烟草青枯病菌分离株rsxj-1的培养性状及其生物型鉴定

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烟草青枯病菌土壤拮抗细菌的筛选及鉴定

烟草青枯病菌土壤拮抗细菌的筛选及鉴定作者：陆铮铮蒋选利来源：《江苏农业科学》2014年第06期摘要：为筛选出烟草青枯病菌的拮抗细菌，从贵州省天柱县、黄平县及大方县烟草根围土壤中共分离出65株细菌。

采用平板喷雾法筛选获得20株拮抗细菌，且抑制效果稳定，其中有2株拮抗细菌平均抑菌圈直径大于20 mm，分别为C3-5（39.98 mm）和C5-3（48.88 mm）。

采用16S rDNA序列分析以及形态特征、培养性状、染色结果等方法进行鉴定，结果显示，C3-5为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），C5-3为球形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sphaericu）。

关键词：烟草青枯病；拮抗细菌；生物防治；筛选；鉴定；蜡样芽孢杆菌；球形赖氨酸芽孢杆菌中图分类号： S435.72文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0099-03收稿日期：2013-09-22基金项目：中国烟草总公司贵州省公司科技项目（编号：200917）；贵州铜仁地区烟草公司项目[编号：贵铜烟（2009）10]。

作者简介：陆铮铮（1986—），女，硕士，助教，研究方向为植物病害生物防治。

E-mail：luzheng_zheng@。

通信作者：蒋选利，教授，博士生导师，研究方向为分子植物病理学。

E-mail：jxl3237@。

青枯病病原菌原名为茄假单胞杆菌（Pseudomonas solanacearum E. F. Smith），1995年更改为茄劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum E. F. Smith）[1]。

烟草青枯病是一种典型的维管束细菌性土传病害，最显著的症状是枯萎。

该病害广泛分布于热带、亚热带等50多个国家和地区，在我国南方普遍存在且危害严重，它具有发病快、危害重、损失大等特点，且常与黑胫病和空茎病混合发生[2]，给防治带来了较大的困难。

目前，对于烟草青枯病的防治还是以化学防治为主，近几年研究者们筛选出了许多对烟草青枯病有较好抑制效果的药剂，如30.2%芽敌水剂[3]、72%农用硫酸链霉素[4]以及1 B°石硫合剂[5]等药剂。

重庆地区烟草青枯病菌的生物型测定

黔江水田乡石郎村
黔江五里乡甘溪村黔江五里乡海洋村黔江县大石坝乡
酉阳县钟南镇酉阳县黑水乡苏家
武隆县 Hy2311 武隆县黄莺乡武隆县仙女山镇石果子村
1. 2 鞭毛染色制备染剂甲液和乙液 ,备干净光滑无痕纹的
载玻片 ,用新制备的斜面培养基接种菌种 , 16 ～ 24h后进行鞭毛染色并镜检 [ 9 ] 。 1. 3 致病性的测定 1. 3. 1 菌种制备
3 小结
菌株对烟草品种云烟 85 均有致病作用 ,其中 11 个菌株在较短的时间内使烟苗致病并死亡 ,这 11 个致病力较强的菌株均来自黔江烟区 ,说明黔江烟区的青枯病菌具有较强的致病力 ,此结果尚需进一步试验验证。
(2)根据青枯菌对 3种糖和 3种醇的利用能力和对硝酸盐还原和产气能力 ,供试烟草青枯病菌株均为生物型 Ⅲ,没有亚型的出现 ,说明重庆烟区烟草青枯菌生物型较为单一 ,变异不大。
黔江水田乡大塘村
5 - 20 - 1, 5 - 6 - 1, 5 - 6 - 3, 5 - 7 - 1, 5 - 7 - 2, 5 - 8 - 1, 5 - 8 - 2, 5 - 9 - 1, 5 - 10 - 1 5 - 13 - 1 5 - 19 - 1 6 - 2 - 1, 6 - 2 - 2, 6 - 2 - 3, 6 - 2 - 4 6 - 4 - 1, 6 - 4 - 2 5 - 14 - 1, 5 - 17 - 1 5 - 23 - 1 6 - 1 - 1, 6 - 1 - 2, 6 - 1 - 3, 6 - 1 - 4, 6 - 1 - 5, 6 - 1 - 6, 6 - 1 - 7, 5 - 21 - 1
(3)青枯菌生物型的划分 : 根据 Harward[ 10 ] 和何礼远 [ 11 ] 制定的标准 (表 2 ) 确定菌株的生物型。

烟草青枯病抗性育种研究进展

烟草青枯病抗性育种研究进展一、内容概括烟草青枯病是影响烟草生长和产量的重要病害之一，其抗性育种研究一直是烟草科学领域的热点之一。

本文主要介绍了近年来关于烟草青枯病抗性育种研究的进展情况。

首先我们介绍了烟草青枯病的发病机制和危害情况，以及目前已有的抗性鉴定方法和筛选技术。

接着我们详细阐述了目前已经研发出的多种抗青枯病基因及其在育种中的应用情况。

我们对未来烟草青枯病抗性育种研究的发展趋势进行了展望。

1. 烟草青枯病的危害及研究现状烟草青枯病，听着就让人头疼。

这种病害一旦发生，就会让烟草植物的健康状况大打折扣，严重的话甚至会导致整片烟草田的收成大幅下滑。

然而尽管我们已经对它有了一定的了解和研究，但要想真正从源头上解决这个问题，还有很长的路要走。

目前的研究现状，虽然已经取得了一些成果，但总体来说还是比较初级的，离我们期待的目标还有很大的差距。

这就需要我们不断探索，不断尝试新的方法和技术，才能让我们的烟草种植更加健康，更加有保障。

2. 抗性育种在烟草生产中的应用价值烟草青枯病是影响烟草生产的重要病害，其抗性基因的发掘和利用对于提高烟草产量、保障农民收入具有重要意义。

抗性育种作为一种重要的育种手段，已经在烟草生产中得到了广泛应用。

通过筛选具有抗青枯病基因的烟草品种，可以有效地降低青枯病的发生率，减少因病害导致的产量损失，从而提高农民的收入。

同时抗性育种还可以帮助培育出适应不同环境条件下的优质烟草品种，满足市场对高品质烟草产品的需求。

因此抗性育种在烟草生产中的应用价值不容忽视，对于推动烟草产业的发展具有重要作用。

3. 本文的研究目的和意义烟草青枯病是一种严重的植物病害，它会导致烟草植株的死亡。

抗性育种是解决这一问题的有效途径之一，本文的研究目的是通过筛选和培育具有抗性的烟草青枯病品种，为农业生产提供有力的支持。

通过本文的研究，我们可以更好地了解烟草青枯病的发病机制和抗性基因的分布规律，为抗性育种提供科学依据。

一株烟草青枯拮抗细菌的筛选、鉴定和培养特性研究

一株烟草青枯拮抗细菌的筛选、鉴定和培养特性研究吴翔;甘炳成;谢丽源;谭昊;黄忠乾;彭卫红;唐杰【摘要】为烟草生物肥料的研制和生产提供优良菌株资源,筛选可有效拮抗烟草青枯病原菌的菌株,优化其培养条件,确定其分类地位.采用抑菌圈测定法从高粱根际土中筛选烟草青枯拮抗菌株,并对其单因素液体拮抗条件进行优化,通过其表型特征、生理生化特征和遗传特征等多相分析来确定其分类地位.获得一株对烟草青枯病原菌具有较好拮抗效果的细菌MT-002-B-7,抑菌圈直径可以达到28.67 mm,该菌的液体最佳发酵条件为以葡萄糖为碳源,以谷氨酸为氮源,装液量10％,培养基初始pH 值为7.0,接种量3％,温度35℃,转速150 r/min,培养25 h.鉴定结果表明该菌为铜绿假单胞菌.该菌株对烟草青枯病原菌拮抗效果良好,可作为研制烟草生物肥料的菌株资源.【期刊名称】《中国土壤与肥料》【年(卷),期】2019(000)002【总页数】8页(P208-215)【关键词】烟草青枯病;拮抗细菌;筛选;鉴定;培养特性【作者】吴翔;甘炳成;谢丽源;谭昊;黄忠乾;彭卫红;唐杰【作者单位】四川省农业科学院土壤肥料研究所,农业农村部西南区域农业微生物资源利用科学观测实验站,农业农村部西南山地农业环境重点实验室,四川成都610066;四川省农业科学院土壤肥料研究所,农业农村部西南区域农业微生物资源利用科学观测实验站,农业农村部西南山地农业环境重点实验室,四川成都 610066;四川省农业科学院土壤肥料研究所,农业农村部西南区域农业微生物资源利用科学观测实验站,农业农村部西南山地农业环境重点实验室,四川成都 610066;四川省农业科学院土壤肥料研究所,农业农村部西南区域农业微生物资源利用科学观测实验站,农业农村部西南山地农业环境重点实验室,四川成都 610066;四川省农业科学院土壤肥料研究所,农业农村部西南区域农业微生物资源利用科学观测实验站,农业农村部西南山地农业环境重点实验室,四川成都 610066;四川省农业科学院土壤肥料研究所,农业农村部西南区域农业微生物资源利用科学观测实验站,农业农村部西南山地农业环境重点实验室,四川成都 610066;四川省农业科学院土壤肥料研究所,农业农村部西南区域农业微生物资源利用科学观测实验站,农业农村部西南山地农业环境重点实验室,四川成都 610066【正文语种】中文青枯病是由青枯劳尔氏菌（Ralstonias olanacearum）引起的细菌性枯萎病，该病原菌可以侵染50多个科近200多种植物［1］，是一种在世界范围内危害大、分布广、造成损失极其严重的植物病害之一。

烟草青枯病生防真菌的分离鉴定与拮抗活性的初步研究

３０Ｆ３和７０Ｆ６的粗提物对烟草青枯病菌的半有效抑制浓度（Ｃ。分别为３１９ｔ／Ｉｓ）６．６ｔｍＬ和１２６ｇ０．７ “ ／用形态学观察结合ＩＤＮＡ序列分析，定其分别为烟曲霉（ｐｒｉｕｕｇ — ｇｍＬ采ＴＳｒ鉴Ａｓｅｇｌｓｍｉａｌｆ
ＭＩＡＯ，ＬｉＤＯＮＧａｗｅ，Ｘｉ— ｉＺＨＯＵａ —ｉｎ，ＮＧ —ｉｇＬＩＹａｇＸｉｏｊａＤＩＢｉｎ，Ｕｎ，ｔ
ＺＨＡｎｙｏ，Ｘｉ — ａＤＯＮＧｎ— ｉｇＫｕｒｎｕ
（ｃｏｌｆＥｎｉｎｅｔｌＳｉｎｅａｄＥｎｉｅｒｎ，ｎｚｏｉｅｓｔ，ｎｚｏ２１７，ｉａＳｈｏｖｒｍｎａｃｅｃｎｇｎｅｉｇＹａｇｈｕＵｎｖｒｉＹａｇｈｕ２５２Ｃｈｎ）ｏｏｙ
河南农业科学，０１４（１：１８２１，０１）８ —５
ＪｕｎｌｆＨａｒｃｌｒｌＳｉｎｅｒａｅｎＡｇｉｕｔａｃｅｃｓｏｏｎｕ
烟草青枯病生防真菌的分离鉴定与拮抗活性的初步研究
ｌｎｅｒｍｒｏｎｈｏｇｈｉｃｄｆｕｉｎａｓｙＴｈｎａｏｉｔｃｉｉｉｓＯｈｘｒｃｓａｃａｗｅｅｆｕｄｔｒｕｈｔｅｄｓｉｆｓｏｓａ．ｅａｔｇｎｓｉａｔｔｅｆｔｅｅｔａｔｃｖｆｏｔｔｏｇａｔｅｆｎａｔａｎ，Ｆ３ａｄ７０，ｒｏｆｒｄｂＩｓａ．ｅｒｓｌｒｍｗｏｓｒｎｃｉｕｇｌｓｒｉｓ３０ｎＦ６ｗｅｅｃｎｉｍｅｙＭＣａｓｙＴｈｅｕｔｖｓ

烟草青枯病抗性遗传效应分析

烟草青枯病抗性遗传效应分析作者：耿锐梅程立锐刘旦张兴伟蒋彩虹冯全福罗成刚陈志强王绍美曹长代张国超杨爱国任民来源：《中国烟草科学》2019年第04期摘要：烟草青枯病是由青枯菌引起的烟草细菌性病害，是危害我国烟草生产的主要病害之一，解析烟草青枯病的抗性遗传效应对指导抗病育种具有重要意义。

本研究采用主基因+多基因混合遗传模型的多世代联合分析方法，以多个抗病/感病样本为亲本，构建了两个不同的杂交组合，进行群体遗传效应分析。

结果表明，岩烟97的青枯病抗性由2对加性、显性、上位性主基因以及加性、显性、上位性多基因控制;反帝三号-丙的青枯病抗性受1对加性-显性基因+加性-显性-上位性多基因控制。

烟草青枯病抗性以加性效应为主，兼有显性效应，有利于等位基因聚合育种及早代选择。

关键词：烟草;青枯病;抗性;主基因+多基因;遗传效应中图分类号：S572.03 文章编号：1007-5119（2019）04-0007-07 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.04.002Genetic Analysis of Resistance to Bacterial Wilt in TobaccoGENGRuimei1，CHENG Lirui1， LIU Dan1， ZHANG Xingwei1， JIANG Caihong1， FENG Quanfu1，LUO Chenggang1，CHEN Zhiqiang1， WANG Shaomei1， CAO Changdai2， ZHANG Guochao3，YANG Aiguo1*， REN Min1*（1. Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences， State Key Laboratory of Tobacco Genetic Improvement and Biotechnology & State Key Laboratory ofTobacco Genetic Breeding in Tobacco Industry， Qingdao266101， China; 2. Rizhao Tobacco Company，Rizhao，Shandong 276826， China; 3.Tobacco Research Institute of Shandong， Jinan 250101，China）Abstract：Tobacco bacterial wilt is a bacterial disease caused by Ralstonia solanacearum，and is one of the main diseases that harm China's tobacco production. Analysis of the resistance genetics of tobacco bacterial wilt has important significance in guiding disease resistance breeding. In this study， a multi-generation combined analysis method of the main gene + multi-gene mixed genetic model was used to construct two different hybrid combination groups for the analysis of population genetic effects with multiple resistance/susceptible materials as parents. The results showed that bacterial wilt resistance of tobacco appeared to be a quantitative trait and the inheritance of Yanyan 97 fit to a mixed genetic model of two major genes with additive-dominance-epistatic effects plus poly-genes with additive-dominance-epistatic effects. The inheritance of Fandi No.3-C fit to a mixed genetic model of one major gene with additive-dominance effects plus poly-genes with additive-dominance-epistatic effects. The results also indicated that tobacco bacterial wilt resistance is dominated by additive effects， which is supplementedby dominance effects， and is conducive to allele aggregation breeding and early generation selection.Keywords：tobacco;bacterial wilt;disease resistance;major-gene plus polygenes;genetic effects烟草青枯病由青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum E.F.Smith）引起，是以土壤传播为主的细菌性病害。

烟草品种青枯病抗性的组培苗接种鉴定方法研究

烟草品种青枯病抗性的组培苗接种鉴定方法研究作者：徐进许景升张昊冯洁顾钢来源：《中国烟草科学》2016年第05期摘要：由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的青枯病是制约我国烟草产业发展的瓶颈之一。

选育抗病品种是防控该病最经济有效的策略。

为探寻快速评价烟草品种青枯病抗性的方法，以6个抗感水平差异显著的烟草品种试管苗为研究对象，采用浸根接种法，评价了室内快速鉴定方法的可行性。

结果显示，以浓度为3×106 cfu/mL的青枯菌体悬液接种21 d后，红花大金元、翠碧1号、云烟85、K326、G80和岩烟97的病情指数分别为100.0、90.5、88.8、86.6、56.0和53.8，各品种试管苗的病情指数与田间自然发病情况呈明显正相关性，相关系数为0.936，达极显著水平。

由此可见，室内无菌苗接种法能正确反映出不同烟草品种对青枯病的抗性水平，可作为快速、可靠评价烟草品种抗性水平的初筛手段。

关键词：烟草品种；青枯病抗性；试管苗中图分类号：S435.72文章编号：1007-5119（2016）05-0051-06DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.05.010Abstract：Granville wilt caused by Ralstonia solanacearum is a major limiting factor in tobacco production in China. The most economically feasible strategy to control the disease is the use of resistant cultivars. In this study， the potential of inoculation of in vitro plantlet as a rapid and reliable method for screening tobacco cultivar against R. solanacearum was investigated. In vitro plantlets of six tobacco cultivars with diverse resistance levels were inoculated with 3×106 cfu/mL cell suspension of R. solanacearum strain Tb2K9-11. Twenty-one days after inoculation， the disease index of cultivar Honghuadajiyuan， Cuibi No.1， Yunyan 85， K326， G80 and Yanyan 97 was 100.0，90.5， 88.8， 86.6， 56.0 and 53.8， respectively. There were significant correlations between in vitro plantlet assay and field trial （r=0.936）. The result showed that the in vitro screening assay can help in improving tobacco breeding efficiency.Keywords：tobacco cultivar；granville wilt resistance；in vitro plantlet植物细菌性青枯病（Bacterial wilt of plants），是由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum Yabuuchi et al.，简称青枯菌）引起的一种世界性重大病害[1]。

一种简易分离烟草青枯病菌的方法[发明专利]

专利名称：一种简易分离烟草青枯病菌的方法
专利类型：发明专利
发明人：卢灿华,刘俊莹,夏振远,马俊红,盖晓彤,莫笑晗,余清申请号：CN201910768914.5
申请日：20190820
公开号：CN110343648A
公开日：
20191018
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开一种简易分离烟草青枯病菌的方法，其特征包括以下步骤：1病样采集；2病原菌分离；3病原菌培养；4菌悬液制备；5PCR扩增与鉴定。

本发明采集田间病叶，切取叶柄处的叶脉维管束，利用叶脉维管束中青枯菌的含量远高于其他微生物这一特点，分离纯化烟草青枯病菌，本发明目标选择性强，纯化速度快，效率高，分离纯化率在84％以上，而且可确保为该病病原菌。

采用本发明，可快捷准确地获得目标病原，为后续研究奠定基础。

一般的科技人员也十分容易掌握本方法。

申请人：云南省烟草农业科学研究院
地址：650000 云南省昆明市五华区圆通街33号
国籍：CN
代理机构：昆明今威专利商标代理有限公司
代理人：刘明哲
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1株抗烟草青枯病菌拮抗菌的筛选及鉴定

1株抗烟草青枯病菌拮抗菌的筛选及鉴定王磊王兴兰郭瑞郜博徐莉*（安徽农业大学生命科学学院，安徽合肥230036）摘要：在黔南烟区烟草青枯病严重发病的田块采集健康烟草根际土壤进行分离、纯化和培养后共获得35株细菌，通过抑菌圈法筛选出2株对烟草青枯病菌具有良好拮抗效果的菌株S3-1和S3-2，抑菌圈直径分别为1.3cm和1.4cm，抗青枯病的模式菌FZB抑菌圈为1.3cm；通过对目标菌株S3-2开展16S rDNA序列测定，并对测序结果开展BLAST比对，初步鉴定出S3-2菌株属于芽孢杆菌属。

关键词：烟草青枯病菌；根际细菌；拮抗菌；分子生物学鉴定中图分类号S435.72文献标识码A文章编号1007-7731（2020）23-0089-02 Screening and Identification of An Antagonistic Bacteria Against Tobacco Bacterial Wilt WANG Lei et al.（School of Life Sciences，Anhui Agricultural University，Hefei230036，China）Abstract：Collecting healthy tobacco rhizosphere soil from fields with severe incidence of tobacco bacterial wilt in Qiannan tobacco area，35strains of bacteria were obtained after isolation，purification，and cultivation.Two strains were screened out with good antagonistic effects against tobacco bacterial wilt by the inhibition zone method.The di⁃ameters of the inhibition zone of the strains S3-1and S3-2are1.3cm and1.4cm，respectively.The inhibition zone of bacterial wilt resistance model FZB is1.3cm.By sequencing the16S rDNA of the target strain S3-2and comparing the sequencing results with BLAST，the strain S3-2was preliminarily identified as bacillus.Key words：Tobacco bacterial wilt；Rhizosphere bacteria；Antagonistic bacteria；Molecular biological identification由青枯雷尔氏菌引起的细菌性土传性病害烟草青枯病危害范围广泛，对我国烟草种植业造成了巨大的经济损失［1］。

一种抗烟草青枯病的烟草内生菌菌株及菌剂[发明专利]

专利名称：一种抗烟草青枯病的烟草内生菌菌株及菌剂
专利类型：发明专利
发明人：奚家勤,冯小虎,尹启生,韩延,宋纪真,袁球,赵涛,王利兵,王信民,高自强,郭建华,周汉平
申请号：CN201210338294.X
申请日：20120914
公开号：CN102851245A
公开日：
20130102
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种抗烟草青枯病的烟草内生菌菌株及菌剂，所用的生防微生物为烟草赖氨酸芽孢杆菌LysinibacillustobaccocumKpa菌株，该菌株2012年05月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.6161。

该微生物通过产生活性物质抑制烟草青枯病菌的生长，且在烟草根际有很好的定殖能力，是一种具有工业化生产前景的菌株。

菌剂为Kpa菌株可湿性粉剂，它对烟草青枯病菌有很好的防治效果，能用于漂浮育苗基质处理，移栽期和成熟期。

利用Kpa菌株制备的Kpa菌株可湿性粉剂具有成本低、防效高、无残留、对人畜安全的特点，是烟草农业种植中防治青枯病菌的高效生物农药。

本发明为烟草农业生产中青枯病的防治提供了一种具有较好防治效果的生防微生物。

申请人：江西省烟草公司抚州市公司
地址：344000 江西省抚州市大桥南路金家山1号
国籍：CN
代理机构：江西省专利事务所
代理人：张文
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一种快速鉴定烟草品种青枯病抗性的方法[发明专利]

专利名称：一种快速鉴定烟草品种青枯病抗性的方法专利类型：发明专利
发明人：顾钢,徐进,冯洁,陈顺辉,许景升,张昊,周挺
申请号：CN201610001625.9
申请日：20160105
公开号：CN105557343A
公开日：
20160511
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种快速鉴定烟草品种青枯病抗性的方法，挑选在1/2？MS培养基上生长至4～6叶龄期，植株大小相近一致的无菌烟苗各10株，超净工作台内去除干净根系周围附着的MS培养基，以剪刀伤根后将植株根部于细菌悬浮液中浸泡30min后，灭菌滤纸吸干根部表面多余的菌液，重新栽回MS培养基内，灭菌水浸根作为对照，30℃、光照度2600lx、16h光周期条件培养，隔天观察记载发病病情，根据病情严重度计算病情指数。

申请人：中国烟草总公司福建省公司
地址：350003 福建省福州市北环中路133号
国籍：CN
代理机构：福州元创专利商标代理有限公司
代理人：蔡学俊
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【CN109852716A】一种烟草青枯病快速检测的方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910187801.6(22)申请日 2019.03.13(71)申请人河南省农业科学院烟草研究所地址 461000 河南省许昌市魏都区青梅路与永昌大道交叉口(72)发明人李小杰　李成军　李淑君　白静科　陈玉国　胡亚静　邱睿　张全民　何雷　孙喜坤　杨立均　许晓敬　(74)专利代理机构郑州意创知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 41138代理人韩晓莉(51)Int.Cl.C12Q 1/689(2018.01)C12Q 1/6858(2018.01)C12Q 1/04(2006.01)C12N 15/11(2006.01)C12R 1/01(2006.01)(54)发明名称一种烟草青枯病快速检测的方法(57)摘要本发明涉及一种烟草青枯病快速检测的方法，利用RAPD分子标记技术，以烟草青枯病菌、烟草野火病菌、多粘芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、节杆菌以及荧光假单胞菌和烟草栽培品种云烟87以及中烟100的基因组DNA为模板，筛选烟草青枯病菌的特异片段，将获得的特异片段进行测序分析，再根据特异片段序列设计特异引物，然后完成引物合成，并进行PCR反应，PCR反应体系参数要求为：1μL模板DNA、200μmol/LdNTP、1.5 nmol/L MgCl 2、0.1μmol/L引物、200μmol/L Ex -Taq DNA polymerase和1×PCRbuffer；PCR扩增条件为：95℃，5 min ；94℃，45 s ；退火温度40s；72℃，1min；30个循环；72℃，10 min，4℃保存，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

权利要求书2页说明书5页附图1页CN 109852716 A 2019.06.07C N 109852716A1.一种烟草青枯病快速检测的方法，其特征在于：1）：利用RAPD分子标记技术，以烟草青枯病菌、烟草野火病菌、多粘芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、节杆菌以及荧光假单胞菌和烟草栽培品种云烟87以及中烟100的基因组DNA为模板，筛选烟草青枯病菌的特异片段，将获得的特异片段进行测序分析，再根据特异片段序列设计特异引物，然后完成引物合成，并进行PCR反应，PCR反应体系参数要求为：1μL模板DNA、200μmol/LdNTP、1.5 nmol/L MgCl2、0.1 μmol/L引物、200μmol /L Ex-Taq DNA polymerase和1×PCRbuffer；PCR扩增条件为：95℃，5 min；94℃，45 s；退火温度 40s；72℃，1min；30个循环；72℃，10 min，4℃保存，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物；2）：青枯菌菌液最低检出浓度的测定将青枯菌置于28 ℃摇床上过夜培养，以1 mL OD600=1.0的细菌悬浮液中青枯菌数量为109个细菌的标准，梯度稀释细菌悬浮液，形成109 cfu/mL、108 cfu/mL、107 cfu/mL、106 cfu/mL、105 cfu/mL、104 cfu/mL、103 cfu/mL、102 cfu/mL以及10 cfu/mL梯度细菌悬浮液；同时以青枯菌基因组DNA为模板，模板浓度为42 ng/μL，并将模板进行10、102、103、104、105倍稀释，分别吸取1μL菌液或DNA为模板，利用筛选出的特异性引物进行PCR扩增，并进行电泳检测，PCR反应体系和程序如1）；土壤中青枯菌最低检出量的测定将青枯菌置于28℃摇床上过夜，以OD600=0.5的细菌悬浮液中青枯菌数量为3×108 cfu/mL的标准，梯度稀释到3×107cfu/mL、3×106cfu/mL、3×105cfu/mL、3×104cfu/ mL；分别吸取1ml菌液加入5g已灭菌的土壤中，过夜培养；称取0.2g土壤提取总DNA，稀释50倍作为模板，利用筛选出的特异引物进行PCR扩增；剩余部分加入45ml水摇床摇10分钟，混匀后静置，吸取1μL上清做模板进行PCR；PCR反应体系和程序如1）；3）采用伤根灌根法，每株烟苗灌菌悬液10 mL，设置3个重复，每个重复接种5株烟苗，以清水为对照处理，于接种后7d取样，利用特异引物扩增检测土壤和烟株体内青枯病菌的含量；利用RAPD分子标记技术，筛选出烟草青枯病菌的特异片段6个，测序结果表明，这6个片段分别代表不同的基因序列，其片段大小和靶基因名称如下：片段名称：A1，大小373bp，靶基因：DUF29 domain-containing protein；片段名称：A6，大小1140bp，靶基因：conserved exported protein of unknown function；片段名称：A7，大小1153bp，靶基因：sensor histidine kinase；片段名称：S6，大小240bp，靶基因：tRNA-Tyr；片段名称：S13，大小875bp，靶基因：putative aldehyde dehydrogenase protein；片段名称：S18，大小783bp，靶基因：Ribosome hibernation promoting factor；4）根据特异片段序列设计特异引物，共筛选出特异性扩增烟草青枯病菌的引物6对，6对引物分别为：引物名称A1，序列F：5' GAGCGAACAGCGGGAGTTG 3'，R：5' TCCCGACGCTGGACGCAAA 3'；PCR扩增退火温度：62，扩增片段长度：373 bp；引物名称A6，序列F：5' GCTGTTTCGTCTGCGTGGG 3'，R：5' GCGACCTCCAGAAACGAAA 3'；PCR扩增退火温度：60.4，扩增片段长度：1140bp；引物名称A7，序列F：5' ACCTGTTCCAGCAAGGCAT 3'，R：5' CGACAGATACGCGACAAATAAT 3'；PCR扩增退火温度：61.4，扩增片段长度：1153bp；引物名称S6，序列F：5' CTGCCCGTTAGGGCGTCT 3'，R：5' TTAGCCACTCGGGCACCT 3'；PCR扩增退火温度：54.6，扩增片段长度：240bp；引物名称S13，序列F：5' TCCTCCGCTTGTGACGCC 3'，R：5' CCCACTGCAAGTGATGCT 3'；PCR扩增退火温度：54.6，扩增片段长度：875bp；引物名称S18，序列F：5' TCCCAGCAGTGAATCTGCG 3'，R：5' GCAATGCGTGAAATGAGCG 3'；PCR扩增退火温度：58.9，扩增片段长度：783bp；利用筛选出的特异引物对，分别以烟草青枯病菌不同稀释度的菌液和基因组DNA为模板进行PCR扩增；对于基因组DNA，引物对A1F/R、A6F/R、A7F/R、S6F/R、S13F/R、S18F/R检测的灵敏度均达到105的稀释度，即0.42 pg/μL；对于青枯病菌菌液，引物对A1F/R、A6F/R、A7F/ R、S13F/R能检测到的最低浓度为105 cfu/mL，引物对S6F/R、S18F/R能检测到的最低浓度为106 cfu/mL；分别从每克土含菌量为1.2×107 cfu、1.2×106 cfu、1.2×105 cfu、1.2×104 cfu、1.2×103 cfu的土壤中提取总DNA，并以稀释50倍的DNA为模板进行特异引物的PCR扩增，利用特异引物对S13扩增检测的青枯菌最低含量为每克土含菌量为6×102cfu；对于土壤悬浮液，特异引物对S13检测的最低浓度为102稀释度，即3×106cfu/mL；其他5对特异引物的扩增结果与S13引物一致；5）接种青枯病菌后7d，分别取不同发病程度的烟株和根际土壤，利用特异引物进行PCR 扩增，接种的烟株根际土壤和发病较重的烟株中都能扩增出青枯病菌的特异条带，而健康和轻微发病的烟株中未检测出青枯病菌。

烟草青枯病拮抗芽孢杆菌的筛选、鉴定及其抑菌活性初探

烟草青枯病拮抗芽孢杆菌的筛选、鉴定及其抑菌活性初探刘伟;刘鹏;沈小英;安天赐;成巨龙;安德荣【摘要】[目的]从不同烟区健康烟草的根际土壤样品中筛选对烟草青枯病具有较强拮抗作用的芽孢杆菌,为防治烟草青枯病提供生防资源.[方法]随机从福建龙岩、四川德昌、陕西汉中等地健康烟草根际土壤中采集30份土壤样品,采用平板稀释法从中分离芽孢杆菌,以烟草青枯病菌为靶标菌筛选拮抗芽孢杆菌,并通过培养特性、菌体形态、生理生化特征分析及16S rDNA序列分析,对筛选的拮抗芽孢杆菌菌株进行鉴定;采用温室盆栽试验,测定拮抗芽孢杆菌的促生作用、定殖能力和抑菌活性.[结果]从健康烟草根际土壤中分离得到1株抗烟草青枯病菌活性较好的菌株LW-4,经鉴定其为甲基营养型芽孢杆菌Bacillus meth ylotrophicus.LW-4菌悬液对烟草青枯病菌的防治效果为70.37％,其可定殖于烟草根际土壤,具有良好的定殖能力.LW-4对烟草有明显的促生作用;用饱和度为25％的硫酸铵获得的LW-4抑菌物质对烟草青枯病菌的抑菌活性较高,抑菌圈直径达37.82 mm.[结论]菌株LW-4在烟草青枯病防治中具有潜在的利用价值.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(042)002【总页数】8页(P123-130)【关键词】烟草青枯病;拮抗芽孢杆菌;定殖能力;促生作用;防治效果【作者】刘伟;刘鹏;沈小英;安天赐;成巨龙;安德荣【作者单位】西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;吉林农业大学农学院,吉林长春130118;西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;中国烟草总公司陕西省烟草研究所,陕西西安710061;西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S435.72烟草青枯病是由青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种土传病害[1]。

1株烟草青枯病生防细菌的分离与鉴定

1株烟草青枯病生防细菌的分离与鉴定
陈亮;周晓见;董昆明;董夏伟;缪莉
【期刊名称】《江苏农业科学》
【年(卷),期】2012(40)1
【摘要】采用系列稀释法和平板涂布法从黔江烟区土壤中分离得到细菌菌株87株,经平板对峙法初筛得到1株对烟草青枯病病原菌有强烈拮抗作用的细菌,再通过滤纸片法验证其提取物对烟草青枯病病原菌有强烈的抑制作用,对该菌株进行全细胞脂肪酸分析,初步判断该菌为芽孢杆菌.16S rDNA分析结果表明,该菌为解淀粉芽孢杆菌.
【总页数】4页(P104-107)
【作者】陈亮;周晓见;董昆明;董夏伟;缪莉
【作者单位】扬州大学环境科学与工程学院,江苏扬州225127;扬州大学环境科学与工程学院,江苏扬州225127;扬州大学环境科学与工程学院,江苏扬州225127;扬州大学环境科学与工程学院,江苏扬州225127;扬州大学环境科学与工程学院,江苏扬州225127
【正文语种】中文
【中图分类】S435.72
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生物灾害科学2012,35(2):153－156Biological Disaster Science,V ol.35,No.2,2012swzhkx@收稿日期：2012-04-22基金项目：江西省烟草专卖局（公司）资助项目（201001021）作者简介：崔朝宇，男，硕士生，研究向为分子植物病理学。

E-mail ：cuichaoyu1991@ ；*通信作者：蒋军喜，男，教授，博士，主要从事植物病害综合治理研究。

E-mail ：jxjiang64115@ 。

DOI ：10.3969/j.issn.2095-3704.2012.02.006烟草青枯病菌分离株RSXJ-1的培养性状及其生物型鉴定崔朝宇1，张超群2，周泽科1，蒋军喜1*（1.江西农业大学农学院，江西南昌330045；2.江西烟叶科学研究所，江西南昌330025）摘要：从江西省峡江县烟区采集呈典型症状的青枯病烟株，采用平板梯度稀释分离法分离获得一株病原菌分离株，命名为RSXJ-1。

在完成致病性测定的基础上，通过分子生物学方法将该菌株鉴定为茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)。

本文研究了该菌株在不同培养基上的培养性状，结果表明该菌株的培养性状与R.solanacearum 的培养性状相一致；对该菌株进一步进行生物型研究，结果显示该菌株能利用乳糖、麦芽糖、纤维二糖、甘露醇和山梨醇氧化产酸并能还原硝酸盐;而不能利用甜醇氧化产酸，据此将该菌株鉴定为生物型Ⅲ-1。

关键词：烟草青枯病菌；培养性状；生物型中图分类号：S435.72文献标志码：A文章编号：2095－3704（2012）02－0153－04Cultural Characteristics and Biotype Identification of Isolate RSXJ -1ofRalstonia solanacearumCUI Chao-yu 1,ZHANG Chao-qun 2,ZHOU Ze-ke 1,JIANG Jun-xi 1*（1.College of Agronomy,Jiangxi Agricultural University ,Nanchang 330045,China;2.Jiangxi T obacco Science Research Institute,Nanchang 330025,China ）Abstra ct ：A tobacco plant with typical symptoms of bacterial wilt was collected from Xiajiang county of Jiangxi province.A bacterial isolate was obtained from the plant using gradient dilution isolation method,ant it was named RSXJ-1.With completion of its pathogenicity test,the isolate was identified molecularly as Ralstonia solana cearum.This paper investigated the cultural characteristics of the bacterial isolate on different media.The results showed that cultural characteristics of the bacterial isolate were consistent with the cultural characteristics of R.solana cearum.Experiment of biotype identification of the isolate was also conducted.The results showed that the isolate had the ability of both oxdizing lactose,maltose,cellobiose,mannitol,and sorbitol to produce acid and reducing nitrate.However,it had no ability of oxdizing dulcitol to produce acid.According to the results,the isolate was identified as biotype Ⅲ-1of R.solanacearum.Key wor ds ：Ralstonia solanacea rum;cultural characteristics;biotype 烟草是江西省峡江县重要的经济作物，在该县广大乡镇有大面积种植，并带来可观的经济效益，然而在烟草种植过程中，各种病害时有发生，其中烟草青枯病就是严重危害烟草种植的病害之一。

烟草青枯病是由茄科劳尔氏菌(Ralstonia sola nacea rum)引起的细菌性病害，青枯病菌分布广，154生物灾害科学第35卷第2期其菌株间有明显的变异和分化现象。

病原菌在自然界中寄主范围十分广泛，包括茄科、豆科、蓼科等30余科200多种植物，其中烟草、番茄、花生及马铃薯等受害最重[1-2]。

迄今，茄科劳尔氏菌已鉴别出5个小种及5个生物型，其中侵染烟草的菌株为小种1和生物型Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ[3-4]。

由于烟草青枯病在烟草种植过程中造成严重的危害，对于烟草青枯病的研究也比较完善，其中重庆、湖南、安徽和福建等地烟草青枯病菌生物型及生理小种研究均有报道；王晓丹，林抗美等[5]对青枯病菌在不同寄主上的生物型也有详尽研究，而在江西烟区尚无烟草青枯病菌生物型系统研究的报道。

本文从江西省峡江烟区采集分离得到一株烟草青枯病菌分离株，命名为RSXJ-1，在完成致病性测定的基础上对菌株在不同培养基上培养性状进行研究；通过测定该菌株对3种多糖和3种己醇的利用情况以及硝酸盐还原情况，对该菌株进行生物型鉴定。

现将结果报道如下：1材料与方法1.1培养基及试剂1.1.1培养基(1)NA 液体培养基：蛋白胨10g ，牛肉膏5g ，NaCl 5g ，蒸馏水1000mL ，pH 7.2-7.4。

(2)NA 固体培养基：蛋白胨10g ，牛肉膏5g ，NaCl 5g ，琼脂15g ，蒸馏水1000mL ，pH 7.2-7.4。

(3)生物型测定的基本培养基：NH 4H 2PO 41g,KCl 0.2g,MgSO 47H 21.1.2试剂格里斯氏试剂，A 液：对氨基苯磺酸0.5g ，稀醋酸（10%左右）；B 液：α-萘胺0.1g ，蒸馏水20mL ，稀醋酸（10%左右）150mL 。

1.2样品采集O 0.2g,酵母浸膏1g ，琼脂20g ，1%溴百里酚蓝水溶液6mL ，蒸馏水1000mL ，pH 7.2。

(4)硝酸盐培养基：蛋白胨10g ，硝酸钾1g ，蒸馏水1000mL ，琼脂3g ，pH 7.2。

2011年7月从江西省峡江县马埠镇烟田采集呈典型症状的烟草青枯病烟株，预处理后，样品置于4℃保存备用。

1.3病原菌分离培养及菌种保存感病烟株茎部用70%的酒精棉球擦拭消毒处理后，在无菌条件下用灭菌的解剖刀切开茎部，切取小块呈褐色的感病维管束组织放入无菌水中，捣碎，静置10min ，利用培养皿梯度稀释法于NA 培养基上分离。

30℃培养48h ，待平板上长出菌落后，用灭菌接种环挑取白色流动性菌落移至NA 斜面培养基上。

30℃培养48h 后用无菌水冲洗斜面菌落，菌种保存于无菌水中，置于4℃保存备用[6]采用叶腋针刺接种方法接种,将健康的K326烟草种子播种于消毒盆土中，每盆1株，置于25℃光照培养箱中培养一段时间后，采用针刺方法从烟苗叶片（从上至下第3片完全展开叶）叶腋处刺入茎内维管束，然后在伤口处用浓度为10。

1.4致病性测定8在无菌条件下从培养皿上挑取单菌落分别移植于NA 平板、NA 斜面、NA 液体培养基中，置于30℃条件下培养48h ，观察菌株在各条件下的培养特征。

cfu /mL 的菌液处理，并设3次重复，另设灌注无菌水作对照，用消毒脱脂棉球沾菌液保湿48h ，于30℃温室内保湿诱导发病，并定期观察发病情况。

1.5形态特征观察1.6生物型测定1.6.1菌株对糖和醇的利用将乳糖、麦芽糖、纤维二糖、甘露醇、山梨醇和甜醇均配成10%溶液，灭菌后分别加入基本培养基中，最终浓度为1%，3种双糖用过滤法灭菌，3种己醇经115℃蒸汽灭菌10min ，将待测的菌株分别移植于含不同碳水化合物的6种生物型测定培养基上，在28~30℃的恒温培养箱中分别培养5d 、7d 和10d 时调查，根据各处理菌株生长情况，确定菌株对3种糖和3种醇的利用能力。

1.6.2菌株的硝酸盐还原每支试管分装5mL 含0.1%的硝酸盐培养基，高压灭菌，每个菌株针刺接种2管，分别在3d 、5d 、7d 时用格里斯氏试剂测定，每管加试剂A 和B 各1mL 。

若呈红色，表明有亚硝酸根产生。

1.6.3根据Harward [7]和何礼远[8]2结果与分析2.1病原菌分离制定的标准（表1）确定菌株的生物型病原菌分离采用培养皿梯度稀释分离法，在第四皿中长出单菌落，菌落形态一致，无杂菌污染(见图1)。

2012年第2期崔朝宇等：烟草青枯病菌峡江分离株RSXJ-1的培养性状及其生物型鉴定155表1青枯劳尔氏菌生化型划分标准(Hayward,1964;何礼远,1983)生化型乳糖麦芽糖纤维二糖甘露醇山梨醇甜醇硝酸盐还原生化型Ⅰ------+生化型Ⅱ+++---+生化型Ⅲ+++++++生化型Ⅳ---++++生化型Ⅴ++++--+注：“+”为可产酸或可还原硝酸盐，“-”为不产酸或不能还原硝酸盐1：第一皿2：第二皿3：第三皿4:第四皿图1烟草青枯病菌峡江分离株RSXJ-1平板稀释分离图2.2致病性测定将RSXJ-1配成浓度为108 2.3病原菌形态观察cfu/mL的菌液采用叶腋针刺方法分别接种健康烟苗，烟苗均出现萎蔫青枯症状，茎上有明显的褪绿条斑；最后整株死亡，而用无菌水作为对照的烟苗则生长正常。

说明分离到的RSXJ-1有致病性。

2.3.1NA平板上形态菌落圆形，直径1.8~2㎜乳白色，有光泽，表面凸起，边缘整齐，质地粘质、半透明，无特殊气味，培养基颜色无明显变化。

2.3.2NA斜面上形态菌苔线形，表面光滑，乳白色，质地粘质，半透明，表面发亮，无特殊气味。

2.3.3NA液体培养基上形态在培养液中生长迅速，过夜培养即变浑浊，无菌环及菌膜形成，不形成团状的漂浮物，形成云雾状菌团，培养液底部无沉积物，培养液无特殊气味。