提供思路。

其中，在细菌检测及消除上，可利用生物荧光技术和超高压技术；在杂质分离上，可采用膜分离技术提高纯度；在添加营养物质上，可采用微胶囊技术；在全过程生产中，可采用在线监测技术进行智能监控。

生物荧光技术在乳制品加工中的应用生物荧光技术发明于20世纪八十年代，主要是利用ATP生物荧光技术进行微生物检测，其原理是荧光酶在有氧条件下和荧光素结合后催化ATP转变成AMP，并且释放出荧光（波长为562nm），ATP- TCA通过荧光酶-荧光素催化反应测定细胞内ATP含量来反映活细胞的数量。

在乳制品产品质量检测过程中，生物荧光技术主要是检测细菌及特异性病原體的数量，及时检测乳制品产品的质量，从而确保乳制品的高质量。

我国对乳制品的质量有着严格的规定，现代乳制品企业可通过检测ATP含量计算出乳制品中的微生物含量，从而与国家标准进行比对，判断产品是否符合国家规定的健康标准。

超高压技术在乳制品加工中的应用超高压技术起源于20世纪九十年代，其原理是在对物体施加超过100MPa以上的压力后，能够有效实现对该物体的杀菌消毒，同时对物体本身并没有太大的破坏，这项技术能有效解决乳制品生产加工中的杀菌问题。

传统的乳制品杀菌一般通过加热的方式，利用高温来杀菌，但这对原有的蛋白质、纤维素等成分造成破坏，从而降低了乳制品的品质。

超高压技术能有效避免此类问题，对乳制品的营养价值与口味没有任何影响，乳制品中有害健康的微生物能够被彻底根除。

同时，在生产干酪的过程中使用超高压技术，能加快蛋白质的凝固速度，从而提高干酪的产量。

ATP生物荧光法在乳品企业清洗效果评价方面的应用
丘勒红;梁俊健;林淑仪;林夏纯;何瑛;杨爱君
【期刊名称】《中国乳业》
【年(卷),期】2022()10
【摘要】清洗是乳制品加工环节当中的核心环节之一,设施设备的卫生管控和有效清洗是保证产品质量安全的前提。

本文介绍了三磷酸腺苷(ATP)生物荧光法的基本原理;论述了ATP生物荧光技术在清洗验证时的应用,确保清洁程序得到有效的监控;并且对ATP生物荧光法在实际应用中一些常见问题,如温度对ATP检测的影响、ATP检测限值的设定、通过检测数据的整合进行趋势分析等进行了讨论。

【总页数】5页(P72-76)
【作者】丘勒红;梁俊健;林淑仪;林夏纯;何瑛;杨爱君
【作者单位】广东燕塘乳业股份有限公司
【正文语种】中文
【中图分类】F42
【相关文献】
1.ATP 生物荧光法监测两种腹腔镜器械清洗方法的效果评价
2.ATP生物荧光法评价内镜清洗效果的对比研究
3.ATP 生物荧光法在监测器械清洗效果中的应用研究
4.食品企业清洗效果评价及三磷酸腺苷（ATP）生物荧光检测应用介绍
5.ATP生物荧光法在达芬奇机械臂清洗效果检测中的应用
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DOI:10.13995/ki.11-1802/ts.026691引用格式:刘瑞娜,孙思佳,葛媛媛,等.ATP 生物荧光增幅法在控制菌检测中的验证研究─应用于化妆品领域[J].食品与发酵工业,2021,47(11):252-258.LIU Ruina,SUN Sijia,GE Yuanyuan,et al.Validation study on amplified ATP bioluminescence assay in the detection of control bacteria Application in cosmetics field[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(11):252-258.ATP 生物荧光增幅法在控制菌检测中的验证研究─应用于化妆品领域刘瑞娜1,孙思佳1,葛媛媛1,刘吉泉2,洪海军3,崔生辉4,刘艺茹1,翟磊1,林雅芳5,沈颖3,陈怡文4,刘骥6,李婷1,姚粟1∗1(中国食品发酵工业研究院有限公司,北京,100015)2(Procter &Gamble International Operations,新加坡,138547)3(联合利华(中国)有限公司,上海,200335)4(中国食品药品检定研究院,北京,100050)5(北京宝洁技术有限公司,北京,101312)6(查士利华微生物应用技术(上海)有限公司,上海,201708)摘㊀要㊀参照‘中国药典“(2020版)药品微生物检验替代方法验证指导原则中定性检验方法的验证要求,选取了清洁类㊁护理类㊁美容修饰类等6种化妆品,从专属性㊁检测限㊁重现性和耐用性4个方面开展了ATP 生物荧光增幅法与‘化妆品安全技术规范“(2015版)中耐热大肠菌群㊁铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌检验标准方法的部分等效性研究㊂结果显示,ATP 生物荧光增幅法的专属性和耐用性良好;采用该方法检测3种控制菌代表菌株的LOD 50分别为0.20㊁0.35和0.14CFU /g ,经Fisher exact test 统计分析,ATP 生物荧光增幅法检测限均显著优于相应标准方法(P <0.05);3家不同实验室使用2种方法对相同人工污染样品的检测结果无统计学差异(P >0.05),说明ATP 生物荧光增幅法重现性良好㊂研究结果表明,ATP 生物荧光增幅法与‘化妆品安全技术规范“(2015版)中耐热大肠菌群㊁铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌检验的标准方法具有部分等效性,可实现化妆品中各类微生物在48h 的同步检测㊂关键词㊀ATP 生物荧光增幅法;化妆品;控制菌;耐热大肠菌群;金黄色葡萄球菌;铜绿假单胞菌第一作者:刘瑞娜(硕士,助理工程师)和孙思佳(硕士,助理工程师)为共同第一作者(姚粟教授级高级工程师为通讯作者,E-mail:milly@)收稿日期:2021-01-07,改回日期:2021-01-28㊀㊀随着生物学技术及交叉学科的发展进步,各类快速㊁灵敏㊁通量大的微生物新型检验方法的开发验证逐渐成为关注热点[1-5]㊂ATP 生物荧光增幅法是本课题组基于ATP 生物荧光技术建立的一套微生物快速检验方法[6-8]㊂该方法利用微生物体内的腺苷酸激酶AK 催化外源添加的二磷酸腺苷ADP 转换为三磷酸腺苷ATP,短时间内实现ATP 增幅,通过检测荧光信号的强度判断测试样品中是否含有微生物污染[9]㊂经前期方法学验证,该方法与‘化妆品安全技术规范“(2015版)[10](以下简称‘规范“)中菌落总数㊁霉菌和酵母菌总数检验标准方法具有部分等效性[11]㊂耐热大肠菌群㊁铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌是‘规范“中要求每克或每毫升化妆品产品中不得检出的三类污染菌[10]㊂其中,耐热大肠菌群是指一群需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌,为化妆品粪便污染指标菌;铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌则是具有潜在风险的机会致病菌[12]㊂为证明ATP 生物荧光增幅法可同步筛查化妆品中控制菌污染,本研究参照‘中国药典“(2020版)[13]药品微生物检验替代方法验证指导原则中定性检验方法的验证要求,收集清洁类㊁护理类㊁美容修饰类等6种化妆品,从专属性㊁检测限㊁重现性和耐用性4个方面开展了ATP 生物荧光增幅法与‘规范“中上述3种控制菌标准检验方法的部分等效性验证研究,以期明确ATP 生物荧光增幅法的使用范围,并为将其推广应用于食品㊁水㊁环境等领域的微生物快速检测提供借鉴㊂1㊀试验方法1.1㊀试验产品依据GB /T 18670 2017‘化妆品分类“的分类原则[14],从清洁类㊁护理类㊁美容修饰类中选取洗发水㊁沐浴液㊁护发素㊁定型水㊁面霜和面膜共6种市售产品,每个产品选择3个不同批次㊂1.2㊀试验菌株研究表明‘规范“中耐热大肠菌群检验方法的实际目标菌为具耐热性能的大肠埃希氏菌[15]㊂结合化妆品生产环境㊁原料和配方等特性,收集了环境和工业等不同来源的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)㊁铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)各20株(共60株),用于测试改良TAT(MTAT)培养基的促生长能力,并以大肠埃希氏菌(E.coli)CICC10389(=CMCC(B) 44102)㊁铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)CICC10419 (=CMCC(B)10104)和金黄色葡萄球菌(S.aureus) CICC10384(=CMCC(B)26003)作为代表性控制菌株用于方法验证研究,以上菌株均由中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC)提供㊂1.3㊀仪器与试剂HG-50高压灭菌器,日本平山制作所株式会社; Celsis®Advance II光度计,Charles River Laboratories; BHG 8082型恒温培养箱㊁THZ-98C恒温振荡培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;往复式摇床,Eber-bach;AC2-4S1生物安全柜,新加坡艺思高科技有限公司㊂双倍乳糖胆盐(含中和剂)培养基㊁大豆酪蛋白消化卵磷脂聚山梨酯肉汤(soya casein digest lecithin polysorbate broth,SCDLP)液体培养基㊁Baird-Parker琼脂㊁十六烷三甲基溴化铵琼脂,北京陆桥技术股份有限公司;改良TAT(MTAT)培养基(g/L):TAT肉汤22.50㊁硫代硫酸钠0.50㊁组氨酸0.10㊁蛋白胨7.50㊁葡萄糖15.00㊁氯化钠0.85㊁卵磷脂1.43和吐温80 39.00,pH值调至7.0ʃ0.1;ATP生物荧光增幅法试剂,Charles River Laboratories Celsis®AMPiScreen TM㊂1.4㊀试验方法依据‘中国药典“(2020版)微生物检验替代方法验证指导原则中定性检验方法的验证要求,从专属性㊁检测限㊁重现性和耐用性4个方面,开展ATP 生物荧光增幅法和‘规范“中耐热大肠菌群㊁铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌检验方法的部分等效性验证㊂1.4.1㊀专属性专属性参数的验证包括ATP生物荧光增幅法是否能够适用于3种控制菌的富集生长,且有产品存在时该方法是否能够检测出其中的控制菌㊂本研究通过测定MTAT富集培养基对3种控制菌的促生长能力和人工污染样品来评价方法专属性㊂为全面考察方法所用培养基对3种控制菌的促生长能力,将收集的不同来源的60株控制菌株制备为10~100CFU/10mL的菌悬液,接种至90mLMTAT富集培养基,于(30ʃ2)ħ,200r/min,振荡培养48h,吸取50μL富集培养液进行ATP生物荧光增幅法检测,同时,观察培养液浊度确认是否有微生物生长,以此评价富集培养基MTAT的促生长能力㊂人工污染样品的测定以大肠埃希氏菌(E.coli) CICC10389㊁铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)CICC 10419和金黄色葡萄球菌(S.aureus)CICC10384作为代表菌株㊂参照Charles River公司提供仪器使用说明书对试验选择的6种化妆品进行样品影响测试和接菌试验㊂样品影响测试通过的标准为培养基空白的信号值低于1000RLU,产品样品的信号值低于3倍培养基空白的信号值,ATP对照㊁微生物对照㊁ATP样品和微生物样品的信号值高于3倍培养基空白的信号值,且产品ATP回收率应高于25%(推荐值),计算公式(1)为:ATP回收率/%=ATP样品信号值-产品样品的信号值ATP对照信号值-培养基空白信号值ˑ100(1)平板确认阴性无可见菌落生长㊂接菌试验通过的标准为微生物样品和微生物对照的检测结果为阳性,未接菌的产品样品检测结果为阴性,且平板确认无菌落生长㊂1.4.2㊀检测限使用生理盐水将大肠埃希氏菌(E.coli)CICC 10389㊁铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)CICC10419和金黄色葡萄球菌(S.aureus)CICC10384均制备为梯度是100㊁10和1CFU/mL的接种液,并按照产品目标污染浓度10㊁1和0.1CFU/g进行接种,分别使用ATP生物荧光增幅法和‘规范“中标准方法进行检测㊂利用Fisher exact test对2种方法的检测结果进行统计分析,评价2种方法的检测限是否存在差异,并分别计算每种方法对3株控制菌株50%检出时的检出限(LOD50)㊂ATP生物荧光增幅法检测:取10g产品加入90 mL MTAT富集培养基中制备为产品稀释液,将3株控制菌株的3个梯度的接种液分别取1mL接种于上述制备的产品稀释液中,混匀,吸取10mL于90mL MTAT富集培养基,置于(30ʃ2)ħ,200r/min,振荡培养48h,取样上机进行ATP生物荧光增幅法检测㊂每个产品重复5次㊂标准方法检测:取10g产品加入90mL生理盐水中制备为产品稀释液,将3株控制菌株的3个梯度的接种液分别取1mL接种于上述制备的产品稀释液中,混匀㊂分别按照‘规范“中3种控制菌的检测方法进行检测㊂大肠埃希氏菌的判断标准为双倍乳糖胆盐(含中和剂)培养基,培养24h,产酸产气报告阳性,不产酸产气,继续培养至48h,如仍既不产酸也不产气,报告阴性,否则报告阳性㊂铜绿假单胞菌的判断标准为十六烷三甲基溴化铵琼脂培养48h,无铜绿假单胞菌典型菌落生长[10],报告阴性,有则报告阳性㊂金黄色葡萄球菌的判断标准为Baird-Parker培养基培养48h,无金黄色葡萄球菌典型菌落生长[10],报告阴性,有则报告阳性㊂每个产品重复5次㊂1.4.3㊀重现性以金黄色葡萄球菌(S.aureus)CICC10384为代表进行重现性试验,将菌株CICC10384按照目标污染浓度10~30CFU/g接种于同批次的护发素产品中,选择3家不同实验室分别使用ATP生物荧光增幅法和标准方法对同一人工污染样品进行检测,并通过Fisher exact test统计方法对检测结果进行分析,评价3家不同实验室的检测结果是否存在显著性差异㊂1.4.4㊀耐用性MTAT富集培养基的促生长能力是ATP生物荧光增幅法检测的关键,为保证其中和效果和增菌能力,团队前期进行了大量试验研究优化培养基成分㊂因此,本研究通过考察不同品牌的TAT肉汤配制的MTAT富集培养基的促生长能力来进行耐用性评价㊂选取3种不同品牌的TAT肉汤,配制MTAT富集培养基,以金黄色葡萄球菌(S.aureus)CICC10384为代表菌株开展耐用性试验,将菌株按照目标污染浓度10~30CFU/g接种于不同MTAT富集培养基稀释的护发素产品中,使用ATP生物荧光增幅法进行检测㊂比较不同TAT基础培养基配制的MTAT是否会对ATP生物荧光增幅法检测结果产生影响㊂2㊀结果与讨论2.1㊀专属性促生长试验结果显示(表1),在无产品干扰情况下,60株控制菌株经MTAT培养基振荡培养48h后菌液均浑浊,且ATP生物荧光增幅法检测结果均为阳性,表明ATP生物荧光增幅法使用的MTAT富集培养基对3种控制菌的富集能力良好㊂表1㊀MTAT富集培养基促生长试验结果Table1㊀Growth promotion test results of MTAT broth菌株名称菌株编号接种量/(CFU㊃mL-1)比值1)ATP检测结果是否浑浊菌株编号接种量/(CFU㊃mL-1)比值ATP检测结果是否浑浊E.coli CICC24085481371.50P2)+3)CICC2023442㊀200.89P+ CICC10907132234.69P+CICC20547436481.32P+ CICC23657222234.69P+CICC2167547613.21P+ CICC10354461234.58P+CICC103614853.23P+ CICC1000345274.73P+CICC21621405054.75P+ CICC1003249340.29P+CICC2367541380.48P+ CICC1022141156.48P+CICC23689411000.34P+ CICC103031371.84P+CICC1038928369.70P+ CICC103044492.65P+CICC103992910861.19P+ CICC1030847409836.06P+CICC1042445250.25P+P.aeruginosa CICC2162544409836.06P+CICC2164324409836.06P+ CICC1020448409836.06P+CICC2164411409836.06P+ CICC1029913409836.06P+CICC2202545409836.06P+ CICC2015212409836.06P+CICC2202848409836.06P+ CICC2023635409836.06P+CICC1035144409836.06P+ CICC2024047409836.06P+CICC2162646409836.06P+ CICC2110049409836.06P+CICC2361819409836.06P+ CICC2194646409836.06P+CICC1041947409836.06P+ CICC2163647409836.06P+CICC2464718409836.06P+ CICC2164141409836.06P+CICC2464928409836.06P+续表1菌株名称菌株编号接种量/(CFU㊃mL-1)比值1)ATP检测结果是否浑浊菌株编号接种量/(CFU㊃mL-1)比值ATP检测结果是否浑浊S.aureus CICC2392618201.04P+CICC2369912979.34P+ CICC10145432190.11P+CICC10384164163.96P+ CICC10201214116.41P+CICC10473111645.44P+ CICC1030146409836.06P+CICC1078649277.05P+ CICC10306451753.22P+CICC10789431962.68P+ CICC10307482069.98P+CICC10790235541.64P+ CICC21648111278.16P+CICC24065144468.39P+ CICC21600334180.77P+CICC24066437596.26P+ CICC23463254059.74P+CICC248174730.70P+ CICC23478456182.25P+CICC24818251106.94P+㊀㊀注:1)比值,微生物样品RLU值与培养基空白RLU值的比值;2), P 表示ATP生物荧光增幅法检测结果为阳性,即微生物样品RLU值与培养基空白RLU值的比值大于3;3), + 表示菌株培养液浑浊㊀㊀样品影响测试结果显示,培养基空白的荧光信号值在167~285RLU,远低于检测方法要求的1000 RLU,产品样品的荧光信号值在87~199RLU,符合低于3倍培养基空白信号值的要求,且经涂布平板培养后确认化妆品样品中未见微生物污染;同时,ATP 对照㊁微生物对照㊁ATP样品和微生物样品的荧光信号值均大于3倍培养基空白的信号值,且测试产品的ATP回收率区间为73.8%~106.8%,均高于25%的推荐值,表明6种产品均通过了样品影响测试㊂此外,接种控制菌株的微生物样品ATP生物荧光增幅法检测结果均为阳性,未接菌产品样品的检测结果均为阴性,表明6种产品均通过了接菌试验㊂综合分析培养基促生长测试㊁样品影响测试和接菌试验的结果,表明ATP生物荧光增幅法具有良好专属性㊂2.2㊀检测限ATP生物荧光增幅法和‘规范“中标准方法对3株控制菌株的检测结果见表2和表3㊂对于大肠埃希氏菌(E.coli)CICC10389,当污染浓度为10CFU/g 时,标准方法与ATP生物荧光增幅法对6种产品均有5次阳性检出,检出率均为100%;当污染浓度为1 CFU/g时,标准方法对部分产品存在阳性检出,整体检出率为26.7%,ATP生物荧光增幅法对6种产品均有5次阳性检出,检出率为100%;当污染浓度为0.1CFU/g时,标准方法对6种产品均无阳性检出, ATP生物荧光增幅法对沐浴液㊁护发素和面霜有阳性检出,检出率为10%㊂综合比较2种方法对3个浓度6种人工污染产品的大肠埃希氏菌检测结果,标准方法在90次检测中得到38次阳性检出,检出率为42.2%,LOD50为1.05CFU/g,ATP生物荧光增幅法在90次检测中得到63次阳性检出,检出率为70%,LOD50为0.20CFU/g;经Fisher exact test统计分析,ATP生物荧光增幅法显著优于标准方法(P=0.0003)㊂表2㊀检测限检测结果Table2㊀Limit of detection(LOD)test results产品洗发水沐浴液护发素定型水面霜面膜接种浓度/(CFU㊃g-1)1010.11010.11010.11010.11010.11010.1 E.coliCSTSC1)53)00510500540510520ATP22)550551551550551550 P.aeruginosaCSTSC551540531540550541ATP551550542552542551 S.aureusCSTSC200100530530551553ATP550553550552551553㊀㊀注:1)CSTSC,‘化妆品安全技术规范“(2015版)标准方法;2)ATP 表示ATP生物荧光增幅法检测结果;3)表示5次重复试验中阳性结果数量(表3㊁表4同)表3㊀检测限检测结果统计分析Table3㊀Statistical analysis of LOD test results菌株检测方法P值LOD50/(CFU㊃g-1)E.coli CSTSC11)0.0003 1.05ATP2)0.20P.aeruginosa CSTSC0.01760.62ATP0.35S.aureus CSTSC0.0001 3.98ATP0.14对于铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)CICC10419,当污染浓度为10CFU/g时,标准方法与ATP生物荧光增幅法对6种产品均有5次阳性检出,检出率均为100%;当污染浓度为1CFU/g时,30次检测中,标准方法得到25次阳性检出,检出率为83.3%,ATP生物荧光增幅法得到28次阳性检出,检出率为93.3%;当污染浓度为0.1CFU/g时,标准方法对洗发水㊁护发素和面膜3种产品各有1次阳性检出,检出率为10%,ATP生物荧光增幅法仅对沐浴液无阳性检出,6种产品检出率为26.7%㊂综合比较2种方法对3个浓度6种人工污染产品的铜绿假单胞菌检测结果,标准方法在90次检测中得到58次阳性检出,检出率为64.4%,LOD50为0.62CFU/g,ATP生物荧光增幅法在90次检测中得到66次阳性检出,检出率为73.3%,LOD50为0.35CFU/g;经Fisher exact test统计分析,ATP生物荧光增幅法显著优于标准方法(P=0.0176)㊂对于金黄色葡萄球菌(S.aureus)CICC10384,当污染浓度为10CFU/g时,30次检测中,标准方法得到23次阳性检出,检出率均为76.7%;ATP生物荧光增幅法全部阳性检出,检出率为100%;当污染浓度为1CFU/g时,标准方法对部分产品存在阳性检出,检出率为53.3%,ATP生物荧光增幅法对6种产品均有5次阳性检出,检出率为100%;当污染浓度为0.1CFU/g时,标准方法仅对面霜和面膜存在阳性检出,检出率为13.3%,ATP生物荧光增幅法对4种产品有9次阳性检出,检出率为30%㊂综合比较2种方法对3个浓度6种人工污染产品的金黄色葡萄球菌检测结果,标准方法在90次检测中得到43次阳性检出,检出率为47.8%,LOD50为3.98CFU/g,ATP 生物荧光增幅法在90次检测中得到69次阳性检出,检出率为76.7%,LOD50为0.14CFU/g;经Fisher ex-act test统计分析,ATP生物荧光增幅法显著优于标准方法(P=0.0176)㊂统计结果显示,ATP生物荧光增幅法对大肠埃希氏菌㊁铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的检测结果与标准方法检测结果相比均存在显著性差异(P< 0.05),表明ATP生物荧光增幅法在进行耐热大肠菌群㊁铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌检验时的检测限均优于标准方法㊂同时,进一步分析2种方法在低浓度污染下的检测结果,当污染浓度为1CFU/g时, ATP生物荧光增幅法对大肠埃希氏菌㊁铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的检出率分别为100%㊁93.3%和100%,等于或大于标准方法的检出率;且该方法LOD50分别为0.20㊁0.35和0.14CFU/g,均远小于标准方法的LOD50,表明ATP生物荧光增幅法灵敏度高,在低浓度污染下检出效果更好㊂ATP生物荧光增幅法的高灵敏度与方法所用培养基的中和体系密不可分㊂化妆品中一般富含适宜于微生物生长和繁殖的营养成分,为预防生产和使用过程中发生微生物污染,化妆品生产过程中通常会额外添加限定剂量的防腐剂或其他抑菌物质[16-18]㊂㊀㊀本方法建立过程中,对方法的中和效果进行了重点关注,结合现有化妆品防腐体系特点,在MTAT富集培养基中使用含量为4.5%的卵磷脂和吐温80[19-20]等中和剂,可有效消除所选化妆品产品的抑菌作用,更加真实反映产品中微生物的污染情况,保证检验结果的可靠性㊂2.3㊀重现性重现性检测结果显示(表4),3家不同实验室使用2种方法对同一护发素污染样品的金黄色葡萄球菌阳性检出结果均相同,经Fisher exact test统计分析,检测结果无统计学差异(P>0.05),表明ATP生物荧光增幅法具有良好的重现性㊂表4㊀ATP生物荧光增幅法重现性试验结果Table4㊀Reproducibility test results of amplificationATP biofluorescence method菌株检测方法检测结果实验室1实验室2实验室3P值S.aureusCSTSC1)53)55 1.000ATP2)555 1.000 2.4㊀耐用性课题组在前期方法建立过程中已证明上样量㊁培养温度等参数有小的刻意变化时,ATP生物荧光增幅法检测结果不受影响㊂本研究以对该方法检测结果同样具有重要影响的MTAT培养基为耐用性试验对象,结果显示(表5),3种不同品牌TAT肉汤配制的MTAT富集培养基空白荧光信号值均远小于1000 RLU,满足ATP生物荧光增幅法检测的要求;3种MTAT培养基接种金黄色葡萄球菌(S.aureus)CICC 10384富集培养,ATP生物荧光增幅法检测结果均为阳性㊂表明该方法具有良好的耐用性㊂表5㊀ATP生物荧光增幅法耐用性试验结果Table5㊀Durability test results of amplificationATP biofluorescence method菌株培养基品牌培养基空白荧光信号值产品样品荧光信号值比值(接种样品RLU/)培养基空白RLU)检测结果S.aureus1163224613496.93P1)2172228581395.34P3224327446428.57P ㊀㊀注:1) P 表示ATP生物荧光增幅法检测结果为阳性,即样品RLU值与培养基空白RLU值的比值>3ATP生物荧光增幅法专属性㊁重现性和耐用性良好,灵敏度更高,检出效果显著优于标准方法,团队前期研究结果表明该方法可用于化妆品中菌落总数㊁霉菌和酵母菌的检验;本研究结果进一步证明该方法在化妆品控制菌检验方面与标准方法具有部分等效性;这对于实现使用一种快速筛选方法同时进行‘化妆品安全技术规范“(2015版)中要求的多种微生物检验,提高检测效率,缩短检测周期,加快产品放行,节省企业库存成本,满足新形势下化妆品电商快速流通需求具有重要理论指导意义㊂3㊀结论本研究从专属性㊁检测限㊁重现性和耐用性4个参数上证明ATP生物荧光增幅法与‘规范“中耐热大肠菌群㊁铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌标准检验方法具有部分等效性,结合本课题组前期研究成果,该方法可实现‘规范“中各类微生物指标48h同步筛查㊂参考文献[1]㊀LUCA M,BOLFONI M,BILZON V,et al.Preliminary evidence of amolecular detection method to analyze bacterial DNA as a quality in-dicator in cosmetics[J].Cosmetics,2020,7(3):54.[2]㊀文霞,杨秀茳,谢小保.化妆品微生物检测技术的研究进展[J].日用化学工业,2015,45(2):110-114.WEN X,YANG X J,XIE X B.Progress of microbiological detection technology of cosmetics[J].China Surfactant Detergent&Cosmet-ics,2015,45(2):110-114.[3]㊀文霞,李彩玲,刘静霞,等.化妆品中耐热大肠菌群快速检测方法的研究[J].日用化学工业,2019,49(6):410-414.WEN X,LI C L,LIU J X,et al.Research on rapid detection method of thermotolerant coliforms in cosmetics[J].China Surfactant Deter-gent&Cosmetics,2019,49(6):410-414.[4]㊀高飞,白东亭,黄杰,等.化妆品中金黄色葡萄球菌的PCR快速检测[J].环境与健康杂志,2016(33):814-816.GAO F,BAI D T,HUANG J,et al.Rapid detection of Staphylococcus aureus in cosmetics by PCR[J].Journal of Environment and Health, 2016(33):814-816.[5]㊀仝微微,鲍其泠,罗利,等.ATP检测方法在化妆品微生物检测中的应用研究[C].第三届全国香料香精化妆品专题学术论坛, 2013:194-198.TONG W W,BAO Q L,LUO L,et al.The application research of ATP rapid microbial testing in cosmetics[C].The3rd National Sym-posium on Fragrance and Flavor Cosmetics,2013:194-198. [6]㊀SPAETH S,TRAN Q,LIU Z.Evaluation of an ATP-Bioluminescencerapid microbial screening method for in-process biologics[J].PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology,2018,72(6): 574-583.[7]㊀LIEBERS V,BACHMANN D,FRANKE G,et al.Determination ofATP-activity as a useful tool for monitoring microbial load in aqueous humidifier samples[J].International Journal of Hygiene and Envi-ronmental Health,2015,218:246-253.[8]㊀魏树源,杨京生,陈晓琦,等.三磷酸腺苷生物发光快速微生物检测法在疫苗中间无菌试验中的应用[J].中国生物制品学杂志,2010,23(10):1120-1124.WEI S Y,YANG J S,CHEN X Q,et al.Application of rapid deter-mination of microorganisms by ATP bioluminescence assay to sterilitytest of intermediate product of vaccine[J].Chinese Journal of Bio-logicals,2010,23(10):1120-1124.[9]㊀翟磊,葛媛媛,洪海军,等.ATP生物荧光增幅法在微生物检测中的可行性研究 应用于化妆品领域[J].食品与发酵工业, 2020,46(21):201-206.ZHAI L,GE Y Y,HONG H J,et al.Feasibility study on the ampli-fied ATP bioluminescence assay in microbial detection-Application in cosmetics field[J].Food and Fermentation Industries,2020,46(21):201-206.[10]㊀国家食品药品监督管理总局.‘化妆品安全技术规范“(2015版)[S].2015.National Medical Products Administration. Safety and TechnicalStandards for Cosmetics (2015)[S].2015.[11]㊀翟磊,葛媛媛,崔生辉,等.ATP生物荧光增幅法在化妆品微生物检测中的验证研究[J].日用化学工业,2020,50(11):771-775;782.ZHAI L,GE Y Y,CUI S H,et al.Validation study of amplifiedATP bioluminescence assay for microbial detection in cosmetics[J].China Surfactant Detergent&Cosmetics,2020,50(11):771-775;782.[12]㊀陈文胜,谭慧嘉,罗建波,等.化妆品中金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检测能力验证实施研究[J].中国卫生检验杂志,2013,23(2):366-369.CHEN W S,TAN H J,LUO J B,et al.Proficiency testing of Staphy-lococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa detection in cosmetics[J].Chinese Journal of Health Laboratory Technology,2013,23(2):366-369.[13]㊀国家药典委员会.中华人民共和国药典(第四卷)[S].北京:中国医学科学出版社,2020.Chinese Pharmacopoeia Commission.Chinese Pharmacopoeia(Thefourth volume)[S].Beijing:China Medical Science,2020. [14]㊀中华人民共和国国家质量监督检验检疫局,中国国家标准化管理委员会.GB/T18670 2017化妆品分类[S].北京:中国标准出版社,2017.State Administration of Quality Supervision,Inspection and Quaran-tine of the People s Republic of China,China National Standardi-zation Administration Committee.GB/T18670 2017Cosmeticclassification[S].Beijing:China Standards Press,2017. [15]㊀葛媛媛,张奇,冯慧军,等.‘化妆品安全技术规范“耐热大肠菌群检验方法中目标菌的研究[J].日用化学品科学,2017,40(4):1-6.GE Y Y,ZHANG Q,FENG H J,et al.Research on the target bacte-ria for thermotolerant coliform test method in China safety andtechnical standards for cosmetice(2015) [J].Detergent&Cos-metics,2017,40(4):1-6.[16]㊀朱丽华.婴幼儿化妆品防腐体系有效性㊁稳定性及安全性评价[D].上海:上海交通大学,2010.ZHU L H.The effectivity,stability and safety of baby cosmeticspreservative system[D].Shanghai:Shanghai Jiao Tong University,2010.[17]㊀方碧娟.化妆品用防腐剂的复配及其防腐效果评价[D].上海:上海应用技术大学,2016.FANG B J.The praparation and efficacy of a mixture preservation incosmetics[D].Shanghai:Shanghai Institute of Technology,2016.[18]㊀谢小保,杨秀茳,孙廷丽,等.化妆品微生物检验影响因素的探讨[J].日用化学工业,2014,44(11):628-630;634.WIE X B,YANG X J,SUN T L,et al.Study on affecting factors ofmicrobiological inspection of cosmetics[J].China Surfactant Deter-gent&Cosmetics,2014,44(11):628-630;634. [19]㊀高飞,张庆生,崔生辉,等.卵磷脂和吐温80中和化妆品中防腐剂及影响细菌生长研究[J].环境与健康杂志,2012,29(11):1023-1025.GAO F,ZHANG Q S,CUI S H,et al.Research on iecithin andtween80neutralizing preservatives in cosmetics and affecting bacte-ria growth[J].Journal of Environment and Health,2012,29(11):1023-1025.[20]㊀郑萍,孙宗科,丁培,等.中和剂对化妆品中霉菌和酵母菌检测结果的影响[J].环境与健康杂志,2015,32(3):249-251.ZHENG P,SUN Z K,DING P,et al.Effects of neutralizers on testresults of molds and yeasts in cosmetics[J].Journal of Environmentand Health,2015,32(3):249-251.Validation study on amplified ATP bioluminescence assay in the detection of control bacteria Application in cosmetics fieldLIU Ruina1,SUN Sijia1,GE Yuanyuan1,LIU Jiquan2,HONG Haijun3,CUI Shenghui4,LIU Yiru1,ZHAI Lei1,LIN Yafang5,SHEN Ying3,CHEN Yiwen4,LIU Ji6,LI Ting1,YAO Su1∗1(China National Research Institute of Food&Fermentation Industries Co.Ltd.,Beijing100015,China) 2(Procter&Gamble International Operations,Singapore,138547)3(Unilever(China)Limited,Shanghai200335,China)4(National Institutes for Food and Drug Control,Beijing100050,China)5(Procter&Gamble Technologies(Beijing)Ltd.,Beijing101312,China)6(Charles River Microbial Solutions(Shanghai)Co.Ltd.,Shanghai201708,China)ABSTRACT㊀According to the verification requirements of qualitative test methods in the guiding principles for validation of alternative methods for microbiological testing in Chinese Pharmacopoeia(2020),six kinds of cosmetics,including cleanser,care cosmetics and makeup categories,were selected to conduct the partial equivalence study between amplified ATP bioluminescence assay and the standard detection method for the detection of thermotolerant coliform bacteria,Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa in Safety and Technical Standards for Cosmetics(2015)in terms of specificity,detection limit,reproducibility and durability.The results showed that the amplified ATP bioluminescence assay had good specificity and durability.The LOD50of the representative strains of the three control bacteria detected by this method were0.20,0.35and0.14CFU/g,respectively.According to the statistical analysis of Fisher exact test,the detection limit of the amplified ATP bioluminescence assay was significantly better than that of the corresponding standard method (P<0.05).There was no significant difference in the detection results of the same artificially contaminated samples by these two methods in three different laboratories(P>0.05),indicating that the amplified ATP bioluminescence assay had good reproducibility.In general, the amplified ATP bioluminescence assay is partially equivalent to the standard methods for the detection of thermotolerant coliform bacteri-a,Staphylococcus aureus and P.aeruginosa in Safety and Technical Standards for Cosmetics(2015),which can realize the simultaneous detection of various microorganisms in cosmetics within48h.Key words㊀amplified ATP bioluminescence assay;cosmetics;control bacteria;thermotolerant coliform bacteria;Staphylococcus aureus; Pseudomonas aeruginosa。

atp生物发光法的应用
ATP生物发光法是一种用于检测生物体内ATP含量的技术，其应用广泛，包括但不限于以下几个方面：
1. 微生物检测：ATP生物发光法可以用于检测食品、医疗和废水处理等行业的微生物数量。

其原理是在有氧环境中，荧光素在荧光素酶催化和ATP作用下生成氧化荧光素，氧化荧光素发出光子，光子数量可换算成ATP的量。

2. 食品工业：ATP生物发光法可被用于检测肉类食品中细菌污染情况。

研究表明，这种方法与标准的细菌培养菌落计数法相比，具有良好的相关性。

此外，ATP生物发光法还可用于乳制品中乳酸菌的测定、啤酒中菌落总数测定、调味品及脱水蔬菜的细菌学测定等。

3. 环保行业：ATP生物发光法也可被用于废水处理过程中的微生物检测，以监测和优化废水处理的效果。

4. 医疗领域：ATP生物发光法可以用于检测和监测医疗环境中的微生物，如手术室、ICU病房等，以确保患者安全。

总的来说，ATP生物发光法是一种快速、准确、非破坏性的检测方法，可用于各种需要检测微生物含量的场合。

1。

ATP生物发光法在微生物检验中的应用研究摘要：在社会现代化发展中人们关注微生物污染，ATP上发光法基于各项理论和技术在实践中有较广的应用范围，此种研究方法通过实践不断完善，在具体检测中具有明显的优势。

本次首先分析食品检验中现代生物技术的重要性，基于生物发光法理论进行概述，然后针对具体应用研究进行介绍，希望后续发展可以以此为基础。

关键词：ATP生物发光法；微生物检验；应用研究一、现在生物技术在食品检验中的重要性分析在对食品进行安全检验时，如果品质较高，可以保证食品提供的安全，在我国社会近几年的发展中对食品安全问题关注力度比较大，当前提出了各种现代化生物理论，在各种理论指导下现代生物技术广泛应用，运用领域逐渐扩展。

同时，社会现代化发展中各项生物技术实现创新研发，在实际检验中以精准测试为基础，同时保证实验检测的安全环保性，目前生物技术应用在食品安全检验中比较适用。

现代社会利用传统生物或者是食品检验技术不能保证食品的安全性，由此可以深刻认识到现代生物技术的发展需要。

基于此本次研究主要是针对ATP生物发光法在微生物检验中的具体应用。

二、生物发光法基本概述（一）应用原理ATP生物发光法就是三磷酸腺苷生物发光法，在具体应用中，主要是通过荧光光束酶与mg2+的相互作用，依次是三磷酸腺苷得到活化，在产生荧光素后与酶相互结合，形成复合体后会释放焦磷酸。

在整体结构氧化后会逐渐形成复合物，此时会导致二氧化碳被释放，在复合物激发状态下达到返回状态实现发光，此时会形成氧化荧光素。

（二）优缺点分析ATP生物发光法在使用中操作比较简便，而且实际应用中速率非常快，检验过程中对各种物质具有足够的灵敏度，从上个世纪三磷酸腺苷生物发光法检验范围已经实现较大扩展，在实际检测过程中几分钟就可以获取结果，而且根据目前所知的微生物检测来看，其检测数量最快。

分析其缺点主要是不能就微生物和非微生物进行有效判别，如果检验中存在特异性分布的微生物不能有效区分种类，同样在利用三磷酸腺苷生物发光法检测时，受样品或提取物影响会产生离子干扰，此时可能影响检测结果测定，在检验中影响发光作用，不能直接了解样品的特异性条件。

ATP生物发光原理及应用研究ATP生物发光是一种快速的微生物检测方法,具有灵敏、快速、简便、稳定等优点,本文就其原理、特点及在食品卫生、医药中的应用进行了综述。

[Abstract] As a fast detecting method of microorganism, ATP bioluminescence has the advantages of sensitivity, high-speed, convenience and stability and so on. The article summarizes its principles, characteristics and application to food hygiene and medicine.[Key words] ATP; Application; Bioluminescent theory生物发光(bioluminescence)在希腊语中表示活着的意思,在拉丁语中表示发光、发亮。

目前生物发光,应用最广最主要的是荧光素-荧光素酶反应发出的荧光,荧光素酶存在于萤火虫、水母和一些细菌中,它是生物体内产生的一种生物反应蛋白质[1]。

三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,简称ATP)是高能磷酸化合物。

ATP由一分子腺嘌呤、一分子核糖和三个相连的磷酸基团构成的核苷酸,其结构式见图1。

图1 三磷酸腺苷的结构式Fig.1 Adenosine triphosphateATP存在于所有的有机体中,极易被储存和利用,是活细胞新陈代谢能量的源泉,在化学反应中,主要是通过释放磷酸基团从而达到释放能量的目的。

1 ATP生物发光工作原理1963年McElroy[2]最先用荧光素酶-ATP检测法,其化学反应的结果是把化学能转化为光能。

1983年Moyer等提出细胞内源性的ATP含量可以反应活细胞的数量和活性。

其化学反应如下:ATP+D-Luciferin+O2→Oxyluciferin+AMP+PPi+O2+Light当细胞受损或死亡时,其ATP值迅速下降或消失,基于这一原理,检测细胞内的ATP含量,即可反应其细胞的存活状况,ATP浓度与活细胞数密切相关,ATP生物发光检测步骤包括:取样、样品ATP的提取、添加荧光素-荧光素酶、测定生物发光值、计算出ATP的浓度和活菌数量。

ATP荧光法在卫生领域的应用及局限性摘要：ATP荧光快速检测微生物的方法有传统平皿法不可比拟的优势，即使该方法目前没有取代平皿法成为细菌检测的国家标准方法。

从ATP生物发光法原理、荧光试剂活力和检测仪器类型3个方面详尽分析了该方法的优势和局限性，并总结了ATP荧光法在不同行业的实际应用情况，为该方法在国内的普及应用提供参考。

关键词：ATP荧光法;ATP生物发光法原理;荧光试剂活力;检测仪器;微生物检测;国标法Keyword：ATPfluorecence;ATPbiluminecencemethodmechanim;fluorecentactivity;intrument;microbialdetection;nationaltandardmethodATP荧光快速检测细菌总数的方法近些年被广泛应用在各个行业。

国内有些乳品厂的品控部门已经将该法作为奶站原料奶收集的判断标准;应用该方法的物表检测试剂也在各个卫生监督部门广泛使用，大大提高了餐饮等卫生行业监督的效率[1-3]。

但该方法目前仍没有取代平皿法写入国家标准方法中，而且也没有统一的行业标准，只有个别内部根据实际情况或部分市县局卫生监督部门根据各自地区的卫生情况自行设定的检测标准[4]。

目前，一些省市级卫生监督部门已经采购了荧光试剂和配套的荧光检测仪。

在日常工作中相关卫生部门通常会采用该方法在大型群體活动中使用，比如在省市的运动会中对餐饮具的卫生实时监控，不仅保障了食品卫生的安全，而且一旦出现细菌总数超标的情况，可以第一时间排查细菌的污染源头。

但因没有国家标准，很难根据检查的结果进行相应的判罚，所以卫生监管部门一般只在应急活动中使用。

而荧光法在欧美等国家的应用较国内则更为普遍，因该方法可以实时快速地提供半定量的结果，使许多食品将此方法作为企业内部的质控标准，大大提高了工作效率，保障了产品的卫生质量。

不仅如此，因价格相对便宜、操作简单，普通百姓也将此方法应用在日常生活中。

ATP生物发光技术在食品工程中的应用研究作为一种快速检测微生物的新兴技术，ATP生物发光法具有灵敏度高、快捷的特点，被广泛应用于食品工业中。

本文分析了ATP的发光原理与特点，并探究了其在食品工程中的具体应用。

在食品生产、销售以及存储等过程中，均需要通过微生物检验来严格控制食品质量，这是食品行业的重要管理内容。

关于微生物快速检验的方法较多，如酶联免疫法、PCR技术等。

这些检测技术大多采用琼脂平板进行微生物培养，可靠程度较高。

但采用这种微生物培养方式，存在耗时较长的缺陷，一般需要培养两至三天，因此检验结果也相对滞后。

在食品平安与卫生监测工作中，要想解决检验结果滞后的问题，就需要找到更加便捷、准确地检验食品质量的方法。

而ATP生物发光法的灵敏度高，且操作简便，因此被广泛应用于食品工业中。

1.1 ATP的生物发光原理ATP在所有活体生物中均可提取出来，主要发挥着在生物体中传递化学能并存储的作用。

假设生物体凋亡，那么ATP在细胞内各种酶的作用下会很快被分解。

因此，对生物体中的ATP浓度进行测定，就可以估算出活体细胞数目。

ATP具备生物发光的机理，最早发现于1949年。

Moyer等于1983年提出ATP可以反映活体细胞数量以及生物活性[1]。

ATP能够通过生物发光实验发光，依赖于试剂中的萤火虫荧光素酶。

荧光素酶在镁离子的作用下，可以与ATP发生反响，之后活化的荧光素酶能够结合荧光素，产生相应的荧光素复合体，并释放出光量子。

这些复合体在氢氧化后可以生成发射光，最终产生氧化虫荧光素。

研究说明[2]，荧光素酶的适宜酸碱度在7.5左右，并且可以和作用底物ATP反响，而ATP具有呈现S形的酶促动力学。

荧光素酶的反响速率与底物浓度有一定的关系，即ATP浓度越高反响速率就越快，同时在检测过程中也可以获得更高的荧光素强度。

在ATP保持较低浓度范围时，其与荧光素酶的反响速度呈现一级关系。

而活体微生物在某个生物期内，其ATP的含量是较为稳定的，这样就可以绘制出生物体中ATP的线性图。

ATP生物荧光法快速检测化妆品中菌落总数的研究张浩【摘要】In order to rapidly determine the total number of colonies in cosmetics,the ATP bioluminescence method and its principle were introduced in this paper.Based on ATP bioluminescence,a rapid determination method for the total viable count was established and then this method was applied to the experiments of CTFA (Cosmetic Toiletry and Fragrance Association).Compared with the colony counting method,the results showed that this new method could be applied to the rapid test of the total number of colonies in cosmetic samples.%本文从快速检测的必要性出发,介绍了ATP生物荧光法及其原理,并针对某款化妆品通过一系列实验建立了一种快速检测菌落总数的方法.将该方法用于CTFA(美国化妆品香料香精协会,Cosmetic Toiletry and Fragrance Association)实验中,并通过与平板计数法结果进行比对,发现该方法可以有效的运用于样品细菌总数的快速检测.【期刊名称】《工业微生物》【年(卷),期】2017(047)005【总页数】4页(P53-56)【关键词】ATP生物荧光法;化妆品;菌落总数【作者】张浩【作者单位】陕西华润实业公司,陕西西安710003【正文语种】中文近年来，化妆品在“回归自然”和提高功效的热潮中，许多产品中添加了从动、植物提取的营养成分，而化妆品中含有的脂肪、蛋白质、氨基酸、维生素、胎盘液、无机盐等营养成分再加上水分，为霉菌、细菌等微生物的滋生、繁殖提供了良好的生长环境[1]。

ATP 行业应用 -- 乳品/肉/啤酒© 3M 2009. All Rights Reserved.要 点ATP的作用与价值 正确的应用（清洗后） 检测哪里 限量 如何操作仪器和采样棒 仪器、采样棒使用注意事项3M PetrifilmTM 测试片23M CleanClean-Trace™ ATP荧光检测仪的应用 ATP荧光检测仪的应用3M PetrifilmTM 测试片33M CleanClean-Trace™ ATP荧光检测仪的应用 ATP荧光检测仪的应用3M PetrifilmTM 测试片43M Clean-Trace™ ATP荧光检测的意义-清洁管理3M PetrifilmTM 测试片5检测点所有食品接触面 洁净区（ 洁净区（热杀菌 – 包装） 包装）邻近环节表面3M PetrifilmTM 测试片6冰品3M PetrifilmTM 测试片7Yili ATP检测点与限量3M PetrifilmTM 测试片序 号 1 2 老化罐内壁检测点合格限值 （RLU） 10 20预警限值 （RLU） 11-19 21-39不合格 限值 （RLU） 20 40过料弯头内壁、车间下料管三通、凝动机 出口、插筷小车 插筷小车U型槽 灌料小车内壁、灌料小车搅拌叶、灌料小 车出料口、吸浆管、巧克力槽内壁 模具内壁 机械手、 机械手、落料板、 落料板、拨料头、包装机台面、 拨料头 横送料板、接料筐内壁、巧 包装机链条、横送料板 横送料板 克力循环槽搅拌、加豆小车内壁 操作工手3 435 6036-69 61-11970 12058586-1691706200201-3994008酸奶3M PetrifilmTM 测试片• 发酵罐、辅料罐内壁 • 灌装口 • 各管道出口9• CIP清洗水液 奶3M PetrifilmTM 测试片10肉品加工3M PetrifilmTM 测试片生区熟区11操作台面、 操作台面、台秤、 台秤、食品筐采样3M PetrifilmTM 测试片10cm × 10 cm面积的表面12修肉刀、 修肉刀、剪刀采样3M PetrifilmTM 测试片涂抹其中一侧的整个刀面打开剪刀， 打开剪刀，选择一侧， 选择一侧，涂抹整个内表面13手部采样3M PetrifilmTM 测试片折皱处加强涂抹14ATP检测点与推荐限量检测点 人手 台秤 熟区 食品筐 剪刀 操作台 人手 生区 修肉刀 操作台 其它加工设备表面 合格值 200 150 150 150 150 500 500 500 500 警惕值 201-399 151-299 151-299 151-299 151-299 501-999 501-999 501-999 501-9993M PetrifilmTM 测试片不合格值 400 300 300 300 300 1000 1000 1000 100015啤酒3M PetrifilmTM 测试片163M PetrifilmTM 测试片罐– 门, 出口，取样口173M PetrifilmTM 测试片灌装– 灌注头，灌注管壁，贮液器，O型圈，挡板和邻近表面等18啤 酒3M PetrifilmTM 测试片19限量洁净区/熟区/包装/管道/罐/CIP 150 151-299 300 手 2003M PetrifilmTM 测试片201-399 400直接推荐上述限量，客户可在此基础上根据实际调节。